4. Lipid mikrodomének: A szerkezet és a funkció kapcsolata...

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "4. Lipid mikrodomének: A szerkezet és a funkció kapcsolata..."

Ildikó Hajdu
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 4. Lipid mikrodomének: A szerkezet és a funkció kapcsolata... 1.) Hogyan vizsgáljuk a raftok szerkezetét? 2.) Hogyan viszgálhatjuk a raft mikrodomének funkcionális szerepét az immunválasz különböző fázisaiban?

2 Hogyan elemezhetjük a mikrodomének összetételét, szerkezetét és funkcióit? A fehérje és lipid komponensek detektálása: biokémiai módszerek (SGEUC + WB; proteomika- 2DIGE-MS; lipidomika-ms) A raftok (caveolák) in situ detektálása sejteken: mikroszkópiás technikák (CLSM, SRM; FRET; 2-foton mikroszkópia) különféle markerek segítségével Loss of microdomain integrity modellek: különféle stratégiák a plazmamembrán módosítására és a sejtfunkcióra gyakorolt hatás vizsgálatára

3 How the microdomains can be isolated from cells? Chemical definition of rafts : DRM Detergent-resistance: upon cold non-ionic detergent treatment (Triton X-100, Chaps, Brij, Lubrol) insoluble, low buoyant density (floating) mebrane fractions can be identified and isolated by SGUC Equilibrium sucrose density gradient ultracentrifugation (SGUC) sucrose g / 18 hrs 5% DRM SDS gel-western blot CD25 CD48 CD71/TrfR 36% 40% (LBD) SOL.,heavy fractions Cell lysate Brown-, Simons-, Hoessli- groups (1982-)

4 Cell number Cell number Cell number Flow cytometric analysis of DRM-association of proteins: raft 0.1 % TritonX100 5 min., ice / 0.1% Brij, 37 0C (end-point detection or kinetics) fluorescence Cholesterol depletion, w. MBCD fluorescence Cytoskeletal anchoring (+/- Latrunculin B) Gombos I et al, Cytometry, : fluorescence

5 raft markerek fluorescens cholera toxin B raft (20 nm-1 μm) anti-cd48 mab gangliozid (GM1,GM3) diic18 anti-cholesterol antitest (ACHA) pl. CD48 liquid ordered (Lo) fázis GPI-protein fluid fázis (L d ) GPI glycerophospholipids: PC,PE,PS cholesterol acilált fehérjék (e.g. Src kinázok) sphingomyelin

6 Mi az igazán jó lipid raft marker? E. Gratton et al. (Urbana-Champaign, IL) LAURDAN (UV) és dianepphq (VIS) 2-photon microscopy: human and mouse macrophages - nincs fejcsoport vagy zsírsav fajlagossága - uniform eloszlást mutat a fluid és a rendezett lipid fázisokban egyaránt - emissziós spektruma eltérő (shift), ha rendezett/kondenzált raft doménekben lokalizált - a GP érték független a próba lokális koncentrációjától Generalized polarization (GP): GP = ( I ( ) - G x I ( ) ) / ( I ( ) + G x I ( ) ) - 1 < GP < + 1 fluid condensed lipid packing density

7 Fehérjék lokalizációja raftokban in situ CLSM-al - lipid markerek: GM1 ganglioside/labels FL-Cholera toxin B; perfringolysin/fl-acha - GPI/acyl-protein markerek (sejtfüggő): e.g. CD48, CD55, CD59, CD14, AP, HAR, CD4, Lck, Lyn - negatív kontroll (nem-raft fehérje): transzferrin receptor (CD71) CD25 vs. CD48 Cc: 0.67 CD25 vs.cd71 (TrfR) Cc: (laterális feloldás korlátozott: ~ 250 nm) GM1/CTX-B vs. CD25: Cc = 0.6 Pl: IL-2Rα (CD25) kolokalizációja a lipid raftok lipid és fehérje markereivel humán T limfóma sejteken

