Ioncsatorna funkciók mérése in vitro körülmények között. Dr. Nagy Norbert Tudományos munkatárs SZTE Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

Átírás

1 Ioncsatorna funkciók mérése in vitro körülmények között Dr. Nagy Norbert Tudományos munkatárs SZTE Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

2 Témák: -Alapkutatásban alkalmazott elektrofiziológiai technikák - Klinikai diagnosztikában alkalmazott elektrofiziológiai technikák Dr. Norbert Nagy Research Fellow Department of Pharmacology and Pharmacotherapy

3 I rész. Alapkutatásban alkalmazott elektrofiziológiai technikák

4 Ohm törvény I=U/R Vizsgált biológiai szignálok az elektrofiziológiában Áram (I) Feszültség (U) Ellenállás (impedancia) (R) Az ioncsatornákon áthaladó töltésmozgás hozza létre Az ionáram megváltoztatja a membránpotenciált A membránpotenciál aktuális értéke Lehet akciós potenciál vagy elektrotónusos potenciál (e.g.: EPSP, IPSP) A sejtmembrán elektromos ellenállásként viselkedik A sejt szigetelőképessége jelentősen függ a sejt alakjától

5 Szívelektrofiziológia Az elektrofiziológia néhány területe Símaizom elektrofiziológia Vázizom elektrofiziológia Neurofiziológia

6 A kísérleti objektumok Sejt Natív sejt: tartalmazza a sejt összes ioncsatornáját Sejtkultúra: általában csak egyféle csatornát tartalmaz Szövet Szívizomszövet, agyszelet, aortagyűrű, vázizompreparátum Szerv Izolált szív In vivo Altatott állatok. Sokféle species: egér, patkány, tengerimalac, nyúl, kutya, kecske, majom

7 Patch clamp technika Áram (I) Cél: Ionáramok mérése az ioncsatorna funkciók karakterizálására. Gyógyszerhatások vizsgálata az ionáramokra. Ioncsatornák kóros működésének vizsgálata Minta: Izolált sejtek, agyszelet Háttér: Bármilyen betegség, vagy gyógyszerhatás, amely befolyásolja az akciós potenciált vagy az EKG-t, EEG-t (stb) elsődlegesen az ioncsatornák szintjén hat. Klasszikus patch-clamp setup A patch clamp technikát Erwin Neher és Bert Sakmann fejlesztette ki a votage clamp technikából. Orvosi Nobel díjat kaptak 1991-ben. Kétféle oldatot használunk: egy extracelluláris jellegű oldatot a sejtkádban, és egy intracelluláris jellegű oldatot az elektródában Elméletileg bármely ioncsatorna árama vizsgálható, de a többi áramot ki kell kapcsolni szelektív gátlószerekkel, megfelelő feszültségprotokoll alkalmazásával

8 Bert Sakmann, 2013 Erwin Neher 2015

9 Patch clamp variációk Whole cell: Több csatornának az ionáramát mérjük egy időben. Outside-out: A whole cell konfiguráció után az elektródát hátrahúzzuk, és kitépjük az elektróda alatti membrándarabot. A membrán újraegyesül. Előnye, hogy a csatornák a sejttől izoláltan vizsgálhatók. Inside-out: A whole-cell konfiguráció előtt hátrahúzzuk az elektródát, kitépjük a membrándarabot. A membrán újra egyesül, amelyet utána meg kell nyitni. A citoplazmatikus oldal lesz kifelé. Előnye, hogy gyors intracelluláris oldatcserét tesz lehetővé. Perforated patch: Az elektródában levő oldat antibiotikumot (amfotericin) tartalmaz, amely kis pórusokat képez a membránban. Ezen keresztül az ionáramok vizsgálhatóak. Előnye, hogy megőrzi, a sejt fiziológiás intracelluláris oldatát

10 1 na Ionáram mérés 400 ms 55 mv -40 mv Feszültségprotokoll, amely kiváltja az ioncsatorna megnyílását. Ca 2+ áram Inaktiváció Aktiváció 200 ms

