A magyarországi tuberkulózis helyzet a hagyományos és a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok tükrében. Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei

Átírás

1 A magyarországi tuberkulózis helyzet a hagyományos és a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok tükrében Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Mester Judit Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Témavezeto: Dr. Somoskövi Ákos Ph.D. Budapest, 2004

2 1. Bevezetés: Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) adatai szerint a tuberkulózis évente világszerte mintegy 8 millió megbetegedést és 2 millió halálesetet okoz. E megdöbbento adatok hatására a WHO 1993-ban a tuberkulózist világméretu fenyegetésnek nyilvánította. Magyarország tuberkulózis mortalitási adatai óta ismertek, a megbetegedések számát a XX. század közepe óta regisztrálják. A XX. század elején Magyarországon a legnagyobb népegészségügyi kihívást a tuberkulózis jelentette. A II. Világháborút követoen egészen napjainkig a megbetegedések száma folyamatosan csökkent, ezt csak és között szakította meg átmeneti emelkedés. A megbetegedések jellegzetességeit regisztráló egyéni központi számítógépes nyilvántartási-követési rendszert (surveillance) 1996-ban vezették be országosan. A tuberkulózis diagnózisának felállításához mind klinikai, mind epidemiológia i szempontból követelmény a betegség kórokozójának (Mycobacterium tuberculosis komplex - MTBC) izolálása, identifikálása és gyógyszer-érzékenységének meghatározása a leheto legrövidebb ido alatt. A hagyományos módszerekkel végzett vizsgálatok néhány hetes idotartamát korszeru (közöttük molekuláris) módszerek alkalmazásával jelentosen meg lehet rövidíteni. 2. Célkituzések: A magyarországi tuberkulózis epidemiológiai és gyógyszerrezisztencia helyzet elso országos elemzése és értékelése a Nemzeti 2

3 Tuberkulózis Surveillance Központ 2000., és évi adatai alapján Az automatizált BACTEC MGIT 960 folyékony táptalaj alapú rendszer bevezetése és hatékonyságának értékelése a M. tuberculosis gyorsított izolálására A BACTEC MGIT 960 rendszer és a különbözo molekuláris módszerek kombinációjának értékelése és rutin diagnosztikai alkalmazása gyors izolálás és identifikálás céljából A BACTEC MGIT 960 rendszer és a molekuláris módszerek kombinált használata gyors RMP-rezisztencia meghatározásra A kelet-magyarországi rifampicin-rezisztencia helyzet felmérése és molekuláris biológiai módszerek bevezetése a rifampicin-rezisztens M. tuberculosis izolátumokból a rifampicinrezisztenciával összefüggésbe hozható rpob génen jelenlévo különbözo mutációtípusok gyakoriságának meghatározására 3. Módszerek: A tuberkulózis epidemiológiai és gyógyszer-rezisztencia helyzete a Nemzeti Tuberkulózis Surveillance Központ (NTSK) 2000., és évi adatai alapján: A NTSK központi számítógépes adatbázisában rögzítik a tuberkulózis miatt a tüdogondozókban nyilvántartásba vett betegek egyéni adatait ( bejelentés ) valamint a gyógykezelés eseményeit bakteriológiai vizsgálatok eredménye, alkalmazott gyógykezelés, stb. ( követés ). Tuberkulózis diagnózissal három egymást követo évben (2000., és 2002.) nyilvántartásba vett betegek adatai retrospektív vizsgálattal kerültek feldolgozásra és elemzésre. 3