8 Microscopy-Nanoscopy? STED microscopy: a way to forget Abbe-limit Lateral Resolution: d ~ nm! Will the molecular structure of rafts be resolvable? 500 nm S. Hell & coworkers Nature :

9 A raftok funkcionális szerepének vizsgálata Koncepció: a raftok szerkezeti integritásának megbontása ( loss of rafts vs. loss of specific function?) az alapvető lipid komponensek (sphingomyelin (SM), gangliozidok (GSL), vagy koleszterin (CHOL)) szintézisének, transzportjának, membrán szintjének manipulálása cholesterol depletio: reverzibilis extrakció ciklodextrinnel/irreverzibilis szegregáció komplexálás révén (Filipin)/oxidáció CHOL-oxidase enzimmel deprivatio: a sejtmembrán lipid szintek szupresszálása szintézis vagy transzport gátlók révén

10 Lipid raft moduláció I.: a membrán CHOL-szint csökkentése cholesterol-depletio : methyl-β-cyclodextrin (MBCD) [5-10 mm], 15-20`, 37 o C membrane cholesterol (30-50%), reverzibilis! raft (GSL, SPM, GM) koleszterin MBCD Ciklikus heptasaccharide, szelektív zárványképző molekula

11 A membrán koleszterin szint manipulálásának egyéb lehetőségei Laterális koleszterin szegregáció/térbeli depletio : Pro: Igen hatékony; ágens: Filipin; Működés: 1:1 komplexet képez a koleszterinnel, mintegy extrahálja a lipid raftokból nagy komplexekbe membránpórusokba Kontra: erősen perturbálja a membránt: nm átmérőjű pórusokat képez (nem előnyös ha sejtfiziológiai vizsgálatok követik) A membrán koleszterin oxidációja cholesterol oxidase enzimmel Az oxidált koleszterol (kolesztanon) elveszti raftofil jellegét! A raftok instabillá válnak és feloldódnak... A koleszterin bioszintézis kulcsenzimének (a rate-limiting HMGcoA reductase) gátlásával is csökkenthető: Különböző statin származékokkal (pl. lovastatin, simvastatin)

12 Lipid raft moduláció II. UFA, PUFA diet (pl. linolénsav, DHA) (nagy térkitöltés miatt hígítja/ destabilizálja a rendezett raftokat Fumonisin B1: gátolja a SM bioszintézisét exogén SMase enzim csökkenti a membrán SM szintet: destabilizálja a raftokat SM synthesis raft ER Nucleus GSL transport L-cycloserine GSL transzportgátlás

13 Példa 1: Az Immunológiai szinapszis képződés gyakorisága (B sejt-t sejt konjugáció) függ az APC (B sejt) felszínén található raftok mennyiségétől APC+TH APC CHOL-depleted +TH 80% 29% egér Th-sejt-B lymphoblast (APC) szinapszis modell B lymphoblast (JY) humán APC (JY sejt)- szinapszis modell CTL 70 (n: 294) (n: 270) (n: 394) (n: 241)

14 Example 2. The membrane MHC-II rafts of APCs control effieciency of antigen presentation to T cells and their activation 2PK3 M CD

15 Ratio of conjugated APCs (%) Fluoreszcencia intenzitás Az MHC-II-lipid raft mikrodomének az APC-n szabályozzák az antigénspecifikus T sejt válasz érzékenységi küszöbét! cholesterol raft MHC-II 2PK3 (APC) kontroll +M CD M CD T-sejt aktiváció, kalcium szignál control 10 mm M CD 20 M cytochalasin D M P4 20 M P4 + M CD 20 M P4 + M CD 0.1 M P4 + M CD 0.1 M P4 + M CD idő (s)