11

12

13 Sharp microelectrode technika Feszültség (U) Cél: Akciós potenciálok mérése Minta: Elsősorban izolált szívizomsejtek Háttér: A nagy ellenállással rendelkező elektródákat a sejt intracelluláris terébe szúrjuk. A nagy ellenállás minimalizálja a sejt és az elektróda közötti oldatcserét ioncserét, így nagymértékben megőrzi a fiziológiás intracelluláris teret. Hodgkin & Huxley, Nobel prize in 1952

14 Akciós potenciálok jellemzői A különböző szövetekből származó akciós potenciálok jellegzetesen különböznek a nyugalmi membránpotenciálban, amplitúdóban, a depolarizáció sebességében, és a hosszúságban A jellegzetes eltéréseket az egyes ioncsatornák eltérő mértékű expressziója és kinetikája okozza.

15 Extracelluláris mérések Feszültség (U) Cél: Különböző extracelluláris potenciálok mérése, pl. EKG, EEG, EMG, vagy field-potenciálok Minta: Testfelületről, izolált szívről, szövetről, sejtekről Háttér: Az ingerlékeny sejtek folyamatos ioncserét hajtanak végre a környezetükkel. Az ioncsere tovaterjedése kismértékű feszültségváltozásokat képes létrehozni a sejt felszínén, ami mérhető.

16 20. Field-potenciálok mérése gyakran alkalmazott technika a neurofiziológiában. A long term potentiation (LTP) felfedezését, amely a memória és a tanulás feltételezett alapvető mechanizmusa, szintén ez a technika tette lehetővé Egy másik felületi potenciál az EKG amely izolált szív felületéről is elvezethető. A készülék neve Langendorff-apparátus amely egy konstans folyadékátáramlást biztosít a szíven keresztül, miközben az folyamatosan kontrahál.

17 Transzepitheliális elektrofiziológiai vizsgálatok Cél: Az extracelluláris méréstechnika specializált formája, amely információt nyújt az iontranszportról a polarizált epitheliális sejtekben. Feszültség vagy ellenállás mérhető. Minta: Leggyakrabban epitheliális sejtek a GI-ből, vagy a légzőrendszerből Háttér: Az epitheliális sejtek polarizáltak: apikális és bazolaterális oldallal rendelkeznek. A töltésmozgás miatt transzepitheliális feszültség vagy ellenállás mérhető. Feszültség (U)

18 Sejt impedancia mérés Ellenállás (impedancia) (R) Cél: Sejtek elektromos impedanciájának mérése Minta: Sejt kultúrák Rationale: A sejtek olyan edényben növekednek, amely a közepén egy elektródát tartalmaz. A mért impedancia úgy növekszik, ahogy a sejtkultúra egy jobban növekszik és befedi az elektródát. A folyamat egészen addig tart amíg egy egybefüggő réteg nem keletkezik. Ekkor, bármilyen változás a sejtek alakjában és elhelyezkedésében megváltoztatja az impedanciát. A módszerrel különböző sejtfunkciók vizsgálhatók: migráció, kemotaxis, kontrakció

19 Floureszcens optikai mérések Cél: Az intracelluláris Ca, Na, feszültség, ph változás nyomonkövetése fluoreszcens festékek segítségével. A módszert gyakran kombinálják patch clamp technikával vagy sharp microelectrode technikával Sample: Izolált sejt, izolált szív, vagy szövetek Rationale: Az egyes ionok aktuális szintje (Ca, Na, H) kóros körülmények között vagy farmakológiai beavatkozások hatására jelentős változást mutathat. Az ionszintek követésével fontos élettan, kórélettani, farmakológiai információk nyerhetőek. Enzimatikus bontás Sejtkád ΔV Excitáció (488 nm) LAMP Free Ca 2+ Fluo-4 +AM Fluo-4 Acetomethyl-ester + - Elektródák Emisszió (506 nm) P/V conv. Photon multiplier

