A membrán koleszterin és sziálsav szerepe az immunrendszer sejtjeinek működésében: vizsgálatok monoklonális ellenanyagok segítségével

Átírás

1 A membrán koleszterin és sziálsav szerepe az immunrendszer sejtjeinek működésében: vizsgálatok monoklonális ellenanyagok segítségével Doktori értekezés tézisei Balogh Andrea Témavezetők: Dr. László Glória Prof. Dr. Matkó János Biológia Doktori Iskola Immunológia doktori program Programvezető: Prof. Dr. Erdei Anna ELTE TTK, Biológiai Intézet, Immunológiai Tanszék Budapest, 2010.

2 BEVEZETÉS A sejtek membránját fehérjék, lipidek, és szénhidrátok alkotják, melyek mind szükségesek a normális sejtműködéshez. A koleszterin nélkülözhetetlen struktúrális lipid komponense az ún. lipid raftoknak, melyek az emlős sejtek membránjában megtalálható speciális összetételű és funkciójú struktúrák. Szerepük van membrán-receptorok szervezésében, jelátviteli utak elindításában, endocitózisban/ internalizációban, és sok patogén (pl. HIV-1) bejutásának helyszíneként is szolgálnak. A sejtfelszíni szénhidrátok egyik jelentős képviselője a sziálsav. A sziálsavat felismerő receptorok elsősorban immunsejteken expresszálódnak és a sejtadhézióban valamint jelátviteli folyamatok regulációjában fontosak. Így a koleszterin és a sziálsav is fontos, nem-fehérje természetű alkotóelemei a sejtmembránnak, melyek képesek befolyásolni az immunrenszer sejtjeinek működését. CÉLKITŰZÉSEK A koleszterin fontos alkotóeleme a membrán mikordoméneknek, ezért immunfolyamatokban betöltött szerepének vizsgálatával tanulmányozható a lipid raftok működése. Ezen speciális membránstruktúrák komponensei a jövőben immunterápiás célpontokká is válhatnak. Eddig a szakirodalomban kevés szelektív raft-markert írtak le. Továbbá nincsenek olyan in situ modulátorok, melyek a raftok biológiai funkcióját a koleszterin membránból való kivonása vagy bioszintézisének gátlása nélkül befolyásolnák. Az új IgG izotípusú koleszterin-specifikus monoklonális ellenanyagok használatával ezért az alábbi célokat tűztük ki: 1. Új, koleszterin-specifikus monoklonális ellenanyagok (ACHA-k) specificitásának, affinitásának és sejtek plazma- vagy intracelluláris membránjához való kötődésének karakterizálása. Laboratóriumunkban monoklonális, IgG3 izotípusú koleszterinspecifikus ellenanyagokat (AC1 és AC8) állítottak elő egerek koleszerin-dús liposzómákkal való oltásával. Célunk volt részletesen vizsgálni az ACHA-k kötődését liposzómák és immunsejtek membránjában megtalálható koleszterinhez. Ezen ellenanyagok szelektív lipid raft/kaveola-jelölő alkalmazhatóságát is vizsgálni kívántuk. 2. A monoklonális ACHA-k által kiváltott in vitro HIV-1 fertőzés/termelődés gátlás molekuláris hátterének vizsgálata. Kollaborációs partnerünk kimutatta, hogy HIV-1 célsejtek AC1 vagy AC8 antitesttel való előkezelése szignifikánsan csökkentette az in vitro vírus termelődést. Ezért célunk volt, hogy az ellenanyagok ezen gátló hatásának a mechanizmusát kutassuk, különös tekintettel a gazdasejteken megtalálható elsődleges és másodlagos receptorok eloszlására/interakciós mintázatára, hozzáférhetőségére, membrán diffúziójára és raft-asszociációjára. 1 2

