A Immorális ellenanyagok tanulmányozása nyulakban kísérletileg létesített Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780)-fertőzöttség esetén

Átírás

1 Parasit. Hung ?. A Immorális ellenanyagok tanulmányozása nyulakban kísérletileg létesített Cysticercus pisiformis (Bloch, 1780)-fertőzöttség esetén III. A primer és' szekunder fertőzöttségre adott ellenanyagválasz jellegzetessége Dr. NÉMETH István A Magyar Tudományos Akadémia Állategészségügyi Kutató Intézete, Budapest A Taenia pisiformis /Bloch, 1780/ Gmelin,l790 lárvaalakjával, a Cysticercus pisiformis /Bloch, l780/-szal /Cestoda: Taeniidae/ fertőzött nyulak vérsavójában a k i f e j l e t t galandférgek és a lárvaformák antigénkomponensei ellen ható ellenanyagok jelennek meg, amelyeket az eddig végzett vizsgálatok során gyürüs-precipitációs /14,77/, lárvaprecipitációs /70,71/, agargéldiffuziósprecipitációs /51,53,54/, komplementumkötési /77/, valamint indirekt hemagglutinációs próbával /51,77/ mutattak k i. E féregfaj inváziója nyomán a nyulakban kialakuló ellenanyagválasz jellemzőiről azonban még igen hiányosak az ismereteink, s arra vonatkozóan, hogy milyen immunglobulin-osztályba tartozó ellenanyagok termelődnek a fertőzés lefolyása során, nincsenek az irodalomban adatok. Mesterségesen fertőzött nyulak vérsavójával korábban végzett vizsgálatok kiderítették, hogy a T. pisi formis-oncosphaerák a nyulakban komplex precipitin-választ indukálnak /53,54/. A precipitin aktivitású vérsavók polispecifikus anti-nyul kecskeimmunsavóval, illetve T. pisiformis- és C. pisiformis-"somaticus" és "me tabolicus" 1 antigénekkel elvégzett immunelektroforetikus analízisének eredményeiből arra lehetett következtetni, hogy a precipitálo ellenanyagok az IgG immunglobulin-osztályba tartoznak /55/.

2 A T. pisiformis-oncosphaerákkal történő fertőzések nyomán kialakuló humorális ellenanyagválasz további tanulmányozása érdekében ujabb kísérleteket végeztünk, amelyek során mesterségesen fertőzött nyulakban a primer és szekunder fertőzésre jelentkező ellenanyag-termelés lefolyását, valamint a képződött ellenanyagok és az immunglobulinok közti kapcsolatot vizsgáltuk. Ez a közlemény ezeknek a vizsgálatoknak az eredményeit ismertet i. Anyagok és módszerek Antigének Az agargéldiffuziós-precipitációs próbában antigénekként T. pisi formis-kivonatot /TpK/ és C. pisiformis-kivonatot /CpK/ alkalmaztunk, amiket az előző közleményben leirtak szerint állítottunk elő /53, 54/. Az indirekt hemagglutinációs próbában használt antigén pedig LANCEFIELD /41/ eljárásával T. pisiformisból készült a korábban l e i r t módosítással /51/. I A T. pisiformis-petéket mesterségesen fertőzött kutyákból gyűjtött gravid féregizekből izoláltuk, a vándorló lárvákat és a k i f e j l e t t cysticercusokat pedig T. pisiformis-petékkel kísérletesen fertőzött nyulakból a korábban leirtak szerint gyűjtöttük /52,56/. Antiserumok A vizsgálatokhoz felhasznált. anti-t. pisiformis-nyulimmunsavó /anti~tp/, az anti-c.pisiformis-nyulimmunsavó /anti-cp/, a nyul serumfehérjéket precipitálo polispecifikus kecskeimmunsavó /anti-nyul kecskeimmunsavó/, a bispecifikus anti-nyul IgG és IgM juhimmunsavó, a monospecifikus anti-nyul IgG juhimmunsavó, a monospecifikus anti-nyul IgM juhimmunsavó, az anti-bovin-serumalbumin nyulimmunsavó /anti-bsa/, valamint az anti-humán-serum- 100

3 albumin nyulimmunsavó /anti-hsa/ előállítását már korábban leirtuk /53,54,55,56/. Ezeken kivül még a következő vérsavókat alkalmaztuk. Fertőzött nyulak vérsavója A vérsavók T«pisiformis-petékkel mesterségesen fertőzött nyulakból származtak. ötven 5-7 hetes korú, g sulyu, fehér uj-zélandi nyul közül negyvenet egyedenként 500 petével fertőztünk, 10 állat pedig nem fertőzött kontrollként szolgált. A fertőző peteadagot 5 ml térfogatban fecskendőre szerelt szondán át közvetlenül az állatok gyomrába adtuk be. A fertőzött csoportból 10 állatot, amelyek vérsavója az agargéldiffuziósprecipitációs próbában a CpK-val kifejezett precipitációt alakitott k i, a fertőzést követő 30. napon elvéreztettünk, a 60. napon pedig 15 nyulat petével ujrafertőztünk. A kisérlet 100. napján az összes nyulat leöltük, A fertőzés eredményének elbirálása, a Cysticercus-fertőzöttség intenzitásának meghatározása, illetve a kontrollcsoport esetében az esetleges spontán fertőzöttség kideritése érdekében minden nyulat felboncoltunk. Az első fertőzés időpontjától kezdve valamennyi állat fülvénájóból 7-10 naponként folyamatosan vért vettünk, A vérsavókat konzerválószer nélkül -20 C-on megfagyasztva tároltuk a f e l használásig, A sófrakcionáláshoz, a preparativ agargél-elektroforézishez és az anioncserélő kromatográfiához a fertőzések után egyazon időpontban vett vérsavókat egyenlő arányban kevertük. Minden más vizsgálatot egyedi vérsavókkal végeztünk. Kontrollként a nem fertőzött csoport állataiból vett vérsavókat használtuk. Féregantigénekkel és a képzett antigén-antitest lése velük reakcióba lépő ellenanyagokkal komplexek ellen ható immunsavók terme- Kakasokat immunizáltunk Taenia- és Cysticercus pisi forrnis-anti-