20 Cél: Ca mozgások, és ingerületterjedés vizsgálata egész szíven Minta: Izolált szívek (nyúl, patkány) Kombinációs lehetőségek III. Optikai mapping szívben Háttér: Ca 2+ vagy feszültségérzékeny festékeket használunk. A ritmuszavarok vagy gyógyszerhatások jelentősen befolyásolják a Ca 2+ mozgást illetve a feszültségterjedés dinamikáját. Elsősorban aritmia vizsgálatokra használják O 2 -bubbling Solution 1. Solution 2. A technika során kombinálják a Langendorff perfúziót és a fluoreszcens optikai technikát ECGelectrodes A/D converter A technika során mérthető EKG jel, kamranyomás, illetve Ca-jel, vagy feszültségjel LAMP Temp. controller and pump CAM Balloon to measure left ventricular pressure Amplifier

21 Tipikus optikai mapping kísérlet A szívet feszültségérzékeny festékkel töltöttük fel Az eltérő színek eltérő akciós potenciál hosszt szimbolizálnak A vörös hosszú, a kék rövid akciós potenciált szimbolizál Az isoproterenol rövidíti az akciós potenciált Isoproterenol adása után az élénkvörös szín intenzitása csökken, ami akciós potenciál rövidülést jelez

22 Kombinációs lehetőségek I. Akciós potenciál mérés + Ca 2+ ionmozgás mérése szívben Sziszt. Diasztole

23 Kombinációs lehetőségek II. Ionáram mérés + Ca 2+ ionmozgás mérése szívben

24 Az egyes technikák kiegészítik egymást Pl..: egy kálcium-csatorna gátló gyógyszer vizsgálata Patch-clamp technika: kalcium-áram mérés A gyógyszer jelentősen gátolja a kalcium áramot (piros) Sharp microelectrode technika: kalcium-áram mérés szűkíti az akciós potenciált és csökkenti az intracelluláris Ca szintet Fluoreszcens optikai technika: kalcium mozgások mérése

25 II. rész A klinikai diagnosztikában használt elektrofiziológiai technikák

26 Elektroenkefalográfia (EEG) Feszültség (U) Cél: Az agy elektromos aktivitásának vizsgálata. Az elektródákat a fejre helyezik, a technika nem invazív. Felületi potenciálokat mér, amelyet a neuronokban létrejövő ionvándorlás hoz létre. Háttér: Számos betegség megváltoztatja a normál agyi aktivitást. Felhasználják az epilepszia, alvási rendellenességek, kóma, agyhalál (stb) diagnosztizálására. Az EEG speciális variációja a magnetoenkefalográfia (MEG) amely a neuronokban létrejövő ionmozgás által keltett mágneses teret méri. Nem invazív. Az elektrokortikográfia (ECoG) hasonló az EEG-hez de itt az elektródákat közvetlenül az agy felszínére teszik. Jobb felbontást tesz lehetővé, és kiküszöböli a koponya által okozott torzulásokat. Invazív technika.

27 Elektrokardiográfia (EKG) Feszültség (U) Cél: A szív elektromos aktivitásának vizsgálata. Az elektródákat a testfelszínre helyezik, nem invazív. A szívben levő ionmozgások által létrehozott felületi potenciálokat méri. Háttér: A különböző betegségek befolyásolják az egyes ioncsatornák működését. Mivel az ioncsatornák határozzák meg az akciós potenciálokat, az akciós potenciálok pedig az EKG-t a módszer révén számos betegségre lehet következtetni. William Einthoven, 1901

28 Elektromiográfia (EMG) Feszültség (U) Cél: Az izmok és a kapcsolódó idegek állapotának vizsgálatára szolgál. Háttér: A motoneuronok által szállított elektromos szignálokat jeleníti meg. Információt nyújt az ideg-izom kapcsolat állapotáról. Szintén felületi potenciálokat mér, nem invazív. Az elektródákat elhelyezhetik a testfelületen, vagy közvetlenül beleszúrják az izomba Az idegimpulzusok továbbításának a sebessége két pont között szintén mérhető az EMG segítségével Az EMG segítségével különböző, izmokat és idegeket érintő betegségek diagnosztizálhatók.

29 Köszönöm a figyelmet!