3 Egy másik fontos membrán alkotó a sziálsav, egy szénhidrát, mely glikoproteineken és glikolipideken található meg. Sziálsav kötő fehérjék ligandumaként képes szabályozni jelátviteli folyamatokat és a sejt-sejt kölcsönhatást. A GL7 ellenanyagról már korábban kimutatták, hogy kötődik egér limfociták és humán B sejt vonalak sejtfelszínéhez. Az is tisztázásra került, hogy az antitest által felismert epitóp sziálsavat tartalmaz. A humán immunrendszeri sejtekben való expressziója és membrán-lokalizációja, valamint a GL7 epitópot tartalmazó molekula/molekulák azonosítása és így az epitóp funkciója még nem tisztázott. Ezért munkánk alapvető célkítűzése a következő volt: 3. A GL7 epitóp karakterizálása, expressziója és lokalizációja emberi immunsejtek membránjában. A GL7 epitóp humán sejtek áltai expressziója még nem teljesen feltárt. Ezért az epitóp jelenlétét különböző humán limfoid és mieloid sejteken, valamint az expresszáló sejtek nyirokszervekben való elhelyezkedését kívántuk vizsgálni. Továbbá, az epitóp membrán-lokalizációját és természetét is analizáltuk. Ezen kutatások hozzájárulhatnak a GL7 epitópot hordozó molekula/molekulák azonosításához és így, az epitóp funkciójának felderítéséhez. ALKALMAZOTT MÓDSZEREK áramlási citometria fehérjék expressziójának és ellenanyagok kötődésének vizsgálatára, immunfenotipizálásra standard és speciális konfokális mikroszkópiás képalkotás detergens rezisztens membrán frakciók izolálása gradiens ultracentifugálással és a preparátumok analízise immun-dot blot módszerrel fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) mérések konfokális mikroszkópiával fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiás (FCS) képalkotás (diffúzió/mobilitás méréséhez) felszíni plazmon rezonancia (SPR) ellenanyagok kötődési tulajdonságának mérésére detergens rezisztencia mérés áramlási citometriával (FCDR) EREDMÉNYEK 1. Új, koleszterin-specifikus monoklonális ellenanyagok (ACHA-k) specificitásának, affinitásának és sejtek plazma- vagy intracelluláris membránjához való kötődésének karakterizálása. A monoklonális ACHA-k kötődési tulajdonságait áramlási citometria és konfokális mikroszkópia segítségével jellemeztük. Az AC1 és AC8 ellenanyagok kötődtek különböző egér és emberi eredetű, intakt limfocita és monocita-makrofág sejtvonalakhoz. A kötődés jelentősen 3 4

4 növekedett a sejtek limitált papainos emésztését követően, mely a hosszú, extracelluláris fehérje domének eltávolítására szolgált. Az AC8 antitest erős kolokalizációt mutatott kaveolin + és kaveolin - koleszterin-dús lipid raft-markerekkel, intracellulárisan pedig az endoplazmás retikulum és a Golgi-apparátus markereivel. Ez arra utal, hogy a monoklonális IgG ACHA-k élő sejtek membránjában koleszterin klasztereket ismernek fel. Az ellenanyag specifikus kötődését koleszterin-moduláló ágensek (koleszterin-oxidáz, filipin III antibiotikum) segítségével is bizonyítottuk. A sejtek vagy a belőlük izolált detergens rezisztens raftpreparátumok ezen reagensekkel való előkezelése szignifikánsan csökkentette az AC8 ellenanyag kötődését. Felszíni plazma rezonancia (SPR) segítségével határoztuk meg az AC8 ellenanyag koleszterin-gazdag liposzómákhoz való affinitását, mely közepes erősségűnek (K d = 7,8 x M) bizonyult. 2. A monoklonális ACHA-k által kiváltott in vitro HIV-1 fertőzés/termelődés gátlás molekuláris hátterének vizsgálata. Humán T sejtekhez vagy makrofágokhoz való kötődés hatására az AC8 ellenanyag a lipid raftok méretének növekedését ( klaszteresedés ) eredményezte, melyet konfokális mikroszkópia segítségével mutattunk ki. Ez a raftok átlagos méretének ( ról nm-re) és az erősen foltos sejtek számának (kb. ötszörös) növekedésével volt jellemezhető. Az AC8 antitest elősegítette a CXCR4 asszociációját a CD4 receptorral és a lipid raftokkal, mely megnövekedett kolokalizációs értékekkel és FRET hatásfokkal volt jellemezhető. Ezzel összeegyeztethetően a CXCR4 membránban való mozgása, melyet FCS mikroszkópiával mértünk, lelassult. Az ellenanyag Fab fragmentuma, mely nem rendelkezik keresztkötő-képességgel, valamint nem-raft membrán fehérjék elleni egyéb ellenanyagok ezeket a hatásokat nem tudták kiváltani. 3. A GL7 epitóp karakterizálása, expressziója és lokalizációja emberi immunsejtek membránjában. Eredményeink szerint a sziálsavat tartalmazó GL7 epitópot a humán fehérvérsejtek közül kizárólag a T és B limfociták expresszálják. Azoban jelentős eltérés, hogy míg rágcsálókban az epitóp limfocitákon csak aktiválást követően jelenik meg, emberben folyamatosan expresszálódik Fluoreszcens immunhisztokémiai festéssel kimutattuk, hogy emberi mandulában a B-sejt follikulusok szélén elhelyezkedő CD19 + IgD + IgM + B-sejtek mutatják a legerősebb GL7-festődést. Más B-sejt populációk és T-sejtek sokkal kisebb mértékben expresszálták az epitópot. A GL7 raft-asszociációját a G M1 gangliozid lipid raft-markerrel való kolokalizációja és áramlási citometriával mért nagy mértékű detergens rezisztenciája is mutatja. 5 6