4 génekből és az ellenük ható nyul-ellenanyagokból álló antigénantitest precipitátumokkal. A precipitátumok előállításához háromféle vérsavókeveréket használtunk : I. keverék: az első fertőzést követő 30. napon leölt nyulak vérsavója,amelynek hemagglutinációs /HA/-titere 1:128, kvantitatív precipitációval meghatározott ellenanyag-fehérje-tartalma 0,19 mg/ml volt; I I. keverék: ráfertőzés után a 40. napon leölt nyulakból származó vérsavó, HA-titere 1:2048, ellenanyagfehérje-tartalma 0,96 mg/ml; I I I. keverék: egyenlő arányban kevert anti-cp és anti-tp nyulimmunsavó, amelynek HA-titere 1:16384, ellenanyagfehérje-tartalma 4,9 mg/ml volt. Az antigén-antitest komplexek képzéséhez történt felhasználás előtt a vérsavókeverékeket zsirtalanitottuk és dekomplementáltuk. A komplexek előállítása kétféle módon történt: 1. A vérsavókeverékbe fertőzőképes élő cysticercusokat helyeztünk, 50 ml vérsavóra 200 lárvát számitva, és a vérsavót 4 órán át 37 C-on, majd egy éjszakán át 4 C-on tartottuk. Másnap a cysticercusokat a vérsavóból eltávolítottuk, a precipitátumot 15 percig 3000-es percenkénti fordulat mellett lecentrifugáltuk és izotóniás konyhasóoldatban szuszpendáiva megőriztük. Ezután a vérsavóhoz friss cysticercusokat adtunk és a procedúrát azonos módon megismételtük. A müvelet során kapott precipitátumot összegyűjtöttük, a felhasznált vérsavó térfogatának 4-5-szörösét kitevő mennyiségű 2-4 C-os izotóniás konyhasóoldattal 5-6- szor alaposan mostuk és a mosás után 15 percig 3000-es percenkénti fordulattal centrifugáltuk. Az utolsó mosást és centrifugálást követően a precipitátumot 0,01 % mertiolátot tartalmazó izotóniás konyhasóoldatban szuszpendáltuk és 4 C-on tároltuk a felhasználásig.

5 2. Az előző bekezdésben leírttal teljesen azonos módon élő cysticercusokat inkubáltunk a vérsavóban,és a képződött precipitátumot összegyűjtöttük és megőriztük. Ezt követően a vérsavót ekvivalens arányban hoztuk össze a CpK és TpK antigénoldatok ana partes keverékével és 2 órán át 37 C-on, majd másnapig 4 C-on tartottuk. A két procedura során kapott precipitátumot összekevertük és a fentiekkel megegyező módon mostuk és tároltuk. A két különböző eljárással mindegyik vérsavókeverékből előállítottunk antigén-antitest precipitátumokat és ezekkel külön-külön immunize I t unk 3-3 fehér Leghorn kakast. Tiz mg fehérjét /összfeherje/ tartalmazó precipitátumot komplett Freund-adj u- vánsban + emulgeálva bőr alá oltottunk több helyre elosztva, majd négy hét múlva az oltást ugyanezzel az adaggal megismételtük. Egy hónap múlva az állatok 5 mg fehérjének megfelelő precipitátumot kaptak izomba konyhasóoldatban szuszpendálva, ötnaponként három alkalommal. A kakasokat az utolsó oltást követő napon véreztettük el, és a vérsavókat 0,01 % mertioláttal és 0,25 % fenollal konzerválva 4 C-on tároltuk. Az ellenanyagok kimutatása A féregantigének ellen ható antitesteket indirekt hemagglutinációs /IHA/, agargéldiffuziós-precipitációs és lárvaprecipitációs próbával mutattuk ki más közleményeinkben leirtak szerint /51,53,54,56/. Az egyes kisérleti csoportokban a vérsavók átlagos ellenanyagtiterét a vérsavók egyedi vizsgálatával kapott titerek kettes alapú logaritmusával számitottuk ki /39/. A vérsavók sófrakcionálását, zsirtalanitását, dekomplementálását, ellenanyag-tartalmuk meghatározását, továbbá a preparativ + Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA

6 agargél-elektroforézist, az anioncserélő kromatográfiát, az immunelektroforézist és a 2-merkapto-stanol /2-ME/-kezelést, valamint a fehérjemegnatározásokat további közleményünkben leírtakkal megegyező módon hajtottuk végre /55,56/. Eredmények A parazitológiai boncolás eredménye Az első fertőzést követő 100. napon végzett boncolás során a nem fertőzött kontrollcsoport állataiban sem cysticercusokat, sem lezajlott vagy folyamatban lévő Cysticercus-fertőzésre utaló kórbonctani elváltozásokat nem találtunk. A T. pisiformispetékkel fertőzött csoportban viszont minden nyúlban nagy számban fordultak elő cysticercusok. Az egyszer fertőzött állatokban átlagosan 211 /szélső értékek: /, a 60. napon ujrafertőzöttekben pedig átlagosan 397 /szélső értékek: / Cysticercus volt. Az előbbi csoport állataiban az élősködők végleges tartózkodási helyükön, zömmel a csepleszen és a medenceüreg hashártyáján betokozódott állapotban voltak találhatók, és teljesen kifejezett scolexszel rendelkeztek. Az ujrafertőzött állatokban a teljesen k i f e j l e t t borsókákon kivül véglegesen még meg nem telepedett, f i a t a l, vándorló cysticercusok is előfordultak szabadon a hasüregben. Ezek kétségtelenül a reinfekció során bevitt oncosphaerákból fejlődtek k i, mivel egyrészt a már betokozódott cysticercusoknál lényegesen kisebbek és fejletlenebbek voltak, másrészt a májban talált kórbonctani elváltozások jellegéből is erre lehetett következtetni. A kisérleti C. pisiformis-fertőzésre ellenanyagválasz jelentkező A hemagglutináló /HA/ ellenanyagok dinamikája A hemagglutini nek a fertőzöttség első hetében jelentek meg a vérsavókban, és már a 7. napon minden fertőzött állat vérsavója

