Metabolikus adaptációs folyamatok perikardiális aktivációja: az endothelin-1 hatása

Átírás

1 Metabolikus adaptációs folyamatok perikardiális aktivációja: az endothelin-1 hatása DR. ZIMA ENDRE Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, 2005 Tudományági Doktori Iskola: 1. Elméleti Orvostudományok Doktori Program: 1/1. Szív- és érrendszeri betegségek élettana és klinikuma Témavezető: Dr. Kékesi Violetta PhD.

2 Tartalomjegyzék Összefoglalás 4 Abstract 6 Rövidítésjegyzék 8 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés Adenin nukleozidok Az adenin nukleozidok képződése és lebomlása Az adenin nukleozidok miokardiális transzportja Adenozin receptorok és az adenozin hatásai Az adenin nukleozidok, mint a metabolikus éradaptáció transzmitterei A perikardiális folyadék szerepe a szívműködésben A perikardiális adenin nukleozidok vizsgálata Endothelinek Az endothelin szintézise Endothelin receptorok, az endothelinek hatása Nitrogén monoxid A nitrogén monoxid szintézise A nitrogén monoxid vazodilatátor hatásának mechanizmusa A nitrogén monoxid nem-vaszkuláris hatásai Nitrogén monoxid szintetáz gátlás Célkitűzések Anyag és módszer Általános kísérleti protokoll Részletes kísérleti protokoll Intrakoronáriás endothelin Intraperikardiális endothelin Intraperikardiális endothelin-1 hatás elektrofiziológiai jellemzői Nitrogén monoxid szintetáz gátlás Mintavételezés Biokémiai analízis Statisztikai analízis Eredmények A purin metabolitok bazális koncentrációi 45 2

3 4.2. Az intrakoronárias endothelin-1 hatása Az intraperikardiális endothelin-1 hatása Az intraperikardiális endothelin-1 hatás elektrofiziológiai vizsgálata A nitrogén monoxid szintetáz gátlás hatása az intraperikardiális endothelin-1 indukálta purin metabolit felszabadulásra Megbeszélés Konklúzió Új eredmények Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék A disszertációban felhasznált közlemények jegyzéke Egyéb közlemények jegyzéke A disszertációban felhasznált közlemények másolatai 98 3

4 Összefoglalás A metabolikus adaptációban jelentős szereppel bíró purin metabolitok, az adenozin (ADO) és az inozin (INO), valamint a ma ismert legerősebb endogén vazokonstriktor peptid, az endothelin-1 (ET 1) ellentétes hatást fejtenek ki a koronária erek tónusára. Ezen ágensek fiziológiás körülmények között a szisztémás plazmában mérhető szintekhez képest többszörös koncentrációban vannak jelen a perikardiális folyadékban. Perikardiális szintjeik kardiális kórfolyamatokban további emelkedést mutatnak és feltételezhető, hogy koncentrációik lokális változása jól követi a szívszövetben zajló adaptációs folyamatokat. Ugyanakkor kimutatták, hogy a perikardium vazoaktív ágensei különösen koncentrációik megemelkedése esetén - visszahathatnak a szívműködésre és ezzel párhuzamosan egymás képződését és hatásait is modulálják. A fenti ismeretekből kiindulva kísérletes modelljeinkben in situ kutyaszíven vizsgáltuk a purin metabolitok (ADO, INO és hipoxantin HXA) perikardiális koncentrációjának változásait intrakoronáriásan (ic.) és intraperikardiálisan (ip.) adott ET-1 által okozott miokardiális iszkémia alatt. Vizsgáltuk továbbá a nitrogén monoxid (NO) potenciális szerepét az ET-1 által kiváltott iszkémiás stressz ellensúlyozásában és annak a purin metabolit felszabadulással való kapcsolatát szisztémás NO szintetáz (NOS) blokád alatt. Eredményeink szerint az ic. ET-1 és ip. ET-1 a perikardiális adenin nukleozid koncentrációit jelentősen és szignifikánsan emelte, míg a nukleozid plazma koncentrációk nem változtak. Az ET-1 iszkémizáló hatását a standard EKG-jeleken súlyos ST eleváció jelezte. További kísérletekben a bal kamrai epikardiális monofázisos akciós potenciál (MAP) szignifikáns rövidülése az intraperikardiális ET-1 elsősorban szubepikardiális iszkémiás hatását igazolta. A hemodinamikai paraméterek szignifikásan romlottak az ic. ET-1 hatásban, míg az ip. ET-1 után nem mutattunk ki lényeges változást. NOS blokád során az ip. ET- 1 a kontroll csoporthoz hasonlóan a purin metabolit koncentrációk szignifikáns emelkedését okozta. Nem találtunk szignifikáns különbséget a kontroll és az L- NAME kezelt csoportok összehasonlításakor az ET-1 által indukált iszkémiát kísérő perikardiális nukleozid szint emelkedésében. 4

5 Megállapítottuk, hogy a purin metabolitok koncentrációinak változása a perikardiális térben jól követi a miokardiális intersticium purin metabolit szintek dinamikus változásait, azaz az adenin nukleozid adaptációs rendszer aktivációját. Az adaptációs mechanizmus a koronária vaszkulatúra és a perikardium felől vazokonstriktor ET-1-gyel egyaránt aktiválható. Tekintettel arra, hogy a szisztémás NOS gátlás nem súlyosbította a perikardiális ET-1 által kiváltott iszkémiát és nem változtatja meg a purin metabolitok felszabadulás rátáját, valószínűsíthető, hogy az endogén NO nem kiegészítő faktora a purin metabolitoknak a koronária adaptációs válasz e típusában. 5

6 Abstract Pericardial activation of metabolic adaptive mechanisms: the effect of endothelin-1. The purine metabolites, adenosine (ADO) and inosine (INO) playing an important role in the metabolic coronary adaptation, and the most potent endogenous vasoconstrictor endothelin-1 (ET 1) exert opposite effect on the coronary blood flow. These agents show several fold higher pericardial concentrations than those of measured in the venous plasma in physiological conditions, and their concentrations show further increase in cardiac diseases. It was supposed that alterations of pericardial concentrations of adenine nucleosides reflect the activation of adaptive processes in the heart tissue. Moreover, it was also hypothesised that elevated levels of these endogenous regulatory agents in the pericardial space may affect cardiovascular function and may modulate production and effects of each other. On the basis of the above considerations we examined changes in pericardial concentrations of purine metabolites (ADO, INO and hypoxanthine HXA) in myocardial ischaemia induced by intracoronary and intrapericardial administration of ET-1 to the in situ canine heart. The potential role of nitrogen monoxide (NO) in compensating the ET-1-induced ischaemic stress, and in modulating the myocardial purine metabolite deliberation was also studied by measuring changes of pericardial purine metabolite concentrations after intrapericardial ET-1 administration with or without systemic nitrogen monoxide synthase (NOS) blockade. The intracoronarially and intrapericardially administered ET-1 has significantly elevated the concentrations of the pericardial adenine nucleosides, while no changes were observed in the systemic plasma levels of these agents. The ischaemic effect of ET-1 was shown by ST segment elevations in each experiment. Moreover, the significant shortening of the left ventricular epicardial monophasic action potential (MAP) after the ip. administered ET-1 proved the ischemic effect of ET-1 that was exerted mainly in the subepicardial myocardium. The haemodynamic variables showed marked decrease to intracoronary administration of ET-1, but no significant changes occurred in either series of intrapericardial ET-1 studies. In the NOS inhibition (L- NAME iv. administration) setting the ET-1 elevated the pericardial purine 6

