A Kv1.3 ioncsatorna szerepe a T sejt aktivációban

Átírás

1 Debreceni Egyetem Orvos-és Egészségtudományi Centrum, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet A Kv1.3 ioncsatorna szerepe a T sejt aktivációban Hajdu Péter Debrecen, 211. november 14.

2 Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben

3 Az ioncsatorna egyszerűsített képe: A hidrofil pórus teszi lehetővé az ionok gyors membránon keresztüli áramlását (1 8 ion/s)

4 immunitás mozgás szívműködés ioncsatornák szekréció memória kontrakció gondolkodás érzékelés

5 Hogyan szabályozzák az ioncsatornák a T sejtes immunválaszt? K + K + TCR/ CD3 Kv1.3 ER IP 3 PLC E m ~-5 mv CaM Ca 2+ proliferáció CRAC [Ca 2+ ] idő T sejt CRAC:calcium release activated calcium channel (kalcium felszabadulás aktivált kalcium csatorna)

6 Miképpen tanulmányozhatók az ioncsatornák? Az ionáramok mérése a patch-clamp technikával R f E m I m I p - + V tartási V ki műv. erősítő áram (pa) mv -4 mv +3 mv -1 mv -5 mv -8 mv idő (ms)

7 Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben

8 A koleszterin hatása a Kv1.3 kapuzására Hogyan befolyásolja a Kv1.3 csatorna funkcióját a humán T sejtmembrán koleszterintartalmának változása? az aktiváció és inaktiváció kinetikai paraméterei az egyensúlyi aktiváció és inaktiváció feszültségfüggése

9 A membrán koleszterin tartalom növelése lassítja a Kv1.3 (in)aktivációs kinetikát normált K + áram 1 3 Inaktivációs kinetika t τ = i I(t) I e + C max 1.5 mg/ml MβCD/C Kontroll mg/ml MβCD 1 2 Idő idő (s) normált K + áram 2 Aktivációs kinetika 1 t τ = m ax + a I(t) I 1 e C mg/ml MβCD Kontroll 1.5 mg/ml MβCD/C 1 2 idő (ms) 4 τ i (ms) 2 1 τ a (ms) 1 kontroll MβCD/C koncentráció (mg/ml) kontroll MβCD/C koncentráció (mg/ml)

10 Az aktiváció kétfázisúvá válik a koleszterin bevitel hatására normált K + áram 1 Kontroll 1.5 mg/ml MβCD/C 25 5 idő (ms) τ a (ms) 5 τ a,f τ a,s MβCD/C koncentráció (mg/ml) Módosított Hodgkin-Huxley modell: 1 mv 5 mv I t = I 1 exp t/ τ + ( ) a,f ( a,f ) ( a,s ) I a,s 1 exp t/ τ + C 4 4 R Ia,f R = I + I a,f a,s MβCD/C koncentráció (mg/ml)

11 Összefoglalás I. A T sejt membrán koleszterintartalmának növelése lassítja a Kv1.3 inaktivációt és aktivációt, megváltoztatja az aktiváció feszültség függését. A membrán koleszterintartalmának csökkentése nincs biológiailag releváns hatással a Kv1.3 csatornák egyensúlyi és kinetikai paramétereire. A koleszterinszint emelése az aktiváció kétfázisú viselkedését eredményezte. Modell Z Z 1 Z 2 Z 3 Z 4 NY I K + AZ

12 Immunológiai szinapszis T sejtek aktivációja az immunszinapszisban (IS) zajlik le, ahová számos intracelluláris és sejtmembrán fehérje szegregálódik APC T sejt TCR/CD3 LFA-1 Kv1.3 TCR/ CD3 CD4/CD8 p56 lck elkülönülő piros és zöld jel a két molekula eltérő régióban lokalizálódik (c-smac és p-smac) hdlg K v β 2 ZIP-1/2 PKC Monks et al., Nature, 1998, 395:82-86

13 Az endogén Kv1.3 csatornák az IS-ba szegregálódnak PKC-θ-GFP ext. anti-kv1.3+ IgG-Cy3 tramszmissziós T sejt APC

14 A Kv1.3 csatornák áramának kinetikája megváltozik az IS-ban Aktivációs kinetika Inaktivációs kinetika Egyensúlyi aktiváció normált áram idő idő (ms) (ms) normált áram idő idő (s) (s) norm. konduktancia tesztfeszültség (mv) :T-sejt IS-ben :egyedülálló T-sejt τ a (ms) 2.5 * D1 D1 IS-ban τ i (ms) D1 * D1 IS-ban V 1/2 (mv) k(mv)