7 tartalmazott, bár alacsony, átlagosan 1:5,9 /szélső értékek: 1:2-1:16/ titerben, HA-antitesteket* Ezután egészen a megfigyelési idő végéig, valamennyi megvizsgált vérsavóban ki lehetett hemagglutinineket mutatni days after infection fertőzés utáni napok 1. ábra Az ellenanyagok titerének alakulása 500 T. pisiformis-petével egyszer fertőzött nyulak vérsavójában. átlagos HA-titer... átlagos precipitin-titer A nyil a fertőzés időpontját jelöli. Fig. 1. Antibody pattern in serum of rabbits after a single infection with 500 T. pisiformis eggs. mean HA t i t r e mean precipitin t i t r e Arrow indicates the time of the infection. Az egyszeri fertőzés nyomán termelődött HA-antitestek dinamikáját az 1. ábra szemlélteti, amely 10 állatból különböző időpontokban vett vérsavók egyedenkénti vizsgálatával kapott titerek átlagértékeit tünteti f e l. Az első héttől kezdve a HA-ellenanyagok mennyisége fokozatosan emelkedett a vérsavókban, és az átlagtiter az 50. napon 1:512 /szélső értékek: 1:128-1:1024/ értékkel maximumot ért el. Ezután némileg csökkent, és a vérsa-

8 vók a megfigyelési idő végén /100 nappal a fertőzés után/ átlagosan 1:207,9 /szélső értékek: 1:64-1:512/ titerben hemagglutináltak. A kétszer fertőzött állatokban kialakult hemagglutinin-választ a 2. ábra demonstrálja, amely 15 nyul vérsavójának vizsgálatával kapott átlagos HA-titer alakulását tünteti f e l. Az ábrán 12 days after infections fertőzés utáni napok 2. ábra Az ellenanyagok titerének alakulása 500, majd T.pisiformis-petével fertőzött nyulak vérsavójában. -átlagos HA-titer... átlagos precipitin-titer A nyilak a fertőzés időpontját jelölik. Fig. 2. Antibody pattern in serum of rabbits infected f i r s t with 500 and later with T. pisiformis eggs. mean HA t i t r e mean precipitin t i t r e Arrows indicate time of infections.

9 jól látható, hogy a 60. napon T. pisiformis-petével végzett reinfekció után a HA-titer tovább,emelkedett, és a kisérlet 100. napján /40 nappal az ujrafertőzés után/ a vérsavók átlagosan 1:3743 /szélső értékek: 1:1024-1:8192/ titerben adtak reakciót. A p r e c i p i t á l o ellenanyagok dinamikája Precipitálo antitesteket legkorábban a fertőzést követő második héten lehetett a vérsavókban agargéldiffuziós-precipitációs próbával kimutatni. A vizsgált 25 állat közül a 14. napon 11, a 20. napon 16, a 30. naptól kezdve pedig egészen a megfigyelési idő végéig minden állat vérsavója precipitációt alakitott ki az agargélben a CpK-val mint antigénnel szemben. Amint az 1. és 2. ábrán látható, az átlagos precipitin-titer görbéjének lefutása nagyon hasonló volt a HA-titer görbéjéhez. Az átlagos precipitin-titer azonban mind az egyszer, mind a kétszer fertőzött állatcsoportban mindegyik vizsgált időpontban 2,8-5,3 kitevővel alacsonyabb volt, mint az azonos vérsavókkal kapott HA-titer. A reinfekciót követően a precipitálo ellenanyagok titere is e- melkedett, és a megfigyelési idő végére /40. nap a ráfertőzés után/ mintegy 3-3,5-ször nagyobb értéket ért el, mint a primer fertőzés után észlelt átlagtiter maximuma. Az ujrafertőzött állatok vérsavója ebben az időpontban átlag 1:116,7 /szélső értékek: 1:32-1:512/ titerben précipitait, szemben a csak egyszer fertőzöttekével, amely átlag 1:5,3 /szélső értékek: 1:2-1:16/ titerben adott reakciót. Ezenkivül a reinfekció után vett vérsavók által a CpK-val szemben az agargélben létesitett precipitációs sávok sokkal markánsabbak voltak, sőt ezek a vérsavók több antigénkomponens ellen ható precipitint tartalmaztak, mint a primer fertőzöttségből származók. Agargélben CpK-val reagáltatva őket ugyanis rendszerint három, esetenként négy precipitációs vonalat lehetett megfigyelni, mig az egyszer fertőzött