7 metabolite concentrations significantly both in the control and L-NAME treated groups compared to basic values. However, no differences were detected in ischaemic elevations of pericardial purine metabolite levels, when compared the results obtained in the L-NAME treated or untreated experimental groups. The results suggest that the alterations of purine metabolites in the pericardial space reflects the dynamic changes of the nucleoside concentration in the adjoining interstitium i.e. the activation of the coronary adaptive mechanisms, which could be evoked either by intracoronary or intrapericardial ET-1. Considering the fact, that systemic NO synthase blockade did not aggravate the intrapericardial ET-1- induced myocardial ischaemia, and did not change the concomitant release of purine metabolites it is supposed that endogenous NO is not a supplementary factor to adenosine and inosine in this type of coronary adaptive responses. 7

8 Rövidítésjegyzék 5 ND ADO AD AV big-et-1 BKendo BKepi DAG EHNA ET-1 HCys HXA HPLC ic. IMP INO ip. IP 3 LAD L-NAME MABP MAP MAPD 90 NADPH NOS cnos enos inos nnos PBSA PF 5 nukleotidáz adenozin adenozin deamináz atrioventrikuláris = pitvar-kamrai big-endothelin-1 (ET-1 prohormon) bal kamrai endokardiális monofázisos akciós potenciál bal kamrai epikardiális monofázisos akciós potenciál 1,2 diacil-glicerol eritro-4-(2-hidroxi-3-nonil) adenin-hidro-klorid endothelin-1 homocisztein hipoxantin folyadék kromatográfia intrakoronáriás inozin monofoszfát inozin intraperikardiális inozitol-(1,4,5)triszfoszfát bal elülső leszálló koronária artéria (G)-nitro-L-arginin metil észter artériás középnyomás monofázisos akciós potenciál a MAP 90%-os repolarizációnál mért időtartama nikotinamid adenin dinukleotid foszfát nitrogén monoxid szintetáz konstitutív NOS endoteliális NOS indukálható NOS neuronális NOS albuminnal kiegészített, pufferolt fiziológiás sóoldat perikardiális folyadék 8

9 PI SAH SAM UV VT VES VF perikardiális infuzátum S-adenozil-homocisztein S-adenozil-metionin az akciós potenciál felszálló szárának meredeksége kamrai tachycardia kamrai extraszisztole kamrafibrilláció 9

10 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés Nyugalmi körülmények között a miokardiális sejtek oxigén- és energiaigénye, illetve oxigén-ellátottsága közti egyensúlyt a bazális koronária áramlás teljes egészében biztosítani képes. Ismert ugyanakkor, hogy a miokardium meglehetősen korlátozott anaerob kapacitással rendelkezik. A normál munkát végző szív a koronária-keringés által közvetített oxigénmennyiség mintegy 75%-át felhasználja, következésképpen a sinus coronariusból nyert vér oxigénartalma igen alacsony. Fokozott munkavégzés, megnövekedett miokardiális metabolizmus esetén a szívizomsejtek konstans áramlás mellett nem képesek az oxigén extrakció növelésével fedezni a megemelkedett oxigénigényt. Ennek következménye, hogy adott parciális arteriás oxigénnyomás mellett a fokozott oxigén igény kielégítése csak a koronária áramlás azaz az időegység alatti oxigénszállítás növelésével lehetséges, melyet a szívben komplex szabályozó-rendszer biztosít. E szabályozás diszfunkciója esetén miokardiális iszkémia, csökkent perctérfogat, hipotenzió alakulhat ki, aritmia léphet fel. A koronária áramlás fő meghatározói a fizikai tényezők (transzmurális nyomás, endoteliális nyíróerő) mellett a vegetatív (elsősorban szimpatikus) idegrendszeri működés, a lokális metabolikus adaptáció és az endotelialis autokrin/parakrin moduláció. Ez utóbbiak közül a neurális szabályozás mechanizmusa és szerepe tekinthető a leginkább feltártnak, míg a metabolikus kontroll pontos működése - az immár sok évtizedesnek nevezhető kutatások ellenére - nem teljesen tisztázott. Ugyanez mondható el az endoteliális szabályozás elemeiről, melyekről viszonylag újabb keletű ismereteink vannak, és amelyek szintén intenzív kutatás tárgyai. Drury és Szent-Györgyi (29) már igen korán felvetette az adenin vegyületek szerepét a szívizomszövet és koszorúerek közti kommunikációban, ennek talaján született meg a metabolikus koronária adaptáció klasszikus adenozin-elmélete. (13). A Berne-féle hipotézis szerint a csökkent miokardiális oxigénellátás ill. megnövelt miokardiális munka esetén a szívizomsejtekből felszabaduló dilatátor adenin 10

11 nukleozid, az adenozin a koronária áramlást, vagyis az oxigén ellátást a mindenkori energia állapotnak megfelelően a miokardiális szövet oxigénigényéhez illeszti. Normoxia és normál energiaegyensúly esetén a kardiomiocitákban nagy energia tartalmú adenozin trifoszfát (ATP) képződik. A vérben csökkenő oxigéntenzió, a miokardiális hipoxia, vagy csökkent vérellátás, iszkémia során a szívizomsejtekben az energiaegyensúly a raktározott energia felhasználása irányába tolódik el: az ATP lebontásával több lépésben adenozin képződik, mely erős vazodilatátor hatást fejt ki. A kiváltott gyors vazodilatatáció révén ismét megfelelő szintre emelkedő koronária áramlás biztosítja a normális működéshez szükséges miokardiális oxigén- és energia-ellátást, negatív visszacsatolással az adenozin képződés csökkenéséhez vezet. (8; 14; 135; 165). Ezt támogatja Olsson elmélete is, amely szerint kardiomiocitákban képződő adenozin mennyisége a kardiális energiaállapot függvénye, melyet az ATP potenciál jellemez. Az elmélet szerint adenozin a koronária rezisztencia erek tónusát oly módon befolyásolja, hogy a vazomotórium szabályozása mindig a vazodilatáció irányába mutat (140). A kutatások során bebizonyosodott, hogy az adenozin kiváltotta vazodilatáció a koronária simaizomsejteken nagyobb részben a rezisztencia ereken található A 2 purinerg receptoron keresztül valósul meg. Jelentős kétséget támasztott azonban a metabolikus koronária adaptáció adenozin elméletével szemben az az ellentmondás, hogy míg az exogén adenozin értágulat specifikus purinerg receptor blokkoló ágensekkel kompetitív módon gátolható, addig az átmeneti koronárialeszorítás felengedését követő reaktív hiperémia válasz csak részlegesen blokkolható. Felmerült tehát, hogy a természetes koronária autoregulációs válasz nem, vagy csak kisrészben adenozin-függő. Ez az ellentmondás azonban feloldható, ha figyelembe vesszük, hogy az adenozin degradációs terméke, az inozin (INO), mely bár önmagában az ADO-nál gyengébb vazodilatátor effektust képes létrehozni, erősen potencírozza az adenozin-mediált vazodilatációt. Az inozin metabolikus vazoregulációban betöltött szerepe mellett szól az a felismerés is, mely szerint purinerg receptor gátlás során, inozin adása mellett - bár 11