4 Ezekbol következtések vonhatóak le egyrészt a tuberkulózis elleni program minoségére (pl. a diagnózis megalapozottságára, az alkalmazott kezelés adekvát voltára), másrészt a járvány jellegzetességeire (pl. a gyógyszer-rezisztens tuberkulózis mértékére) vonatkozóan A MTBC és más mycobacterium törzsek molekuláris módszerekkel való identifikálása és a MTBC izolátumokból a rifampicin-rezisztencia meghatározása a BACTEC MGIT 960 rendszerrel történt gyorsított tenyésztést követoen: , , Klinikai minták feldolgozása különbözo módszerekkel novembere és áprilisa között 1585 klinikai minta került feldolgozásra (Wadsworth Center, New York State Dept. of Health klinikai mycobacteriologiai laboratóriuma, Albany, NY, USA). Ismertetjük az alkalmazott módszereket (tenyészetek leoltása és inkubációja, rutin diagnosztikai eljárások, pl. leoltás folyékony és szilárd táptalajokra, gyógyszerérzékenységi vizsgálatok valamint identifikálás a BACTEC MGIT 960 tenyészetbol TB AccuProbe teszttel) Line Probe Assay (LiPA) teszt A LiPA teszt olyan molekuláris biológiai (amplifikációs) módszer, amely alkalmas a különbözo mycobacteriumok elkülönítésére, valamint a RMP-érzékenység meghatározására. A LiPA rendszer RMP-érzékenységi vizsgálat specificitásának és szenzitivitásának meghatározására 101 MTBC törzset és 21 NTM 4

5 törzset vizsgáltunk. Az eredményeket agar alapú proporciós módszerrel erosítettük meg DNS szekvenálás az rpob génen A TB AccuProbe és a LiPA teszt eredményeinek a megerosítésére mindegyik izolátumból különbözo primerekkel egy 329-bp terméket állítottunk elo és szekvencia -analízist végeztünk. Ismertetésre kerülnek azok a módszerek, amelyeket a RMPrezisztenciához kapcsolódó mutációk detektálásának és identifikálásának megerosítése céljából, illetve a NTM-k kimutatása céljából történtek. RMP-rezisztens törzseken kétféle primerrel amplifikációt és DNS szekvenálást végeztünk az N-terminális régióban található mutáció kimutatására Kontrollok és statisztikai módszer A kontroll gyógyszerérzékenységi vizsgálat és a molekuláris tesztek a M. tuberculosis H37Ra ATCC törzsének felhasználásával történtek. Negatív kontroll: a PCR tesztben desztillált víz, a TB AccuProbe tesztben NTM törzsek voltak. A molekuláris módszerek érzékenységbeli különbségeinek a meghatározására chi-négyzet tesztet használtuk A Magyarországról származó M. tuberculosis izolátumok rifampicin- rezisztenc iájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és a LiPA teszt segítségével: A legmagasabb incidenciájú kelet-magyarországi területekrol származó 29 RMP-rezisztens törzset izoláltunk 1999-ben. Kontrollként egy H37Rv referencia törzset és hat olyan M. tuberculosis izolátumot használtunk, amelyek mind a négy 5

6 elsovonalbeli antituberkulotikumra érzékenyek voltak. A vizsgált törzsek gyógyszerérzékenységét Canetti-féle proporciós módszerrel, valamint molekuláris módszerekkel (RMP-rezisztenciával összefüggo rpob régiók amplifikálása PCR-rel, az amplifikált DNS szakasz bázissorrendjének meghatározása szekvenálással, LiPA teszt). 4. Eredmények: A magyarországi tuberkulózis epidemiológiai és gyógyszer-rezisztencia helyzet a Nemzeti Tuberkulózis Surveillance Központ (NTSK) 2000., és évi adatai alapján: A tuberkulózis incidencia a vizsgált három évben folyamatosan csökkent (36/ rol 30/ re). Ismertetésre kerülnek a megbetegedések jellemzoi (kor, nem, szervi lokalizáció, rizikótényezok, a diagnózis megerosítése bakteriológiai vizsgálattal, a gyógyszerérzékenységi vizsgálatok eredménye) (1, 2 táblázat). Ismertetjük az országon belüli területi különbségeket. Bemutatjuk, hogy a kezelés megkezdésekor alkalmazott gyógyszerkombináció csak az esetek mintegy egyharmadában felelt meg a hazai és a nemzetközi ajánlásoknak (3. táblázat). 6