16 A fehérjék raft-transzlokációjának modellje: a fehérje konformáció változása módosítja a fehérje-lipid kölcsönhatásokat ( Lipid shell model of rafts: Anderson, Jacobson, Science, 2002) Példa: Az immunsejtek antigén receptorai raftofillé válnak a ligandkötés hatására nyújtott/streched fehérje konformáció : kedveli a hosszú, telített zsírsavláncú lipideket (pl.raft/caveola lipidek: GSL, SM) a relaxált konformáció : a flexibilis, telítetlen zsírsavas lipideket kedveli (pl. fluid fázis képző glycerophospholipidek: PC, PE ) Activation (e.g. MHC/p-TCR) Crosslinking (e.g.. BCR, FcεRI)

17 (modell) kis (~20 nm) GPI domének (fehérjék+lipid shell) mind a külső és a belső rétegben; instabil (τ: ~ms) 3. kondenzált Ab koleszterin-gsl 2. komplex 1. L 4. core raftok (ligand/ab-stabilizált raftok a külső rétegben; stabil (τ: ~ s) szignál raftok (a küldő és belső réteg raftjai kontaktusban) stabil (τ: ~min) tutajozó fehérjék : - GPI-horgonyzott fehérjék (EC layer) - acilált (duplán palmitoilált,miristoilált,prenylált) (IC layer) - transzmembrán fehérjék (ED, TRMD, CPD)?

18 A raft mikromének szubcelluláris dinamikája death, stress signals - extracellular ligand - antibody - pathogen-associated ligand (long lifetime, large, stable rafts) Signal raft EXT. INT. - lipid biosynthesis/regulation - FAS/cholesterol/SPL - PUFA actin cytoskeleton endocytosis/internalization ER Miozin dynein R R R R microtubules

19 Mit tudunk a membrán mikrodoménekről? Biokémia/Biofizika Morfológia/szövetspecificitás Funkció rendezett lipid fázisú (L o ) domének - DIG / GEM / DRM - CHOL/SM, GSL magas% - alacsony sűrűség, Triton-X100 detergens rezisztencia - mikroszkóppal detektálható fehérje és lipid (co) klaszterek - szubmikroszkópikus diffúziós barrierek (SPT) Lipid összetétel - cholesterol - sphingomyelin, PIP2 - GSL/gangliosides (cerebrosides) Caveola (caveolin +): flaskaszerű membrán invagináció - endothel sejtek - adipocyták - Izom sejtek - fibroblasztok - astrocyták, fagociták RAFT (caveolin -): (~ 20 nm 1 μm) - Minden magvas sejt - Különösen magas expresszió: Leukociták, T/B sejtek, tumoros sejtek Szerkezeti fehérjék: - caveolins - flotillins - cavatellins caveola Transduciszómák/ szignaloszómák - Szignál komplexek toborzása - kémiai kapcsolótáblák - párbeszéd a jelátviteli útvonalak között - az aktivációt gátló molekulák dinamikus és időleges kizárása Constitutive protein composition (inducible) - GPI-anchored proteins - RTKs, NRTKs - Ras-MAP kinase cascade elements - G-proteins - adaptors (e.g.lat), NOS, PKCs, PLD - coreceptors of lymphocytes (e.g. CD4, CD19)

20 További fontos nyitott kérdések: Milyen celluláris mechanizmusok kontrollálják a raftok méretét és lipid/fehérje összetételét intracelluláris transzportjuk során és a sejtek felszínén? Mekkora a raft mikrodomének fehérje/lipid összetételbeli diverzitása? Mi a mechanizmusa a külső és belső mebrán rétegben levő raftok vertikális összekapcsolódásának? Mi az egzakt mechanizmusa a citoszkeleton dinamika vezérelte raft-összeolvadásnak (koaleszcencia)?

21 A membrán-váz (szkeleton) szerepe a receptor kompartmentalizációban és a jelátvitelben

Hasonló dokumentumok

3. A plazmamembrán molekuláris szerveződése és annak dinamikája

3. A plazmamembrán molekuláris szerveződése és annak dinamikája Fehérje-,lipid-mobilitás (laterális diffúzió) és kompartmentalizáció a plazmamembránban Milyen információt adnak a fehérjék mozgási (diffúziós)