12 valamelyest csökkent mértékben, de fennmarad az adenozin vazodilatáció, vagyis az inozin jelentős mértékben helyreállítja a blokkolt adenozin választ. Ez azt jelentheti, hogy a koronária hiperémiás reakció purinerg blokkolókkal szembeni viszonylagos érzéketlenségéért az adenozinból folyamatosan képződő inozin hatása felelős (77; 80; 81; 85). A lokális metabolikus adaptáció mellett a vérkeringés és ezen belül a koszorúér keringés szabályozásában kiemelkedő szerepet tölt be a vaszkuláris endotelium, mely több fontos vazodilatátor és vazokonstriktor szubsztancia előállítására képes. Az elsőként felfedezett ilyen ágens az erős vasodilatátor hatású prosztaciklin volt (127). Az endotelsejt vazodilatátor szabályozásban meghatározó szerepét először Furchgott és Zawadski írta le 1980-ban (46). A felfedezés szerint ez a sejtréteg megfelelő ingerek hatására értágító ágenseket kibocsátva relaxációt idéz elő a környező simaizomsejteken. Az elsők között kimutatott endothelium eredetű relaxáló faktort (EDRF) akkor a legfőbb, nem-prosztaglandin származék transzmitternek tartották, melyet a későbbiekben nitrogén monoxidként (NO) azonosítottak (142). A koszorúér tónus szabályozói között a vazodilatátorokkal ellentétes hatással bíró erős vazokonstriktor anyagok is szerepet kapnak. Korábbi tanulmányok agyi ereken az angiotenzin II-t (2), a koronária rendszerben pedig az α-adrenoceptor izgató ágenseket (6) tartották a non-okkluzív iszkémiás állapot hátterében feltételezett vazospazmus legfőbb kiváltó anyagainak. Kiderült azonban, hogy ezek hatása részben nem hosszantartó, részben a koronária ereken más érterületek válaszával összevetve nem is túlságosan markáns (86). Később felfedezték, hogy az érendotél egy prolongált vazokonstrikciót kiváltó anyagot is előállít (62), melyet 1988-ban a mai ismereteink szerint is a legtartósabb vazokonstriktor hatással bíró peptidként, az endothelinként azonosítottak (187). Az endothelin intenzív és igen tartós érszűkületet vált ki, mely a katekolamin és angiotenzin hatással ellentétben nem csak a perifériás ereken és a zsigeri szervekben erőteljes, hanem a vitális szervek artériás rendszerén is hasonló 12

13 mértékű (151). Kísérletes modellben az endothelin nagyobb dózisai már egyszeri intrakoronáriás bólus adás során is súlyos, gyakorlatilag teljes áramlási stoppot okozó vazokonstrikciót váltanak ki, melyet az adaptációs mechanizmusok csak kevéssé tudnak kompenzálni (40). Így a koronária konstrikció hosszantartó, nehezen oldódó, spasztikus jellegű és az előbbi koronária szűkítő effektusoktól eltérően sohasem követi reaktív értágulat (82). 13

14 1.1. Adenin nukleozidok Az adenin nukleozidok képződése és lebomlása Az adenin nukleozidokat, az adenozint és az inozint - egy purin szerkezetű heterociklusos, aromás bázis és egy ribóz molekula alkotja. Az adenin nukleozidok az adenozin-trifoszfát lebomlásának termékei, tehát a sejtek nagy energiájú foszfátforgalmának részei. A szívben az adenozin a miocitákban és kisebb mennyiségben a vaszkuláris endoteliumban képződik. Normoxiás körülmények között az intracelluláris adenozin nem szabad formában, hanem metioninhoz kötve található (S-adenozilmetionin, SAM), melyből S-adenozil-homocisztein (SAH) képződik. Az adenozin SAH formában tárolódik a sejtekben, nem transzportálódik és vazoaktív hatást nem fejt ki. A nyugalmi adenozin felszabadulás az SAH hidrolízise révén történik. Ezen az útvonalon az ADO folyamatosan, hipoxia alatt is közel állandó mennyiségben képződik a sejtekben (111; 141). A hidrolízis során visszamaradó homocisztein (HCys) metioninná alakul vissza és így ismét szabad adenozint köt ami SAH formában tárolódik a sejtben (1. ábra). Hypoxia Normoxia Met SAM ATP ADP ATP ADP SAM Met HCys SAH AMP AMP SAH HCys SAH hidráz 5 ND Adenozin AD Inozin SAH hidráz 1. ábra. Az adenozin képződése normoxiás és hipoxiás körülmények között. Magyarázat a szövegben. ATP, ADP, AMP: adenozin tri-, di- és monofoszfát; 5 ND: 5 nukleotidáz; Met: Metionin; SAM: S-adenozil-metionin; SAH: S- adenozil-homocisztein; HCys: Homocisztein; AD: adenozin deamináz. Vastag nyíl: meghatározó folyamat. 14

15 Normoxiában a miokardiális sejtek energiatöbbletüket nagy energiájú foszfátkötések létrehozásával tárolják, az adenozinból adenozin mono- (AMP), di- (ADP), majd trifoszfátot (ATP) képeznek. Hipoxia alatt az adenozin fő forrását az AMP defoszforilációja adja, mely a sejtek energiaállapotának, ATP tartalmának függvénye, azaz amikor valamilyen oknál fogva a sejtek energiaraktározó képessége megszűnik, felélik a nagy energiatartalmú ATP készleteiket: az ATP ADP-vé, majd AMP-vé metabolizálódik, ebből a sejten belüli 5 -nukleotidáz képez intracellulárisan nagy mennyiségű adenozint és foszfátot (75; 156) (1. ábra). Az 5 -nukleotidázt negatív feedback elven gátolja az adenozin és az ATP (91), míg stimulálja az alacsony energia állapot (hipoxia, fizikai terhelés), a megnövekedett AMP- és nitrogén monoxid koncentráció, valamint az α-1-adrenerg aktiváció (138). Az ADO szintézis másik útját a kardiomiociták és endotélsejtek felszínén található transzmembrán ekto-5 -nukleotidáz enzim működése jelenti. Az enzim katalitikus része a sejtmembrán külső felszínén található (43) így ez az AMP lebontását követően az ADO-t már közvetlenül az intersticiális térbe juttatja. Mindemellett az ecto-enzimet gátló α,β-metilén-adp alkalmazása nem módosította a hipoxia által indukált adenozin felszabadulást (158), tehát feltételezhető, hogy ilyen körülmények között az adenozin főként a citoszolban képződik és diffúzióval vagy karrier-közvetített módon jut az extracelluláris térbe. Az AMP alternatív lebomlási útja az adenin-deamináz által katalizált inozinmonofoszfáttá (IMP) történő átalakulás, melyből defoszforiláció során inozin keletkezik. Ezt a mechanizmust azonban a hipoxia alatt kialakuló magas intracelluláris anorganikus foszfát tartalom és az alacsony ATP koncentráció gátolja, így az adenozin képződése elsősorban az 5 nukleotidáz-útvonalat követi. A fiziológiást meghaladó koncentrációjú adenozinból az adenozin deamináz enzim inozint képez a szívizomsejten belül. Az inozin képződésének másik lehetséges útja az inozin monofoszfát (IMP) defoszforilációja, melyet az AMP-adenozin úthoz hasonlóan az 5 -nukleotidáz enzim katalizál. 15