10 nyulak vérsavója többnyire csak egy, maximum pedig két vonalat alakitott k i. A hiperimmunizált nyulak vérsavójának ellenanyag-aktivitása A T. pisiformis-, illetve C. pisiformis homogenizátummal és teljes kivonattal mesterségesen immunizált nyulak nagy mennyiségben termeltek ellenanyagokat. Az általuk produkált anti-tp, illetve anti-cp immunsavók HA-titere 1:2-1:2 között ingadozott. Agargéldiffuziós-precipitációs próbában TpK-val, illetve CpK-val reagáltatva őket 6-9 jól kifejezett precipitációs vonalat alakitottak k i. Az immunglobulinok jellemzése egyszer, illetve kétszer fertőzött, valamint a mesterségesen immunizált nyulak vé rsavój ában Só frakcionálás A vérsavókat "egyharmad" ammóniumszulfát-telitéssel két részre frakcionáltuk. Az elkülönített frakciókat polispecifikus antinyul immunsavóval, valamint monospecifikus anti-igg, illetve anti-igm immunsavókkal immundiffúzióval és immunelektroforézissel analizáltuk, majd ellenanyagok jelenlétére megvizsgáltuk. Az "egyharmad" ammóniumszulfát-telitéssel précipitait euglobulin-frakció az immunglobulinokon kivül 2-4 béta- és alfa-globul i n motilitásu komponenst is tartalmazott. Az euglobulin-mentes savófrakcióban IgM globulint egyáltalán nem lehetett kimutatni, IgG globulint pedig vagy egyáltalán nem, vagy csak nyomokban tartalmazott. A szerológiai vizsgálatok eredményét feltüntető 1. táblázatból látható, hogy a megvizsgált teljes vérsavók mind az IHA-, mind az agargéldiffuziós-precipitációs próbában pozitiv reakciókat adtak, s ezenkivül az élő lárvákkal is kifejezett precipitációt

11 alakitottak k i. Az euglobulin-frakció minimális különbségekkel ugyanolyan erősségű reakciókat adott, mint a teljes vérsavó. Az euglobulintól megfosztott savófrakcióval viszont mindhárom szerológiai próbában minden esetben negativ reakciókat kaptunk. A vérsavók frakcionálása preparativ agargél-zónaelektroforézissel A vérsavókat 25 frakcióra szeparáltuk. Az egyes elkülönített frakciókban az IgG és IgM globulint monospecifikus anti-igg, illetve anti-igm immunsavókkal mikroimmundiffúzióval mutattuk ki és lokalizáltuk a ferogrammokbah, majd minden frakciót IHApróbával ellenanyagok jelenlétére megvizsgáltunk. Három különböző, vérsavóval végzett egy-egy. ilyen vizsgálat eredményét szemlélteti a 3. ábra. Az egyszer fertőzött nyulakból származó vérsavókban az ellenanyag-aktivitást egyetlen csúcs képviselte, amely a lassú elektroforétikus motilitásu IgG területére lokalizálódott. A HA-titer maximuma az IgG görbéjének csúcsával esett egybe. Az IgM területén egyetlen megvizsgált vérsavóban sem tudtunk ellenanyagokat kimutatni /3. ábra, felső diagram/. Ugyanez volt a helyzet, akár a fertőzöttség korábbi, akár a későbbi időszakából származó vérsavókat vizsgáltunk. Az ujrafertőzés után a 20., 30. és 40. napon levett vérsavók e- setében viszont az IgG lokalizáció csaknem teljes területére kiterjedően ki tudunk mutatni ellenanyagokat a ferogramokban. Az antitest-hatás ezekben a vérsavókban két maximumot mutatott, amelyek közül a nagyobb a lassúbb vándorlásu IgG csúcsának fel e l t meg, a kisebb viszont a gyorsabb elektroforetikus motilitásu IgG területére terjedt és az IgM lokalizációval esett egybe /3. ábra, középső diagram/. Különösen pregnánsan jelentkezett ez a mesterségesen immunizált nyulak magas ellenanyag-tartalmú vérsavójának vizsgálata során /3. ábra, alsó diagram/.

12 1. táblázat Table 1. Ammoniumszulfátos kisózással elkülönített serumfrakciókkal végzett szerológiai próbák eredménye Results of serological test with serum fractions separated by ammonium sulphate precipitation Napok a Teljes vérsavó Euglobulin Szupernatáns (Days after; (whole serum) (euglobulin) (supernatant) primer szekunder + + (pri (seconda HA- prec. HA- prec. HA- prec. mary) ry) fertoze (infect s után ion ) titer titer titer ( t i tre) lppt* ( t i t re ) lppt* ( t i t re ) lppt _ _ _ _ _ _ Magyarázat ; agargéldiffuziós-precipitációs próbával végzett titrálással meghatározva in vitro lárvaprecipitáció: + pozitiv, - negativ reakció Explanation: determined by titration in agar gel diffusion precipitin test in vitro larval precipitin test: + positive, - negative reaction