5 KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeink alapján az új koleszterin-specifikus IgG ellenanyagok képesek a membrán koleszterin klaszterek szelektív felismerésére, így jó markerei lehetnek a celluláris lipid raftoknak. Az immunsejtek membránjához kötődve képesek továbbá modulálni a koleszterin/lipid raft-függő immunfolyamatokat is, így segíthetnek a HIV-1 vírus kötődésének/bejutásának koleszterin-függését tisztázni. Alapját képezhetik továbbá új, kombinált, lipid raft-irányú terápiás megközelítéseknek. Ezen gátló hatás mellett az IgG ACHA-k más immunfolyamatokra is moduláló hatással lehetnek, melyek feltárása további vizsgálatokat igényel A GL7 ellenanyag esetében, mely egy sziálsav tartalmú epitópot (GL7) ismer fel, eredményeink az mutatják, hogy eltérés mutatkozik a GL7 epitóp expresssziós profiljában emberek és rágcsálók között. Jelenléte emberben is limfocita-korlátozott, azonban az egerekkel ellentétben, ahol aktiváció-függően jelenik meg, a humán sejteken konstitutíven expresszálódik. A GL7 epitóp specifikus expressziója és nagy mértékű raft-asszociációja arra enged következtetni, hogy az epitópnak és/vagy feltételezett receptor(ok)nak szerepe lehet a limfociták funkciójában. Az epitópot tartalmazó molekulá(k)nak és a felismerő receptor(ok)nak az azonosítása és jellemzése még további kísérleteket igényel. Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: 1. Adrienn Bíró *, László Cervenak *, Andrea Balogh *, András Lőrincz, Katalin Uray, Anna Horváth, László Romics, János Matkó, George Füst, Glória László: Novel anti-cholesterol monoclonal immunoglobulin G antibodies as probes and potential modulators of membrane raft-dependent immune functions Journal of Lipid Research : impakt faktor: 4, Imre Gombos, Gábor Steinbach, István Pomozi, Andrea Balogh, György Vámosi, Alexander Gansen, Glória László, Győző Garab, János Matkó: Some new faces of membrane microdomains: a complex confocal fluorescence, differential polarization, and FCS imaging study on live immune cells Cytometry A : impakt faktor: 3, Endre Kiss, Péter Nagy, Andrea Balogh, János Szöllősi, János Matkó: Cytometry of raft and caveola membrane microdomains: from flow and imaging techniques to high throughput screening assays Cytometry A : impakt faktor: 3, Zoltán Beck *, Andrea Balogh *, Andrea Kis, Emese Izsépi, Adrienn Bíró, Glória László, László Cervenak, Károly Liliom, Gábor Mocsár, György Vámosi, George Füst, Janos Matko: New cholesterol-specific antibodies remodel HIV-1 target cells surface and inhibit their in vitro virus production Journal of Lipid Research : impakt faktor: 4, Andrea Balogh *, Mónika Ádori *, Katalin Török, Janos Matko, Glória László: Closer look into the GL7 antigen: Its spatio-temporally selective differential expression and localization in lymphoid cells and organs in human Immunology Letters doi: /j.imlet impakt faktor: 2,858 * Az adott cikkben megosztott elsőszerzőség. 7 8