16 Az INO katabolizmusa során hipoxantinná, xantinná, végül húgysavvá bomlik. A hipoxantin a hipoxantin foszforibozil-transzferáz által katalizált foszforiláció során ismét IMP-vé alakulhat. A megfelelő energia és oxigén ellátás helyreállása után a kardiomiociták, endotelsejtek energiaraktáraikat az ADO és INO foszforilációjával helyreállítják: az adenozin-kináz AMP-t, az inozin-kináz IMP-t képez, mely utóbbiból transzmetilációval AMP keletkezik az ATP-adenozin metabolikus tengely ismét az intracelluláris energiaraktározás felé tolódik el Az adenin nukleozidok miokardiális transzportja A hipoxiában/iszkémiában intracellulárisan felszaporodó ADO és INO szabad diffúzióval képesek átjutni a szívizomsejtből az intersticiális térbe, ahol hatásukat az összes sejtféleségre: a vaszkuláris simaizomsejtekre, a szívizomsejtekre ill. az ingerképző, ingervezető rendszer sejtjeire kifejtik. Mindemellett a szívizomsejt és az endotelsejt membránban nukleozid transzport-fehérje is működik, amely kétirányú membrán transzportot biztosít (140). Az intersticiális ADO szint emelkedésének másik lehetséges útja a sejtembránhoz kötött ekto-5 -nukleotidáz aktivitásának fokozódása (73), melynek működése révén az intracelluláris AMPből képződő adenozin a miocita membrán külső oldalán válik szabaddá. Az adenozin és inozin további útját a koronária lumen felé nagyobb részben az érendotel membrán nukleozid-transzporterei biztosítják abluminális felvétel és luminális leadás révén. Ugyanakkor az adenin nukleozidok valószínűleg interendoteliálisan is átdiffundálnak az intersticiumból az intravazális térbe. Az intersticiális nukleozid koncentrációk csökkenése irányába hat a miociták aktív adenozin és inozin felvétele is (12; 73). A miokardiális nukleozid transzport főbb elemeit a 2. ábra szemlélteti. 16

17 Miocita Intersticium Endotel Lumen 5 ND T AMP ADP ADO diffúzió diffúzió ADO T ADO T ADO ATP INO T INO T INO HXA T INO HXA 2. ábra. Az adenin-nukleozidok miokardiális transzportja. Magyarázat a szövegben. ATP=adenozin trifoszfát, ADP=adenozin difoszfát, AMP=adenozin monofoszfát, ADO=adenozin, INO=inozin, HXA=hipoxantin, 5 ND=5 nukleotidáz, T=transzport (carrier) fehérje Adenozin receptorok és az adenozin hatásai Az adenozin a sejtfelszín purinerg receptorain keresztül fejti ki hatását E receptorok a legtöbb sejtféleségen megtalálhatók, többek között az érsimaizomsejtjeken, endotélsejteken, szívizomsejteken, harántcsíkolt izomban, trombocitákon, limfocitákon, neuronalis sejteken is (139). Eddig négy adenozin receptort írtak le, melyeket alapvetően az adenilát cikláz enzim működésére kifejtett - gátló vagy stimuláló hatásuk és szelektív agonistáik alapján definiáltak. A kardiomiociták mind a négy - A 1, A 2A, A 2B, A 3 purinerg receptort expresszálják, és ezek mindegyike G-protein csatoltan fejti ki hatását (110). Az 1-es receptor típust (A 1 ) először szívizomsejteken mutatták ki. A receptor pertussis toxin-érzékeny G i -protein csatolással aktiválja az ADO függő K + csatornákat hiperpolarizációt és akciós potenciál rövidülést hozva létre (103). Ugyanezen a receptoron keresztül az adenilát cikláz aktivációját gátolva az intracelluláris camp mennyiségét csökkenti. Ezáltal gátolja az L-típusú Ca 2+ - csatornákat, pacemaker-ioncsatornákat, a késői egyenirányító K + csatornákat (10, 161). Az A 1 receptorokon keresztül kifejtett hatásai, a pitvari negatív inotrop, sinus 17

18 csomóban a negatív kronotrop, az AV csomóban a negatív dromotrop és az általános anti-adrenerg hatások mindegyike a miokardiális oxigénigény csökkenése irányába hat. A szívizom védelmét mutatja, hogy az A 1 receptor aktiváció csökkenti az iszkémiás kontraktúrát (106) és az anaerob glikolízis stimulálása révén fokozza a glükóz felhasználást (198). Ugyancsak G-protein közvetített hatás a foszfolipid katabolizmus stimulációja is. Az adenozin további, közvetlen protektív hatással bír a kardiomiocitákon és érsimaizomsejteken. E hatását az A 1 purinerg receptoron, G i -fehérjén keresztül aktivált ATP függő K + (K ATP ) csatornák hozzák létre (89). A K ATP csatornák megnyitása hiperpolarizálja a kardiomiocitákat, effektíven csökkenti a feszültségfüggő Ca 2+ beáramlást, és iszkémia, reperfúzió során segíti a celluláris ATP szint jobb megőrzését. Ugyanakkor valószínűsíthető, hogy az adenozin protein-kináz C aktiváció révén közvetve hatást gyakorol a mitokondriális K ATP csatornák megnyílására is, mely által a mitokondriális funkciót is javítja. Mindezen hatásoknak szerepet tulajdonítanak az iszkémiás prekondicionálásban is (56; 79; 196). Az A 1 receptor izgalom az A 2 aktivációval ellentétben fokozza az aktivált neutrofil granulociták kemotaxisát és érfalhoz való kitapadását (23). Szentmiklósi és munkatársai kimutatták azt is, hogy a specifikus adenozin deamináz gátló cofomicin és a nukleozid felvételt blokkoló dipiridamol pitvari szövetben erősen potencírozza az adenozin negatív inotróp hatását és növeli a K + kiáramlást, s ez az adenozin túlzott felszaporodása esetén, hipoxiában ronthatja a pitvari kontraktilis funkciót (171; 172). Az ADO az érsimaizom- és érendotelsejtek felszínén kimutatott A 2 receptorokon keresztül G s -protein kapcsolattal az adenilát-cikláz és guanilát cikláz indukcióját idézi elő, az intracelluláris camp és cgmp koncentrációt növeli. Az A 2 receptorok által kiváltott vazodilatációt elsősorban a camp szint emelkedésének tulajdonítják. Az A 2 receptorok az endoteliális nitrogen monoxid szintézist és felszabadulást is indukálják. Az A 2 receptorok egy másik úton, ATP függő K + csatornák 18