13 E vizsgálatok elvégzése után, mfigyelembe véve az IgG és IgM lokalizációját, a 25 frakcióból 3 keveréket készitettünk e Az 1. frakciókeverék a ferogramnak a csak IgG globulint tartalmazó részéből, az 1-7. /8./ frakciókból, a 2. frakciókeverék az IgM globulin és a gyors vándorlásu IgG területére eső részéből, a /8./ frakciókból állt, a 3. frakciókeverék pedig a megmaradt többi részt, frakciókat tartalmazta. Az összekeverés után a frakciókat pervaporizációval a frakcionált vérsavó eredeti térfogatára koncentráltuk, majd immunelektroforézissel analizáltuk, és ellenanyagokra megvizsgáltuk. Az immunelektroforetikus vizsgálatok szerint /4. ábra/ az 1. frakciókeverék kizárólag lassú elektroforetikus vándorlásu IgG globulint, a 2. frakciókeverék a gyors elektroforetikus vándorlásu IgG globulinon és az IgM globulinon kivül alfa- és béta-globulinokat tartalmazott, a 3. frakciókeverék pedig albuminból és alfa-globulinokból állt. Ellenanyagokat az 1. és 2. frakciókeverékben lehetett szerológiai módszerekkel kimutatni /2. táblázat/. Az egyszer fertőzött állatokból származó vérsavók esetében minden vizsgált időpontban a frakcionálás során visszanyert ellenanyag-aktivitást t e l jes egéezében az 1. frakciókeverék tartalmazta. A reinfekció u- tán vett vérsavók vizsgálatakor ezzel szemben a 2. frakciókeverékben is ki lehetett ellenanyagokat mutatni mind a három alkalmazott szerológiai módszerrel. E vérsavók esetében a visszanyert ellenanyag-aktivitás %-a volt az 1. frakciókeverékben, amely kizárólag IgG globulint tartalmazott. Az 1. frakciókeverékben levő ellenanyagok rezisztensek voltak a 2-ME-kezeléssel szemben. A 2. frakciókeverék ellenanyaghatását viszont a 2-ME-kezelés lényegesen csökkentette. A vérsavók frakcionálása DEAE-Sephadex A-50 anioncserélő kromatográfiával Ezzel a módszerrel végzett egy-egy frakcionálás eredményét az 5. és 6. ábra szemlélteti. A vérsavók eluciós görbéjén négy csúcsot lehetett megkülönböztetni.az IgG globulin a teljes elu-

14 FRAKCIÓK T SZAMA 3. ábra Ta e n i a- és Cysticercus pisi formis-antiqének ellen ható antitesteket tartalmazó nyulvérsavók preparativ zónaelektro forézise agargélben Felső diagram: A fertőzés után a 40. napon vett vérsavóminta. /HA-titer 1:256/. Középső diagram: A reinfekciót követő 40. napon vett vérsavóminta /HA-titer 1:2 048/. Alsó diagram: Anti-Tp hiperimmun nyulvérsavó /HA-titer 1:16384/ fehérjeeloszlás HA-titer

15 Preparative zone electrophoresis in agar gel of rabbit serum containing antibodies to Taenia and Cysticercus pisiformis antigens. Top: serum collected on day 40 of primary infection /HA t i t r e : 1:256/. Middle: serum collected 40 days after reinfection /HA t i t r e : 1: 2 048/. Bottom: anti-tp hyperimmune rabbit serum /HA t i t r e : li:16 384/. 4. ábra A preparativ agargél-zónaelektroforézissel szeparált serumfehé r j e-f rakciók immunelekt.~of orézises analizise. 1. Teljes vérsavó; 2, 3. és 4. a szeparált 1., 2., illetve 3. frakciókeverék. A precipitációs iveket polispecifikus anti-nyul kecskeimmunsavóval /A/ és anti-nyul IgG és IgM immunsavóval /B/ hivtuk elő. Fig. 4. Immunoelectrophoretic analysis of serum protein fractions separated by preparative zone electrophoresis in agar gel 1. whole serum; 2, 3 and 4. separated fractions 1, 2 and 3 respectively. Precipitin bands developed with goat antiserum to rabbit whole serum /A/ and with anti-rabbit IgG + IgM immune serum /B/. 5, ábra C. pisiformisszal fertőzött nyulak vérsavójának frakcionálása ioncserélő' oszlóp-kromatográ fiával DEAE-Sephadex A-50 anioncseré lőn. Grafikon: az első fertőzést követő 30. napon vett vérsavóminta /HA-titer 1:256/ oszlop-kromatogramja. Az egyes frakciók HA-titerét az oszlopok tüntetik f e l. fehérjeeloszlás 1 Immunelektroforézis: a lyukak számozása a frakciók számát jelöli. A precipitációs iveket polispecifikus ; anti-nyul kecskeimmunsavóval /A/ és anti-nyul IgG és IgM immunsavóval /B/ hivtuk elő.

16 Fractionation of serum from rabbits infected with C. pisiformis by anion exchange column chromatography on DEAE-Sephadex A-50. Graph: Column chromatogram showing distribution of HA antibodies in a serum sample /HA t i t r e 1:256/ collected on day 30 of primary infection. The HA titers of the fractions are represented by the bar graphs. protein distribution Immunoelectrophoresis: well numbers indicate fraction numbers. Precipitin bands developed with goat antiserum to rabbit whole serum /A/ and anti-rabbit IgG and IgM immune serum /B/. 6. ábra C. pisiformisszal fertőzött nyulak vérsavójának szeparálása ioncserélő oszlop-k roma tográ fiával DEAE-Sephadex A-50 anioncserélőn. Grafikon: a ráfertőzést követő 30. napon vett vérsavóminta /HAt i t e r 1:2048/ oszlop-kromatogramja.. Az egyes frakciók HA-titerét az oszlopok tüntetik f e l. 1 fehérjeeloszlás Immunelektroforézis: a lyukak számozása a frakciók számát jelöli. A precipitációs vonalakat polispecifikus anti=nyul kecskeimmunsavóval /A/ és anti-nyul IgG és IgM immunsavóval /B/ hivtuk elő. Fig. 6. Fractionation of serum from rabbits infected with C. pisiformis by anion exchange column chromatography on DEAE-SephadexA-50 Graph: Column chromatogram showing distribution of HA antibodies in a serum sample /HA t i t r e 1:2048/ collected 30 days after reinfection. The HA titers are represented by the bar graphs. protein distribution Immunoelectrophoresis: well numbers indicate fraction numbers. Precipitin bands developed with goat antiserum to rabbit whole serum /A/ and anti-rabbit IgG + IgM immune serum /B/.