7 1. táblázat. Tuberkulózis incidencia abszolút számban, lakosra számítva (% ooo ), a korábban nem kezelt és korábban kezelt esetek megoszlása (%), a bakteriológiailag igazolt esetek száma és az összincidenciához viszonyított %-os aránya, 2000., 2001., Tuberkulózis incidencia Korábban nem 3026 (30) kezelt esetek száma /84/ (% ooo ) /%/ Korábban kezelt 572 (5,7) esetek száma (% ooo ) /16/ /%/ Együtt (% ooo ) /%/ 3598 (35,6) /100/ A bakteriológiailag igazolt esetek száma és aránya /%/ (18,4) /84,7/ 592 (5,8) /18,4/ 3220 (32,9) /100/ 2504 (24,8) /82,9/ 503 (4,98) /17/ 3007 (29,8) /100/ Korábban nem 1181 /39/ 1064 /39/ 966 /38,5/ kezelt esetek száma Korábban kezelt 248 /43,3/ 232 /39/ 216 /43/ esetek száma Együtt 1429 /39,7/ 1296/40,2/ 1182/39,3/ A bakteriológiailag igazolt incidencia az összincidencia % - ában 39,7 40,2 39,3 7

8 2. táblázat. Kezdeti gyógyszer-rezisztencia az egyes gyógyszerekre, 2000, 2001, Rezisztens Rezisztencia vizsgálatok száma (%)* n (%)** Bármelyik szerre INH RMP EMB SM MDR*** 2000 Korábban nem kezelt 801 (67,8) 86 (10,7) 61 (7,6) 15 (1,9) 16 (2,0) 44 (5,5) 12 (1,5) Korábban kezelt 162 (65,3) 38 (23,5) 27 (16,6) 10 (6,1) 10 (6,1) 20 (12,3) 8 (4,9) Együtt 963 (67,4) 124 (12,9) 88 (9,1) 25 (2,6) 26 (2,7) 64 (6,6) 20 (2,1) 2001 Korábban nem kezelt 719 (67,5) 81 (11,2) 50 (6,9) 13 (1,8) 14 (1,9) 46 (6,3) 11 (1,5) Korábban kezelt 159 (68,5) 33 (20,7) 27 (16,9) 13 (8,1) 10 (6,2) 12 (7,5) 13 (8,1) Együtt 878 (67,7) 114 (12,9) 77 (8,7) 26 (2,9) 24 (2,7) 58 (6,6) 24 (2,7) 2002 Korábban nem kezelt 678 (74,0) 87 (12,8) 52 (7,6) 18 (2,6) 17 (2,5) 48 (7,1) 13 (1,9) Korábban kezelt 123 (58,8) 31 (25,2) 20 (16,2) 9 (7,3) 9 (7,3) 19 (15,5) 8 (6,5) Együtt 801 (71,2) 118 (14,7) 72 (8,9) 27 (3,4) 26 (3,2) 67 (8,4) 21 (2,6) a bakteriológiailag igazolt esetekhez viszonyítva ** a rezisztenciavizsgálatok számához viszonyítva *** az INH- és RMP -rezisztens esetek száma tartalmazza az MDR eseteket is 8

9 3. táblázat. Kezdeti gyógyszerkombinációk, 2000., 2001., Gyógyszerek száma 0 vagy Ismeretlen Összesen 2000 Korábban nem kezelt 132 (0) [4,3%] Korábban kezelt 18 (0) [3,1%] Együtt 150 (0) [4,1%] (183) [13,9%] 80 (37) [13,9%] 501 (220) [13,9%] 1367 (1104) [45,1%] 256 (201) [44,7%] 1623 (1305) [45,1%] 948 (922) [31,3] 194 (184) [33,7%] 1142 (1106) [31,7%] 34 (34) [1,1%] 10 (10) [1,7%] 44 (44) [1,2%] 124 [4,0%] 14 [2,4%] 138 [3,8%] Korábban nem kezelt 112 (0) [4,1%] Korábban kezelt 33 (0) [5,5%] Együtt 145 (0) [4,3%] (173) [14,3%] 76 (32) [12,8%] 468 (205) [14,0%] 1298 (1093) [47,5%] 264 (205) [44,5%] 1562 (1298) [47,0%] 844 (830) [30,9%] 198 (191) [33,4%] 1042 (1021) [31,3%] 28 (28) [1,0%] 9 (9) [1,5%] 37 (37) [1,1%] 54 [1,9%] 12 [2,0%] 66 [1,9%] Korábban nem kezelt 150 (0) 357 (143) 1126 (972) 790 (777) [5,9%] [14,2%] [44,9%] [31,5%] Korábban kezelt 35 (185) 83 (38) 210 (174) 160 (158) [6,9%] [16,5%] [41,7%] [31,8%] Együtt 185 (0) 440 (181) 1336 (1146) 950 (935) [6,1%] [14,6%] [44,4] [31,5%] zárójelben ( ) azoknak az eseteknek a száma, akiknek a kombinációja INH-t és RMP-t is tartalmazott 25 (25) [0,9%] 4 (4) [0,7%] 29 (29) [0,9%] 56 [2,2%] 11 [2,1%] 67 [2,2%]