19 megnyitásával az érsimaizomsejtben hiperpolarizációt, ezáltal relaxációt hoz létre. Ugyanezen receptorhoz köthető a trombocita-aggregációnak és -kitapadásnak, a neutrofil granulociták kitapadásának, valamint a szabadgyök (szuperoxid) képződésének gátlása (11; 18; 109). Az A 2 receptornak tulajdonítják camp-függő és független miocita aktiváció révén adenozinnal létrehozható pozitív inotrop hatást is. (26). Az A 1 receptor mellett újabban az A 3 receptor szerepét is leírták az iszkémiás prekondícionálásban, mely ugyancsak G i -proteinen keresztül az adenilát ciklázt gátolja, ill. az adenozin függő K + csatornákat aktiválja (21) Az adenin nukleozidok, mint a metabolikus éradaptáció transzmitterei Az adenozinnak (és az inozinnak), mint bármely más transzmitter ágensnek mind a specifikus ingerre való képződés ill. felszabadulás, mind a biológiai hatás, mind pedig az effektív lokális koncentráció vonatkozásában szigorú kritériumoknak kell eleget tennie. Míg az első két vonatkozásban az adenozint, mint tökéletes átvivő anyagot tarthatjuk számon, a hatékony szívszöveti koncentráció megállapítása ma is megoldatlan probléma. Az elmúlt mintegy 30 év során rendkívül sok vizsgálatban sokféle módszerrel igyekeztek felbecsülni a miokardiumban hipoxia, iszkémia, fokozott munkavégzés vagy farmakológiai stimuláció során bekövetkező adenin nukleozid felszabadulás mértékét és annak dinamikáját. E vizsgálatok túlnyomó részében a koronária vénás vérből és szívizom biopsziás mintákból való adenin nukleozid, főként adenozin meghatározást végeztek. Emelkedett purin metabolit szinteket találtak miokardiális iszkémia (52; 145), fizikai terhelés (119; 120; 154) és szimpatikus idegrendszeri stimuláció (126) kísérletes körülményei között. Humán iszkémiás szíven is több vizsgálat igazolta a sinus coronarius vér adenin nukleozid koncentrációinak a nem-iszkémiás szív vérénél magasabb értékeit (9; 33; 41; 47; 57). 19

20 Bár az ADO és INO adekvát felszabadulása kimutatható volt e vizsgálatokban, az adenin nukleozidok jelentőségének és hatékonyságának kérdése a metabolikus adaptációs folyamatokban mégsem volt megnyugtatóan tisztázható az in situ szíven történő nukleozid koncentráció meghatározás bizonytalansága miatt. Ennek fő oka, hogy az intersticiumba jutó adenin nukleozidok nagy arányban diffundálnak az érfalon keresztül az intravazális térbe és az érfalon való átjutás az ér-simaizomsejtek ill. érendotelsejtek nukleozid felvétele miatti jelentős nukleozid vesztéssel jár. A vérbe jutó adenozint és inozint a vaszkuláris endotel mellett a vörösvérsejtek is nagy mennyiségben veszik fel, kisebb részben a plazmában lévő enzimek bontják le, így a nukleozidok plazma felezési ideje rendkívül rövid. Mindezek miatt a vérplazmának még a lokálisan (koronária vénás vérben) és speciális metodikával (hűtött, specifikus enzim blokkolókkal preparált oldattal való vérvételi mód) mért adenozin koncentrációi (41; 152) sem tükrözhetik kellőképpen azt a szöveti adenin nukleozid szintet, ami a szív intersticiumot jellemzi, és aminek a miociták és az érsimaizomsejtek vannak kitéve. (61; 131; 134). Nincs pontos információnk tehát a szívizomszövet adenin nukleozid tartalmáról, különösen a szív perivaszkuláris/intersticiális kompartmentjének nukleozid szintjeiről, ahol ezek az ágensek vazoaktív ill. kardioaktív hatásukat kifejtik. Ezért új vizsgálati eljárások kidolgozására volt szükség. A purin metabolitok intersticiális szintjeinek meghatározására kidolgozott módszerek közül a legközvetlenebb mérést a miokardiális mikrodialízis technika tette lehetővé, mellyel a szív egy-egy meghatározott területén, az oda beöltött dializáló szondák mosófolyadékának analízise révén nyertek információt az intersticiális tér adenin nukleozid tartalmáról (25; 27). Újszerű lehetőséget kínált ugyanakkor az intersticiális nukleozidok vizsgálatára az a körülmény, hogy az adenozin és az inozin az intersticiális térből az epikardiumon keresztül kidiffundálva megjelenik a perikardiális térben. Feltételezve, hogy az adenin nukleozidok eliminációja a perikardiális térben nem következik be olyan gyorsan, mint a plazmában, a perikardiális folyadék nukleozid koncentrációi a plazmáénál lényegesen jobb közelítéssel mutathatják az intesticiális adenin nukleozid szinteket és követhetik azok változásait. 20

21 A perikardiális folyadék szerepe a szívműködésben A perikardium és a perikardiális térben lévő folyadék összetevőinek első vizsgálata óta (118) számos tanulmányban igyekeztek e komponensek eredetét tisztázni, minőségi- és mennyiségi analízisét elvégezni (50; 63; 70; 125). E vizsgálatok során megállapást nyert, hogy a perikardiális folyadék alap-összetétele szerint ultrafiltrátumnak tekinthető. Bár valószínűsítették, hogy a perikardiális folyadék az intersticiális folyadékból származó epikardiális transzszudátum (5; 124), szöveti indikátor szerepére csak kevesen gondoltak és funkciójának azt a mechanikus hatást tartották, ami a szív mozgása során a pericardium lemezek között keltett súrlódást csökkenti. 30 éve magyar kutatók vetették fel, hogy a perikardiális folyadék a benne található szubsztanciák révén szerepet játszhat a szívműködés szabályozásában (170). Ennek helytállóságát azóta számos vizsgálat eredménye igazolta, jónéhány szíveredetű regulátor ágens jelenlétét mutatva ki a perikardiális folyadékban. Ilyen faktorok többek között az adenin nukleozidok (28; 39), katekolaminok (84), natriuretikus peptidek (173; 177), prosztaglandinok (114), endothelin-1 (66; 68), endogén antioxidánsok (159), citokinek (163) és növekedési faktorok (44). Ennél is fontosabb azonban, hogy ezen ágensek többségének perikardiális koncentrációja a plazmaszinteket meghaladja, tehát valószínűsíthető, hogy nem a parietalis perikardium ereiből vagy az epikardiális erekből adódnak le, hanem a miokardiumból származnak, ahol ezen ágensek lokális szöveti koncentrációi a plazmaszinteknél szintén lényegesen magasabbra tehetők. Kimutatták azt is, hogy az adenin nukleozidok, natriuretikus peptidek, endothelin- 1 perikardiális koncentrációi kardiális kórállapotokban megemelkednek (28; 39; 44; 68; 114; 159; 177), valamint, hogy különösen a plazmáénál lassabb perikardiális elimináció esetén felhalmozódhatnak és visszahathatnak a szív és a koronária erek működésére. Mindezek alapján felmerült annak lehetősége, hogy a szíveredetű ágensek vonatkozásában a perikardiális folyadék összetétele a plazmáénál jobban tükrözheti azok intersticiális koncentráció viszonyait, valamint, hogy aktív hatásokat is közvetíthet. 21