15 A PK antagonisták gyorsítják a Kv1.3 csatornák inaktivációját Aktivációs kinetika Inaktivációs kinetika Egyensúlyi aktiváció normált áram idő idő (ms) (ms) normált áram idő (s) norm. konduktancia :,1 µm H89 (PKA) :,5 µm GF1923X (PKC) : kontroll tesztfeszültség (mv) τ a (ms) τ i (ms) * * V 1/2 (mv) k(mv). kontroll GF H89 kontroll GF H

16 Összefoglalás II a T-sejt és az APC közötti IS-ban feldúsulnak az endogén Kv1.3 csatornák az IS-ba rendeződés módosítja a Kv1.3 funkcióját a PK antagonisták egyértelműen nem bizonyítják a Kv1.3 működés foszforiláció indukálta megváltozását (a Kv1.3 átrendeződik más membrándoménekbe??)

17 Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben

18 A Kv1.3 ioncsatorna interakciós partnereinek keresése Potenciális interakciós partnerek: MAGUK (membrane-associated guanylate kinases): PSD-95 (SAP-9) SAP97 (hdlg) PCR totál Jurkat cdns-ből Western blot PSD-95 SAP bp 95 kda WB: PSD Jurkat 13 kda WB: SAP97

19 A T sejtvonalak és Kv1.3 csatornák mgfp-vel jelölt vad típusú és C mutáns Kv1.3 csatornát kifejező T sejtvonalak PSD-95 és SAP97gén lecsendesítése shrns-sel

20 A Kv1.3-feldúsulás mérése és kvantitatív jellemzése Jurkat-mGFP-Kv1.3-WT-B-sejt párok APC mgfp-kv1.3 CD3 merge T sejt APC mgfp-kv1.3 CD3 merge I IS, AREA IS : átlagos intenzitás az IS-ben illetve az IS területe I outside : átlagos intenzitás a sejten belül I inside : átlagos intenzitás a citoszólban AREA membrane = AREA outside AREA inside I BG : átlagos háttér intenzitás AR = ( ) I I AREA IS BG IS ( I I ) AREA ( I I ) AREA AREAIS AREA outside BG outside inside BG inside membrane

21 Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben

22 Az SLO klinikai tünetei Rendkívül változatos tünetek: - súlyos és középsúlyos esetek: súlyos veleszületett rendellenességek (gyakran nem élik túl a perinatális periódust). - enyhébb esetek: különböző fizikális eltérések, viselkedészavarok, tanulási problémák. Kicsi, előrenéző orrlyukak, csüngő szemhéj, fejletlen állcsont. Abnormális genitáliák, pseudohermaphroditismus. A 2. és 3. lábujj összenövése (95%!). Hiperaktivitás, autoagresszivitás. Autista vonások. Alvási problémák. Visszamaradt növekedés. Késleltetett fejlődés. Porter 26, 28

23 Az SLO kialakulásáért felelős enzim: 7-dehidrokoleszterin reduktáz (DHCR7) 7-dehidrokoleszterin (7-DHC) NADPH NADP + koleszterin DHCR7 szteroid hormonok neuroszteroidok oxiszterolok epesavak magzati fejlődés, embrionális sejtdifferenciáció membránok

24 Kv1.3 csatornák biofizikai karakterizálása CD 4+ T sejt populáció szelekciója (panning) Elektrofiziológia (patch-clamp, teljes sejt konfiguráció) R f Kv1.3 I p - + V ki CD4 T helper E m I K+ V tartási teljes sejt áram (na) Aktivációs kinetika t τ = m ax + a I(t) I 1 e C idő idõ (ms) 4 teljes sejt áram (na) Inaktivációs kinetika t τ = i I(t) I e + C max idő idő (s) (s) norm. konduktancia G Egyensúlyi aktiváció = n V V 1/2 k 1+ e 1 V 1/2 =-2.8 mv k=-1.7 mv tesztfeszültség (mv)

25 Membránösszetétel és aktivációs útvonalak monitorozása Gáz kromatográfia (7DHC és koleszterin) CFSE (karboxifluoreszcein- szukcinimidilészter) hígítási esszé sejtszám CFSE intenzitás

26 Köszönöm a figyelmet!