17

18

19

20

21 7. ábra Taenia- és Cysti ce reus pisiformis~an tige nékkel mesterségesen immunizált nyulak vé'rsa'vó jábó'l képzett antigén-ellenanyag komplexek ellen kakasokban termelt immunsavók immunelektroforétikus analizise. Kevert normál nyulvérsavó elektroforetikus szétválasztása után a csatornákba teljes nyulsavó ellen ható kecskeimmunsavót /A/, a TpK, CpK és CpSE segítségével képzett antigén-ellenanyag precipitátum ellen termelt kakasimmunsavót /D/,illetve csak a CpSE segítségével képzett antigén-ellenanyag precipitátum ellen ható kakasimmunsavót^ /E/ töltöttünk. Fig. 7. Immunoelectrophoretic analysis of immune cock sera to antigenantibody complexes made from serum of rabbits a r t i f i c i a l l y immunized with Taenia and Cysticercus pisiformis antigens. After electrophoretic separation of pooled normal rabbit serum the troughs were f i l l e d with goat antiserum to rabbit whole serum /A/, with cock antiserum to antigen-antibody precipitates made with TpE, CpE and CpSE /D/, and with a cock antiserum to antigen-antibody precipitates made with only CpSE /E/. 8. ábra Cysticercus pisiformisszal fertőzött nyulak vérsavójából előállított antigén-ellenanyag komplexek ellen kakasokban termelt immunsavók immunelektroforetikus analizise. Kevert normál nyulvérsavó elektroforézise után a csatornákba a következő immunsavókat töltöttük. A TpK, CpK és CpSE segítségével a fertőzés után a 30. napon, illetve a ráfertőzést követő 40. napon nyert vérsavómintákból előállitott antigén-ellenanyag precipitátumok ellen.termelt kakasimmunsavók / I, i l l. H/.Csupán a CpSE segítségével a fertőzés után a 30. napon, illetve a ráfertőzést követő 40. napon vett vérsavómintákból képzett antigén-ellenanyag precipitátumok ellen termelt kakasimmunsavók /G, 1 illetve F/. Fig. 8. Immunelectrophoretic analysis of immune cock sera to antigenantibody complexes made from serum of rabbits infected with Cysticercus i pisiformis. After electrophoresis of pooled normal rabbit serum the troughs were f i l l e d with cock antisera to antigen-antibody precipitates made with TpE, CpE and CpSE from serum pools obtained 30 days after the primary infection /I/ and 40 days after reinfection /H/, and with cock antiserum to antigen antibody precipitates made with only the CpSE from serum pools obtained on day 30 of the primary infection /G/ and 40 days after the reinfection/f/,

22 ciós térfogat %-ában jelen volt, az IgM globulin pedig az eluciós térfogat 58 %-a és 94 %-a között foglalt helyet, A vérsavókat négy frakcióra szeparáltuk. Az immunelektroforétikus analizisek szerint /5. és 6, ábra/ az 1, frakció tisztán IgG-ből állt. Ez a frakció tartalmazta a serum IgG zömét, ami az eluciós görbe első csúcsában eluálódott, A 2, frakció az e- luciós görbe második csúcsában eluálódott IgG globulint és béta-globulinokat tartalmazott, A 3, frakció albuminból, valamint alfa- és béta-globulinokból állt, s ezenkivül gyors elektroforetikus vándorlásu IgG-t is tartalmazott. A 4. frakció pedig az összes IgM globulint és emellett sok más se rumkomponenst fogl a l t magába. Ez a frakció is szennyezett volt gyors vándorlásu IgG-vei. A szerológiai vizsgálatok eredményét a 3. táblázat tünteti f e l. Az egyszer fertőzött nyulakból származó vérsavók esetében a frakcionálás során visszanyert ellenanyag-aktivitás túlnyomó részét az 1. frakció tartalmazta. A 2. frakcióval kapott pozit i v reakciók az< eluciós görbe második csúcsában eluálódott IgG globulinnak tulajdonithatók. Ebben a frakcióban talált ellenanyag-aktivitás a visszanyert teljes antitest-hatásnak csupán 3-7 %-át tette k i. A 3. és 4. frakcióban egyetlen esetben sem tudtunk az alkalmazott szerológiai módszerek egyikével sem ellenanyagokat kimutatni. Ezzel ellentétben az ujrafertőzés után levett vérsavókban a visszanyert teljes hemagglutinin-aktivitás %-a az IgM globulint magába foglaló 4. frakcióban volt, noha e frakcióból a szennyezésként jelen levő IgG-t glutáraldehiddel inszolubilizált monospecifikum anti-igg immunsavóval adszorbeáltuk AVRA- MEAS és TERNYNCH /3/ leirása szerint. Precipitineket csak az 1. frakcióban lehetett kimutatni. Agargéldiffuziós-precipitációs próbában ez a frakció ugyanolyan precipitációs vonalat vagy vonalakat alakitott ki a CpK-val szemben, mint az eredeti vérsavó, s ezenkivül az élő cysticercusokkal is kifejezett precipitátumot hozott létre. A 4. frakció sem az agargéldiffuziós-precipitációs, sem a lá rvaprecipitációs próbával nem adott pozitiv

23 2. táblázat Table 2. Preparativ agargél-zónaelektroforézissel szeparált serumfehérjefrakciókkal végzett szerológiai próbák eredménye Results of serological tests with serum protein fractions separated by preparative zone electrophoresis in agar Napok (Days a fter) primer (primary; fertőz (infe és utána ction) 2. f: rakcióke verek (P raction 2) szekunder (secondary) 1. fra kei ókeve rék (Prac ition l ) + HAtite :r pr ec. ( t i t i e) lppt* + HAt i t er prec. ( t i tre ) lppt* 3. í 'rakciókev erek 0 fraction 3 ) + HA- prec. titc-sr (tit] re ) lppt* Magyarázat : ff agargéldiffuziós-precipitációs próbával végzett titrálással meghatározva in vitro lárvaprecipitáció: + pozitiv, - negativ reakció Explanation : + determined by titration in agar gel diffusion precipitin test s i n vitro larval precipitin test: + positive, - negative reaction - y -