22 A perikardiális adenin nukleozidok vizsgálata Feltételezve, hogy kellő ekvilibrációs idő után - a diffúzibilis anyagok koncentrációját tekintve a perikardiális tér és az intersticium egyensúlyba kerül (50; 74; 100), számos vizsgálat perikardiális szuperfuzátum technikával (7; 94; 104; 126; 141; 195) epikardiális transzudátum gyűjtésével (51; 58; 194) nyert mintákból következtetett az intersticium adenin nukleozid-tartalmára (1. táblázat). A vizsgálatok egyértelműen igazolták, hogy a normál szív perikardiális folyadékában az ADO és INO koncentrációi egy nagyságrenddel magasabbak, mint a szisztémás vérben, és többszörös értéket mutatnak a sinus coronariusban mértekhez képest is (25; 73). E technikákkal több munkacsoport a mintavételi folyadékokban mérhető adenin nukleozid szintek jelentős emelkedését igazolta endogén vagy exogén katekolamin hatásban (51; 94; 126), fokozott miokardiális metabolizmussal járó izommunka esetén (7), miokardiális hipoxiában (194; 199) és szívizom iszkémiában (25; 27). Ezek alapján valószínűsíthető, hogy a perikardiális adenin nukleozid szintek jól tükrözik a szív intersticium nukleozidok koncentrációit és dinamikusan követik annak különböző ingerekre fellépő változásait is. 22

23 Adenozin Inozin Mérési technika Hivatkozás koncentráció koncentráció μm 0,65-0,8 μm mikrodialízis 27; μm * 0.80 μm* perikardiális infuzátum 7; 25; 74; 94; μM - epikardiális transzszudatum 51; 58; μm intravazális (sinus coronarius vér) 24; 53; táblázat A szív intersticialis és perikardiális kompartmentjei és a vérplazma különböző mintavételi technikákkal meghatározott adenin-nukleozid tartalma irodalmi adatok alapján. (* a perikardiális infuzátum térfogata szerint korrigált koncentrációk.) 23

24 1.2. Endothelinek Az érrendszeri regulációban résztvevő szöveti vazodilatátor szubsztanciák lokálisan ható ellentét-párját sokáig nem tudták azonosítani, míg 1988-ban Yanagisawa sertés aorta endotel sejttenyészetből izolálta a máig ismert legerősebb vazokonstriktor peptidet (187). Az endothelin potens vazokonstriktor hatása mellett pozitív inotróp és mitogén tulajdonsággal rendelkezik, stimulálja a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszert és a szimpatikus idegrendszert. Az endothelin-1 (ET 1) a koronáriákra markáns vazokonstriktor hatással bír: az intrakoronáriásan adott ET 1 hosszantartó, erős vazokonstrikciót, az autoregulációs folyamatok által kevéssé ellensúlyozható hatást hoz létre. Ez a tulajdonság emeli a peptidet a koronária spazmust okozó endogén szubsztanciák első vonalába (37; 38; 40; 71; 82; 87; 169;). Különböző tanulmányok megerősítik az endothelin a kardiovaszkuláris rendszerben kifejtett kettős, parakrin és hormonális hatását (108; 185). Wagner és munkatársai endotel sejtkultúrán végzett vizsgálata kimutatta, hogy az endotelialis sejtek az endothelint elsősorban nem az érlumen felé, hanem a perivaszkuláris intersticium felé szekretálják, így a vaszkulatúra és a szívizomsejtek tekintetében feltételezhetően a parakrin hatás dominál (191). Az ET-1 ismertté válása óta számos tanulmány igazolt megnövekedett plazma endothelin szinteket emelkedett vaszkuláris rezisztenciával, vazospazmussal, érfalsérüléssel, miokardiális infarktussal járó kórállapotokban, kardiogen sokkban, hipertóniában, szubarahnoideális vérzésben, diabéteszben, májcirrózisban, szeptikus sokkban, veseelégtelenségben, pulmonális hipertóniában (151). Akut illetve krónikus miokardiális iszkémiában bár vazokonstriktor hatása az állapotot súlyosbítja - az ET-1 szintje további emelkedést mutat (83). 24

25 Az endothelin szintézise Az endothelin-1 több lépésen át egy prekurzor fehérjéből, a 220 aminosavból álló preproendothelinből képződik. A preproendothelin proetolítikus hasításakor 38 (humán) ill. 39 (sertés) aminosavból álló proendothelin más néven a big endothelin - jön létre, melyből egy neutralis metalloproteáz, az endothelin konvertáz enzim (ECE) hidrolízissel hasítja le a 21 aminosavból álló endothelint (151). Az endothelin konvertáz enzim mind az ér simaizomsejtekben, mind az endotel sejtekben megtalálható (72). Az ET-1 az endotélsejteken, ér simaizomsejteken kívül kardiomiocitákban, vesében, központi idegrendszerben is képződik (55; 149; 150; 168). A későbbiekben az endothelin-1 en kívül Northern blot analízissel további 2 endothelin izoforma - ET-2 és ET-3- mrns expresszióját mutatták ki (116; 151). Az ET-2 kis mennyiségben termelődik endoteliális sejtekben, vesében, szívben. Az ET-3 isoforma szelektíven az endokrin, a gasztrointesztinális rendszerben, és a központi idegrendszerben termelődik (60). Az alábbi sematikus ábra mutatja az ET izoformák szerkezetét: 25

26 3. ábra. Endothelin izoformák. Az endothelinek szerkezetét két, az aminosav láncon belüli diszulfid-híd, valamint egy hidrofób C-terminális láncvég jellemzi. A C- terminális triptofán, ill. a diszulfid-hidak eltávolítása a biológiai aktivitás jelentős csökkenését vonja maga után. (88) Az endothelin szintézisét kémiai és mechanikai stimulusok fokozzák: trombin (157), katekolaminok, angiotenzin II, arginin vazopresszin, hipoxia (36), a nyíróerő (shear stress, 190) valamint az endotoxinok, szabadgyökök, citokinek, interleukinok. Az endothelin szintézisét gátolják mindazon stimulusok, amelyek az intracelluláris cgmp szintet növelik: NO, nitrovazodilatátorok, natriuretikus peptidek, heparin és prostaglandinok (55). Fontos megjegyezni, hogy a plazmában mért endothelin szintek - még patologiás körülmények között is alacsonyabbnak bizonyultak annál, minthogy kifejtsenek biológiai hatást. Ezt figyelembe véve és ismerve azt, hogy az endothelin elsősorban az abluminalis felszín felé szecernálódik, valamint hogy az 26