6 Egyéb közlemények: 1. Andrea Balogh, Judit Pozsgay, János Matkó, Tibor Várkonyi, János Rigó Jr, Zoltán Papp, Roberto Romero, Hamutal Meiri, and Nándor Gábor Than: Placental Protein 13 (PP13) / galectin-13 undergoes subcellular redistribution in preeclampsia and HELLP syndrome: an analysis with immunohistochemistry-based confocal microscopy (Cytometry A-ba publikálásra előkészített kézirat) Konferencia absztraktok: 1. Pozsgai M., Balogh A., Prechl J., László G.: A Ly77 (GL7) molekula szerkezeti és funkcionális vizsgálata scfv konstrukció segítségével XXXIV. MIT Vándorgyűlés, Sopron, M. Ádori, A. Balogh, Zs. Weiszhár, J. Prechl, J. Matko, G. László: Studies on Cell Specific Expression, Structure and Membrane Localization of a Late Lymphoid Activation Antigen Ly77 (GL7) 13 th Symposium on Signal and Signal Processing in the Immune System, Balatonőszöd, Hungary, M. Ádori, A. Balogh, Zs. Weiszhár, J. Prechl, J. Matko, G. László: Expression, Structure and Membrane Localization of Ly77 (GL7), a Supposed Adhesion Molecule, on Lymphoid and Myeloid Cells XXXV. Congress of Hungarian Scociety for Immunology, Sopron, Hungary, Balogh A., Lőrincz A., Cervenak L. László G., Matkó J.: Új monoklonális IgG anti-koleszterin ellenanyagok: koleszterin-gazdag membránok markerei és raft-függő immunfolyamatok potenciális modulátorai V. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, Balogh A., Lőrincz A., Cervenak L., Füst Gy., László G., Matkó J.: Új monoklonális IgG anti-koleszterin ellenanyagok: koleszterin-gazdag membránok markerei és raft-függő immunfolyamatok potenciális modulátorai XXXVI. Membrán-transzport Konferencia, Sümeg, A. Balogh, A. Lőrincz, G. László, J. Matko: Anti-cholesterol IgG antibodies: novel probes of clustered membrane cholesterol (microdomains) in intact cells 10 th Conference on Methods and Applications of Fluorescence, Salzburg, Austria, A. Balogh, A. Lőrincz, L. Cervenak, G. Füst, G. László, J. Matko: Anticholesterol IgG antibodies: novel probes and potential modulators of cholesterol-rich membrane microdomains 14 th Symposium on Signal and Signal Processing in the Immune System, Balatonőszöd, Hungary, A. Balogh, A. Lőrincz, G. László, J. Matko: Anti-cholesterol IgG antibodies: novel probes and modulators of cholesterol-rich membrane microdomains ISAC XXIV International Congress, Budapest, Hungary, A. Balogh, Z. Beck, G. Mocsár, G. László, G. Füst, J. Matko: Cholesterolspecific IgG monoclonal antibodies inhibit in vitro HIV production by remodeling plasma membrane of target cells XXXVII. Congress of Hungarian Scociety for Immunology, Budapest, Hungary, A. Balogh, E. Izsépi, G. Mocsár, G. Vámosi, G. László, J. Matko: Effect of new cholesterol-specific IgG antibodies on distribution and lateral mobility of HIV-receptors assessed by confocal and FCS imaging 11 th Conference on Methods and Applications of Fluorescence, Budapest, Hungary, A. Balogh, M. Adori, J. Matko, G. László: Comparative study of GL7 expression in mouse and human 2 nd European Congress of Immunology, Berlin, Germany, A. Balogh, A. Lőrincz, L. Cervenak, G. Füst, G. László, J. Matko: Anticholestreol IgG-s: Probes and Functional Modulators of Cholesterol-rich Membrane Micordomains 1 st European Congress of Immunology, Paris, France,