10 4. 2. A Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) és más mycobacterium törzsek identifikálása molekuláris módszerekkel és a MTBC izolátumokból RMP-rezisztencia meghatározása a BACTEC MGIT 960 rendszerrel történt gyorsított tenyésztést követoen: Vizsgáltuk a három mycobacteriologiai identifikáló módszer (TB AccuProbe, LiPA teszt, rpob szekvenálás) jellegzetességeit (4. táblázat). A különbözo mycobacteriumok molekuláris módszerekkel történo izolálásának idotartamát vizsgálva azt találtuk, hogy az alkalmazott módszerekkel a legrövidebb ido alatt a MTBC izolálható. Ezen belül rövidebb a mikroszkóposan pozitív mintákból történo kimutatás ideje, ugyanez áll a BACTEC RMPgyógyszerérzékenységi vizsgálat idotartamára is (5. táblázat).

11 4. táblázat. A mycobacteriologiai identifikáló módszerek jellegzetességei. TB AccuProbe LiPA rpob szekvenálás Identifikálás M. tuberculosis komplex M. tuberculosis komplex Minden Mycobacteriu m species RMP - rezisztencia detektálása Detektáláshoz szükséges idotartam Nem 24 órán belül Csak a négy leggyakoribb mutációtípuso kat (a többit csak indirekten) 24 órán belül Minden mutációtípust 4-5 napon belül (a helyi molekuláris labor segítségével) Laborkivitelezés Könnyu Eszköz- és munkaigényes Eszköz- és munkaigényes Felszerelés Standardizálás folyékony táptalajon Hoblokkok, ultrahangos feltáró, luminométer centrifuga Nem standardizált készítmény Programozható hoblokk, vízfürdo, gélelektroforézis rendszer Standardizált Programozható hoblokk, gélelektroforézis rendszer, automatizált szekvenáló Saját összeállítású Minoségellenorzo kit Igen Igen Nem 11

12 5. táblázat. A három mycobacteriologiai identifikáló módszer jellegzetességei. BACTEC MGIT 960 tenyésztés Napok száma (min.-max.) BACTEC 460 BACTEC RMP - TB gyógyszerérzékenységi tenyésztés vizsgálat Mikroszkóp + n = 57 10,5 (4-35) 10,1 (3-37) 13,5 (8-29) M. tuberculosis Mikroszkóp n = 13 15,0 (6-27) 17,4 (11-22) 22,4 (15-30) komplex (MTBC) Együtt n = 70 11,3 (4-35) 11,4 (3-37) 14,7 (8-30) Mikroszkóp + n = 6 5,8 (4-10) 5,8 (4-8) NK M. avium Mikroszkóp n = 7 18,6 (11-38) 13,7 (9-20) NK komplex (MAC) Együtt n = 13 12,7 (4-38) 10,1 (4-20) NK Mikroszkóp + n = 5 12,8 (2-39) 10,8 ( 3-21) NK NTM Mikroszkóp - n = 16 23,4 (5-55) 24,1 (3-52) NK Együtt n = 21 20,9 (2-55) 20,9 (3-52) NK NK = nem kivitelezheto, NTM= nem tubekulózist okozó mycobactérium