27 érsimaizomsejtek ill. számos szerv endothelin-lebontó képessége igen hatékony, feltételezhető, hogy az ágens elsősorban lokálisan fejti ki fiziológiáspatofiziológiás hatását (151). Az endothelin lebontása elsősorban a tüdőben, vesékben, májban történik, melyet a neutralis endopeptidáz katalizál (162; 186) Endothelin receptorok, az endothelinek hatása A szervezetben eddig két ET receptort azonosítottak: mindkettő hét transzmembrán doménnel rendelkezik és jelátvitelét G-fehérjén keresztül fejti ki (4; 155). Az ET A és ET B receptorok különböző válaszokat közvetítenek (2. táblázat). Az ET A receptor elsősorban kardiomiocitákon, érsimaizomsejteken és részben endotel sejten expresszálódik. Az ET-1 és ET-2 az ET A receptorhoz való affinitása közel egyenlő, az ET-3-é ugyanakkor kisebb. E receptor vazokonstrikciót, bronchokonstrikciót, aldoszteron szekréció stimulációt közvetít. A endothelinek érszűkítő hatása az ET-1 esetében a legerősebb, az ET-3 esetében a leggyengébb a három izoforma között. Receptor ET A ET B Hatáserősség ET-1>ET-2>>ET-3 ET-1=ET-2=ET-3 Affinitás ET-1 ~ 10-9 mol/l ET-1 ~ 10-9 mol/l ET-3 ~ 10-6 mol/l ET-3 ~ 10-9 mol/l Szövet ér simaizom endotélium ér simaizom Ér típus nagy artériák és rezisztenciaerek minden ér rezisztencia és kapacitás erek Hatás Konstrikció dilatáció konstrikció 2. táblázat. A vaszkuláris ET receptorok osztályozása. (60) Az elsősorban endotelsejteken, de részben ér simaizomsejteken is expresszálódó ET B receptor indukciója mindhárom ET izoformát egyforma affinitással kötve vasodilatációt, trombocita aggregációt idéz elő (151, 60). 27

28 Mindkét receptor pozitív inotrop, kronotrop hatást közvetít, azonban az ET-1 koronária vazokonstriktor hatásáért elsősorban az ET A receptor felel (4). Az ET-1 alacsony dózisban az endothelsejteken lévő ET B receptoron keresztül nitrogen monoxid és prosztaciklin felszabadításával elsősorban vazorelaxációt okoz. Az ET B receptoron keresztüli visszacsatolással az ET-1 autokrin hatással bír: önmaga expresszióját indukálja (130; 184). Az ET receptorok több, a G s -protein által mediálta szekunder messenger utat aktiválnak. Az ET-1 foszfolipáz C indukciójával a foszfatidilinozitol-4,5-bifoszfát hidrolízisét, következményes inozitol-(1,4,5)triszfoszfát (IP 3 ) és 1,2 diacil-glicerol (DAG) koncentráció emelkedést hoz létre. Az IP 3 a citoszolban a szarkoplazmás Ca 2+ felszabadulás növekedését vonja maga után (16; 150). A DAG a protein kináz C aktiválásával intracelluláris proteinek foszforilációját, a kontraktilis apparátus Ca 2+ érzékenységének fokozódását hozza létre (54; 96). Az ET-1 vazokonstriktor hatását az adenin nukleozidokon kívül számos endogén vazodilatátor ágens mérsékli, ezek közül a nitrogén monoxidot, az atrialis natriuretikus peptidet és a prosztaciklint tartja az irodalom a legfontosabbnak, melyek a big ET-1 képzést is gátolják (17). Az endothelin önmagában stimulálja az érendothel sejtek NO és prosztaciklin produkcióját (167), míg a nitrogén monoxid szintetáz gátlók az ET-1 vazokonstriktor és -presszor hatásait fokozzák. Ez utóbbi alátámasztja, hogy létezik egy autokrin feedback mechanizmus, mely az endothelin által indukált vazokonstrikciót az endothelialis NO képzés stimulációjával modulálni képes. (137) Hasonlóan a purin metabolitokhoz, elsősorban endotel sejtek által termelt ET-1 ugyancsak fokozott génexpressziót és megnövekedett intraperikardiális koncentrációt mutat mind experimentalis iszkémiás modelleken, mind a nyitott szívműtétek során végzett humán vizsgálatokban (66; 67; 68; 174; 187). 28

29 Kimutatták azt is, hogy az epikardiális/perikardiális ET-1 kifejti jellemző hatásait: az epikardiális felszinre juttatva lokális, szubepikardiális iszkémiát idéz elő (64), a intraperikardiálisan adott peptid pedig kifejti aritmogen hatásait (49, 90). 29

30 1.3. Nitrogén monoxid Számos vizsgálat támasztja alá az NO alapvető szerepét az acetilkolinnal kiváltható, endotél-függő vazorelaxációban melyet Furchott és Zawadzki fedezett fel (46). Más vazorelaxáns ágensek, mint a prosztaciklin, bradikinin, hisztamin, P- anyag, endotel-eredetű hiperpolarizáló faktor, adrenomedullin, stb. hatásait is figyelembe véve az endotel sejtekben termelődő NO az értónus alapvető meghatározója A nitrogén monoxid szintézise A nitrogén monoxid L-argininből NG-hidroxi-L-argininen keresztül képződik (4. ábra), a folyamatot a nitrogén monoxid szintetáz (NOS) enzimcsalád katalizálja. (129; 200). L-arginin NG-hydroxy-L-arginin L-citrullin és NO 4. ábra. A nitrogén monoxid szintézise A NO szintézis mindkét lépésének alapfeltétele a nikotinamid adenin dinukleotid foszfát (NADPH), az oxigén és a tetrahidrobiopterin megfelelő hozzáférhetősége. Ez utóbbi facilitálja a NO produkciót, hiányában az ún. NOS szétkapcsolás jön 30

31 létre, és hatékony oxidáns anyagok, szuperoxidok, és hidrogén peroxid keletkeznek. (178) A NO szintézis fiziológiás ingere véráramlásból adódó, az endoteliumot érő shear stress, azaz a nyíróerő. (19; 20; 97; 98; 105;). Az NO felszabadulás legerősebb indukálói az acetilkolin és a bradikinin (128; 146), de fokozza az NO képződést számos más endogén vazodilatátor ágens is. A NOS két formája ismert: a konstitutív és az indukálható izoforma. A konstitutív enzim folyamatosan termeli a NO-t, ezt az endotélen található formát endotelialis (konstitutiv) NOS-nak (e(c)nos, vagy III. tipusú NOS), a másik, neuronokon megtalálható konstitutív formát neuronalis NOS-nak nevezik (nnos, I. típusú NOS). Az enos aktivitását fokozza a shear stress a felszabaduló szarkoplazmás Ca 2+ révén, továbbá endogén szubsztanciák, mint a bradikinin, inzulin, P-anyag, acetilkolin ligand-receptor kötésen keresztül ugyancsak a felszabaduló szarkoplazmás Ca 2+ révén stimulálja. Tanulmányok támasztották alá az enos jelenlétét, és az NO termelését a koronária rendszer minden szintjén. (3; 182) Az indukálható NOS izoforma (inos, vagy II. típusú NOS), mely elsősorban gyulladásos sejtekben, koronária simaizomsejtekben, endokardiális endotelialis sejtekben, fibroblasztokban és kardiomiocitákban expresszálódik nem kálcium függő, hanem citokinek (tumor nekrózis faktor, interleukinok) és bakteriális endotoxinok stimulálják. Az inos indukciója több órát vesz igénybe, és nagyságrendekkel nagyobb mennyiségben termel NO-t mint a konstitutív forma. Legfontosabb szerepe a gyulladásos folyamatokban van A nitrogén monoxid vazodilatátor hatásának mechanizmusa Az NO ligand-mediált és áramlás (shear stress) dependens mechanizmussal fokozza a szolubilis guanilát-cikláz aktivitását, növeli a cgmp szintet. A cgmp a protein kináz G (PKG) és a kalcium-függő K + -csatorna aktivitását fokozza, a 31