24 reakciót. Az 1. frakcióban kimutatott ellenanyagok, reziszteneek voltak a 2-ME-kezeléssel szemben, a 4. frakció ellenanyag-aktivitását viszont a 2-ME-kezelés teljesen megszüntette /4. táblázat/. Az ellenanyagok 2-merkaptoetanol-érzékenysége A vérsavók ellenanyag-aktivitását IHA-próbával vizsgáltuk a 2- ME-kezelés előtt és után. A 2-ME-kezelt és a kontrollvérsavók által adott HA-titereket összehasonlító 5. táblázatból kitűnik, hogy a primer fertőzés után vett vérsavók HA-titerét a 2-ME-kezelés csak minimálisan változtatta meg. Ezzel szemben az ujrafertőzés után levett vérsavók által adott HA-titereket a 2-MEkezelés következetesen 2-3 kitevővel redukálta a kontrollokhoz viszonyi tva. Az antigén-antitest komplexek ellen ható immunsavók analizise A különböző antigén-ellenanyag komplexek ellen termelt egy-egy reprezentáns immunsavóval végzett immunelektroforetikus analízisek eredményeit a 7. és 8. ábra szemlélteti. E vizsgálatok kiderítették, hogy az anti-komplex antiserumok a nyulvérsavóból csak az immunglobulinokat precipitálták, más se rumkomponenssel egyetlen immunsavó sem reagált. A cysticercusok "secretum és excretum" antigénjeinek /CpSE/ felhasználásával képzett antigén-antitest komplexek ellen termelt immunsavók kizárólag az IgG precipitációs ivét alakitották ki az immunelektroforézis során, függetlenül attól, hogy a komplexek előállitása a primer fertőzés után vagy a szekunder fertőzés után vett vérsavókból /8. ábra G és F/, vagy akár a mesterségesen immunizált nyulak vérsavójából /7, ábra E/ történt. Ezzel szemben, amikor az antigén-antitest precipitátumokat a TpK, CpK és CpSE segítségével készitettük, a mesterségesen immunizált nyulak és az ujrafertőzött állatok vérsavójából előállitott komplexek ellen olyan antiserumok képződtek, amelyek az IgG globulin ivén kivül még egy

25 3. táblázat Table 3. A nyulvérsavókból DEAE-Sephadex A-50 anioncserélő kromatográfiával szeparált frakciók ellenanyag-aktivitása Antibody activity of protein fractions separated from rabbit serum by anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A-50 Napol c a (Days i if ter ) primer ( p r i mary ; fertői 'jée után (infí se tion) szekunder (secondary) HAt i t ( t i t ].. frakci 6 ( Fractior prec.+ er re ) i 1) HAt i t ( t i t 2. frakc:.6 ( Fraction 2) + prec. er re ) lppt Ä HAt i t e ( t i t 3. frakc 'Fraction + prec. r re ) ió 3) Ippt* _ lppt* 0 0 _ 0 0 _ _ 0 Ó _ 0 0 ' _ Magyarázat : + agargéldiffuziós-precipitációs próbával végzett titrálással meghatározva (Explana- (determined by t i t r a t i o n in agar gel diffusion precipitin test) tion) Ä i n yitro lárvaprecipitációs próba: + pozitiv, - negativ reakció (in vitro larval precipitin test: + positive, - negative reaction) anti-nyul IgG immunsavóval abszorbeált (absorbed with anti-rabbit IgG immune serum)

26 további precipitációs ivet is kialakitottak, ami az IgM globulinnak felelt meg /7. ábra D, 8. ábra H/. Ugyanakkor a primer fertőzöttségből származó vérsavókból ezekkel az antigénekkel képzett komplexek ellen termelt antiserumok szintén csak az IgG globulint precipitálták /8. ábra I /. Az IgG és IgM globulinokat egyaránt precipitálo anti-komplex antiserumokból az IgG ellenes antitesteket glutáraldehiddel inszolubilizált tiszta nyul-serum IgG-vel abszorbeálva, az immunsavók továbbra is megtartották reagáló képességüket az IgM globulinnal. A t i s z t i t o t t IgM globulinnal abszorbeált anti-komplex immunsavók viszont nem mutatták ki ezt a komponenst. Megbeszélés Az ellenanyagok dinamikája a primer és szekunder C. pisiformis-fertőzöttség során A T. pisiformis-oncosphaerák inváziójával szemben nyulakban k i alakuló ellenanyagválasz sajátosságaira vonatkozó ismereteink igen hiányosak. Ezideig csupán SUL'C és ISZMAGILOVA /77/ közölt a fertőzés lefolyása során képződő humorális ellenanyagok menynyiségi változásairól adatokat. Különböző erősségű fertőzéseknek kitett nyulakon végzett kísérletekben IHA-próbával, amelyhez CAMPBELL /13/-féle t i s z t i t o t t poliszacharid-antigént, i l letve gyürüs-precipitációs próbával, amelyhez TRAWINSKI /84/ leirása szerint készitett lárvakivonat-antigént használtak, e szerzők ellenanyagokat már néhány nappal a fertőzés után kimutattak a vérsavókban. A precipitációs próba már a második napon pozitiv volt, esetenként 1:10 7 titerben. Mindkét szerológiai reakció dinamikája a fertőzés lefolyása során hasonló mintát követett. A fertőzöttség napja között fordultak elő a legki fejezettebb reakciók, ettől kezdve a reakciók fokozatosan gyengültek és a fertőzés utáni napra rendszerint negativvá váltak. Tekintet nélkül a fertőzésre használt petedózisokra, a szerológiai reakciók dinamikája az egyes állatoknál nagyon hasonló lefolyást mutatott, a maximális titerek azonban