13 4. 3. A Magyarországról származó M. tuberculosis izolátumok rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és a LiPA teszt segítségével: A vizsgált 29 RMP-rezisztens izolátumból 2 törzs csak RMP-re, 26 törzs INH-ra is rezisztens volt (multirezisztencia MDR), 20 izolátum legalább 3 elsovonalbeli gyógyszerre rezisztens volt. A különbözo mutációk elofordulási gyakorisága eltért a korábban közöltektol ismertetjük a talált mutációkat és leírjuk, hogy egy olyan kettos mutációt (S509D és D516V) és egy olyan deléciót ( ) találtunk, amelyek eddig nem szerepeltek az irodalomban. Ismertetjük a LiPA teszt alkalmazhatóságának korlátait. 5. Megbeszélés: A magyarországi tuberkulózis epidemiológiai és gyógyszer-rezisztencia helyzet a Nemzeti Tuberkulózis Surveillance Központ (NTSK) 2000., és évi adatai alapján: Ismertetésre kerülnek az incidencia és közötti átmeneti emelkedésének lehetséges okai (a társadalmi-gazdasági helyzet változásával összefüggo létbizonytalanság, munkanélküliség, hajléktalanság, tömeges belso migráció, a magasabb tuberkulózis prevalenciájú környezo országokból történt legális és illegális bevándorlás), a rizikótényezokbol következo teendok. Tárgyaljuk az incidencia összetételének kedvezotlen jellegzetességeit (az ismételt megbetegedések magas, a bakteriológiailag igazolt esetek alacsony aránya), ezek lehetséges okait és a korrekció lehetoségét.

14 Foglalkozunk a gyógyszer-rezisztencia helyzettel, ezen belül is a MDR-val, a rezisztencia teljes köru meghatározásának szükségességével. Elemzésre kerül a gyógykezelés színvonala, ennek és egyes kedvezotlen jelenségeknek a lehetséges kapcsolata és az ellenorzött kezelés kérdése A MTBC és más mycobacterium törzsek identifikálása molekuláris módszerekkel és a MTBC izolátumokból rifampicinrezisztencia meghatározása a BACTEC MGIT 960 rendszerrel történt gyorsított tenyésztést követoen: A vizsgált LiPA teszt alkalmazásával átlagosan 2 hétnél rövidebb ido alatt elvégezheto a MTBC identifikálása és a RMPrezisztencia meghatározása a BACTEC MGIT 960 rendszerben kimutatott pozitív mintákból. A LiPA teszt segítségével kevert (MTBC és MAC) tenyészetekbol ki lehetett mutatni a MTBC-t, és a hagyományos módszereknél jelentosen rövidebb ido alatt meg lehetett határozni a törzsek RMP-rezisztenciáját. Az rpob szekvenálással identifikálni lehetett a NTM törzseket és sikerült kimutatni a RMP-rezisztens MTBC összes mutációját A Magyarországról származó M. tuberculosis izolátumok rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és a LiPA teszt segítségével: A Kelet-Magyarországról származó mintákban a szokásostól eltéro mutációjú RMP-rezisztens izolátumokat találtunk. Ez arra utal, hogy egyes területeken a molekuláris vizsgálatok eredményeit a hagyományos módszerekkel is meg kell erosíteni,és a DNS szekvenálást a nem szokványos DNS régiókra is ki kell terjeszteni. 14

15 6. Összefoglalás és záró következtetések: A tuberkulózis elleni program fo célkituzése a járvány visszaszorítása, a fertozés átvitelének megakadályozása, a beteg felkutatása és eredményes gyógyítása útján. A járvány természetének jobb megismerését az 1996-tól bevezetett egyéni, központi számítógépes nyilvántartási-követési rendszer (surveillance) tette lehetové. A betegfelkutatást a magas rizikójú csoportokra kell koncentrálni, és törekedni kell a diagnózis bakteriológiai vizsgálatokkal történo alátámasztására. A korábban kezelt esetek és ezen belül a gyógyszer-rezisztens esetek számának csökkentése érdekében az alkalmazott gyógykezelésnek meg kell felelnie az ajánlásoknak, valamint szükséges teljes köruvé tenni az ellenorzött kezelést. A bakteriológiai diagnosztika színvonalának biztosítása érdekében általánossá kell tenni a laboratóriumok belso és külso minoségbiztosítását. A kezelés megkezdése elott teljes körben el kell végezni a gyógyszerérzékenységi vizsgálatokat, ennek meg kell teremteni a feltételeit. Az anyagi, technikai és személyi feltételek függvényében - legalább a járvány által leginkább sújtott területeken - szükséges lenne bevezetni a korszeru bakteriológiai módszereket, közöttük molekuláris eljárásokat, melyek segítségével javítani lehet a diagnózisok megalapozottságát és meg lehet rövidíteni a vizsgálatok idejét. 7. Az értekezés témájában megjelent közlemények: 15