32 feszültség függő Ca 2+ -csatornát gátolja. A PKG a foszfolambán foszforilációt növeli, a szarkoplazmatikus retikulum Ca 2+ -ATP-áz (SERCA) működésén keresztül a Ca 2+ szekvesztrációt fokozza a szarkoplazmatikus retikulumban, valamint az IP 3 indukált Ca 2+ felszabadulást csökkenti. Ez utóbbi mechanizmussal gátolja az angiotenzin-ii és adrenerg vasokonstrikciót is (166) A nitrogén monoxid nem-vaszkuláris hatásai Az NO ugyancsak guanilát ciklázon keresztül stimulálja a PKG-t mely a foszfolambán- és SERCA-függő mechanizmusokon keresztül a trombocita intracelluláris Ca 2+ -koncentrációt is csökkenti, trombocita aggregáció- és adhéziógátló hatást fejt ki. Ugyancsak adhéziót gátol a vaszkuláris sejt adhéziós molekulán (VCAM-1) keresztül is. Antiproliferatív hatását a cgmp-protein kináz-a (PKA) aktiválási úton argináz és ornitin dekarboxiláz gátlása révén fejti ki. Antioxidatív hatása csak magas NO szintek esetén jelentős, ez szuperoxiddal való peroxinitrit képződésen ill. az extracellularis szuperoxid dizmutáz (SOD) indukción alapul. Normál NO koncentráció mellett a magasabb koncentrációban jelen levő szuperoxid gyökből hidrogén-peroxid képződik. A NO gátolja továbbá a szabad zsírsavak, a foszfatidilkolin és a low density lipoprotein (LDL) oxidációját Nitrogén monoxid szintetáz gátlás Az acetilkolin NO dependens vazorelaxációja gátolható az endotélium eltávolításával ill. a NOS enzimek blokkolásával. L-arginin analóggal az N(G)monometil-L-argininnel (L-NMMA) (183) illetve ennek észteresíttet formájával, (G)-nitro-L-arginin-metil-észterrel (L-NAME) kompetitív módon, nem szelektíven gátolható a NOS mindhárom izoformája. (48; 59). NOS gátlás alapján kifejlődő vazokonstrikcióról számol be az irodalom bárány pulmonalis éren in vitro (42), és kutya koronárián (147) in vivo kísérletek során. 32

33 Más tanulmányok szerint a NO szintézis arginin analógokkal való gátlása gyenge hatással bír (35; 113; 117; 136), vagy egyáltalán semmilyen hatással nincs (15; 20; 144) a koronária áramlásra nyugalomban ill. megnövekedett miokardiális oxigén felhasználáskor (fizikai terhelés alatt), annak ellenére, hogy a NOS gátlás a sinus coronarius parciális oxigénnyomását csökkenti adott miokardiális oxigén felhasználás mellett. Ez utóbbi arra utal, hogy a NO mind nyugalomban, mind terhelés alatt tónusos vazodilatátor hatást fejt ki a koronária erekre (160; 180; 181). A NO vazodilatátor hatását elsődlegesen a nagyobb koronária ereken fejti ki, melyet számos vizsgálat támasztott alá: a NOS gátlás a nagy epikardiális koronáriák átmérőjét szignifikánsan csökkentette nyugalomban (22; 107; 143) és megnövelt oxigénigény esetén (35; 148; 192). Bernstein (15) és Traverse (179) szerint a fizikai terhelés által indukált epikardiális koronária vazodilatációt endotelium-dependens nitrogén monoxid termelésnövekedés mediálja. Ez a megnövekedett nitrogén monoxid produkció a megemelkedett koronária áramlásból adódó shear stress következménye, tehát a NO jótékony hatása elsősorban a koronária endoteliális sejtekre kifejtett shear stress kivédésében és a vazodilatációs rezerv megőrzésében rejlik (78). Saját vizsgálataink szempontjából kiemelendő Duncker és munkatársai vizsgálata, melyben igazolták, hogy a nitrogen monoxid szintézis gátlása súlyosbítani képes a már csökkent vérellátású miokardium oxigénhiányát (30) és funkcionális állapotát (92). Az NO saját vaszkuláris hatásán túl fontos szabályozási lehetőséget jelent az endothelin-1-gyel való interakciója, melynek egyik eleme az endogén ET-1 szintézis preproendothelin-szintű gátlása (17; 153; 188), a másik az endothelin által a vaszkuláris endotelsejt NO képzésének stimulálása (167). Ezzel összefüggésbe hozható az a megfigyelés is, mely szerint a NOS gátlás potencírozza az ET-1 vazokonstriktor hatását (93). 33

34 2. Célkitűzések Feltételezésünk szerint az adenin nukleozidok és az endothelin a vazomotoriumra kifejtett antagonista hatásuk révén összefüggenek. A megemelkedett ET-1 szintek miokardiális iszkémiát okozhatnak, melynek ellensúlyozásában a miokardiális intersticiumban termelődő adenin nukleozidok szerepe nem teljesen tisztázott. Korábbi vizsgálataink rámutattak arra, hogy az intrakoronáriásan adott ET-1 aktiválja a metabolikus adaptációs folyamatokat, melyre a sinus coronarius vérben megfigyelt adenin nukleozid koncentrációk emelkedése utalt. Ebből kiindulva arra a kérdésre kerestük a választ, hogy az intrakoronáriásan adott (ic.) ET-1 indukált miokardiális iszkémia során bekövetkező intersticiális adenin nukleozid aktiváció megjelenik-e a perikardiális tér adenin nukleozid koncentráció változásaiban, azaz a perikardiális fluidum nukleozid-összetétele követi-e az intersticiális változásokat. Mivel a közvetlenül inrakoronáriasan adott ET-1 erős, tartós hatású vazokonstrikciót vált ki, és a perikardiális tér több ágens mellett az ET-1-t is akkumulálni képes, vizsgálni kívántuk, hogy az intraperikardiálisan (ip.) megnövelt ET-1 koncentráció hasonlóan kifejti-e vazoaktív hatását a koronáriákra, és ez tükröződik-e az intraperikardiális adenin nukleozid koncentrációkban, azaz aktiválja-e a metabolikus adaptációt a perikardiális tér felől. Felmerült a kérdés, hogy a koronária-tónus szabályozásában ugyancsak nem elhanyagolható szerepű nitrogén monoxid részt vesz-e az intraperikardiálisan adott ET-1 kiváltotta iszkémiás stressz ellensúlyozásában és a purin metabolitok felszabadulásának modulációjában. Feltételeztük, hogy a NO szintetáz enzim szisztémás gátlása, azaz (G)-nitro-L-arginin metil észter (L-NAME) intravénás adása az ET-1 koronária vazospasztikus hatását fokozza, és egyben a miokardiális adenin nukleozidok megnövekedett felszabadulásához vezet. E kérdések megválaszolására célul tűztük ki kísérleteinkben in situ kutyaszíven vizsgálni az ic. és ip. adott ET-1 okozta miokardiális iszkémiára jelentkező 34