16 I. Mester J., Vadász I. A Mycobacterium tuberculosis DNS restrikciósfragmenshossz polimorfizmusa elemzésének gyakorlati alkalmazása. Lege Artis Medicinae 1999; 9: II. Mester J., Fodor T., Vadász I. Gyógyszerrezisztens tuberculosis Medicina Thoracalis. 2001; 54: III. Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön Cs., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L. M, Salfinger M. Molecular characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the line probe assay. J Clin Microbiol 2001; 39: IF: 3, 965 IV. Mester J., Vadász I., Pataki G., Parsons L. M., Fodor T., Salfinger M., Somoskövi Á. Analysis of the Year 2000 Tuberculosis surveillance in Hungary. Int J Tuberc Lung Dis Nov 2002; Vol 6, No11: IF: 1, 88 V. Bártfai Z., Somoskövi Á., Ködmön Cs., Szabó N., Puskás E., Kosztolányi L., Faragó E., Mester J., Parsons L. M, Salfinger M. Magyarországról származó Mycobacterium tuberculosis izolátumok rifampicin-rezisztenciájának molekuláris elemzése DNS szekvenálással és Line Probe Assay segítségével. Medicina Thoracalis. 2002; 55:83-88 VI. Mester J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön Cs., Somoskövi Á. A Myobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis. 2002; 55: 3-9. VII. Somoskövi Á., Mester J., Hale Y. M., Parsons L. M., Salfinger M. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Clinics in Chest Medicine 2002; Vol 23, Issue 3: IF: 2, 026 VIII. Mester J., Fodor T., Vadász I. Magyarországi tuberkulózis gyógyszerrezisztencia helyzet 2001-ben. Medicina Thoracalis 2003; 56:53-57 IX. Somoskövi Á., Song Q., Mester J., Tanner C., Hale Y. M., Parsons L. M., Salfinger M. Use of Molecular Methods to Identify the Mycobacterium tuberculosis complex and other Mycobacterial species, and to Detect Rifampin Resistance in TB Following Growth Detection in the BACTEC MGIT 960 System. J Clin Microbiol 2003; 41: IF: 3, 565 X. Mester J., Vadász I., Fodor T., Pataki G., Somoskövi Á. A tuberkulózis helyzet Magyarországon. Orvostovábbképzo szemle 2003; 10 (5):

17 8. Köszönetnyilvánítás: Hálásan köszönöm dr. Ajkay Zoltánnak, hogy támogatott a külföldi ösztöndíj adta lehetoségben és köszönöm mindenkori biztatását munkámmal kapcsolatosan. Köszönettel tartozom témavezetomnek, dr. Somoskövi Ákosnak, aki a Wadsworth Center laboratóriumában (New York State Department of Health, Albany, NY, USA) és itthon is bármikor a segítségemre volt, hasznos tanácsaival jelentosen segített e munka elkészítésében. Hálásan köszönöm Dr. Fodor Tamás foorvos úrnak, a Nemzeti Referencia Labor vezetojének támogatását és hasznos tapasztalati tanácsait. Köszönöm az OKTPI-bol minden munkatársamnak a türelmét és baráti biztatását, amire idonként nagy szükség volt az osztályos munka mellett írott értekezés elkészítésénél. Köszönöm dr. Bártfai Zoltánnak az értekezés tudományos és adminisztratív intéznivalói terén nyújtott baráti segítségét. Hálásan köszönöm dr. Pataki Géza és Péterfiné Togyei Mária segítségét, akik az NTSK adatait bármikor biztosították számomra. Köszönettel tartozom Dávid Sándornak, aki az OKTPI laboratóriumában készségesen segített az adatok és a tenyészetek felkutatásában. További köszönet amerikai kollegáimnak, Dr. Linda M. Parsonsnak és Dr. Max Salfingernek, akik igyekeztek bevezetni a klinikai laboratóriumi munka rejtelmeibe és mindig segítettek, ha problémám akadt. Végül, de nem utolsósorban köszönöm a családomnak a folyamatos segítséget, biztatást és szeretetet, amely nagymértékben hozzájárult az értekezés elkészítéséhez. 17