27 4. táblázat Table 4. A fertőzött nyulak vérsavójából anioncserélő krómatográfiával szeparált 1. és 4. frakció hemagglutinációs titere a merkaptoetanol-kezelé s után Haemagglutination titres of chromatographic fractions 1 and 4 of serum from infected rabbits after treatment with mercaptoethanol Napok a ráfertozés 1. f r a k c i ó 4. f r a k c i ó Ä után (Fraction l ) (Fraction 4) Ä (Days after infection ) Kontroll ME-kezelt Kontroll ME-kezelt (Control) (ME-treated) (Control) (ME-treated) ^ monospecifikus anti-nyul IgG immunsavóval abszorbeált (absorbed with anti-rabbit IgG immune serum)

28 a precipitációs próba esetében lényegesen magasabbak voltak, mint az IHA-próbával kapott titerek. Vizsgálataikban semmiféle összefüggést sem tudtak megállapítani a fertőző peteadagok nagysága és az ellenanyagok megjelenésének ideje, az ellenanyagok titere, valamint kimutathatóságuk időtartama között. Az ujrafertőzések a reakciók intenzitásában csak átmeneti erősödést idéztek elő, ami azonban egyáltalán nem volt arányos a fertőző dózissal, rendszerint hamar eltűnt, és a szekunder fertőzést követő napra mindkét reakció éppúgy negativvá vált, mint a primer fertőzés után. Az agargéldiffuziós-precipitációs és az IHA-próbával kimutatott ellenanyagok dinamikájára vonatkozóan ebben a dolgozatban közölt vizsgálataink eredményei több tekintetben ellentmondanak SUL'C és ISZMAGILOVA /77/ emiitett megállapításainak.igy a hemagglutininek a fertőzöttség első hetében jelentek meg a vérsavókban, és a 7. naptól kezdve valamennyi nyul vérsavója kimutatható mennyiségben tartalmazott HA-antitesteket. Precipitineket viszont a fertőzés utáni napnál korábban egyetlen e- setben sem tudtunk a vérsavókban agargéldiffuziós-precipitációval CpK segítségével kimutatni. Tizenöt-husz nap múlva is csak az állatok egy részének vérsavója alakitott k i, többnyire igen halvány precipitációs vonalat, a 30. naptól kezdve viszont már minden nyul vérsavója précipitait. A legki fejezettebb precipitációs sávok a nap között fordultak elő. Ezt követően fokozatosan gyengültek, de még 100 nappal a fertőzés után is /az utolsó vizsgált időpontban/ minden kisérleti állat vérsavója precipitációt hozott létre agargélben. A precipitációs sávok erősségében a fertőzés különböző időszakában észlelt eltérés párhuzamos volt a vérsavók precipitin-titerével : a legmagasabb titerü vérsavók alakították ki a legmarkánsabb precipitációs sávokat, és megforditva. A hemagglutininek és a precipitinek mennyiségének alakulása az átlagos éllenanyagtiterek görbéinek lefutása tekintetében a fertőzés lefolyása során mind az egyszer, mind a kétszer fertőzött állatcsoportban hasonló volt, a precipitin-ti ter azonban minden esetben mintegy 3-5 kitevővel alacsonyabb volt, mint a

29 5. táblázat Table 5. A merkaptoetanol-kezélés hatása a primer és szekunder fertőzés után vett nyulvérsavók hemagglutinációs titerére Effect of mercaptoethanol treatment of haemagglutinat ion titres of whole rabbit sera obtained after primary and secondary infection Napot : a (Days Ê primer (primary) ifter ) szekunder (secondary) fertőd és után (infec,tion Az állatok száma N of animal s Átlag HA-i ïiter (-logg) az ME--kezelés (mean HA t:.tre /-log 2 /) ME-trí îatment előtt (bef ore) után (after) ME-érzékenység x (ME-sensitivity) Ä ,7 2,5 0, ,6 3,2 0, ,4 5,1 0, ,2 7,0 0, , , ,7 8,6 0, ,1 7,7 0, ,7 7,5 0, ,1 7,2 1, ,4 8,0 2, ,3 8,4 2, ,9 8,8 3,1 x az ME-kezelés előtt és után kapott átlagtiterek különbsége (differences between mean HA titre before and after ME-treatment)

30 HA-titer. A precipitin- és a HA-titerek nagyságában észlelt különbségeket és azt a megfigyelésünket, hogy az IHA-próbával jóval korábban, már az első héten ki lehetett ellenanyagokat mutatni a vérsavókban, a két szerológiai próba jól ismert eltérő érzékenysége magyarázza. Az egyszeri fertőzés után az átlagos ellenanyagtiter alakulására jellemző volt, hogy a fertőzöttség második hetétől kezdve a vérsavók ellenanyag-tartalma fokozatosan emelkedett, és a maximumot a nap között érte el. Ebben az időszakban fordultak elő a legmagasabb ellenanyagtiterek, amelyek a precipitációs próba esetében soha nem haladták meg az antigénként használt 10 mg/ml fehérjetartalmú CpK törzsoldat 1:128-as higitását, az IHA-próbában pedig a vérsavók maximálisan az 1:1024-es higitásban adtak teljes hemagglutinációt. A fertőzöttség 70. napjától az ellenanyagtiter csökkenni kezdett, ami különösen a precipit i n - t i t e r esetében volt nagyon határozott, azonban még a 100. napon is minden nyul vérsavója mindkét szerológiai próbával k i mutatható mennyiségben tartalmazott ellenanyagokat. Az ellenanyagok titerének a 9-10.héttől bekövetkező csökkenése feltehetően a cysticercusok fejlődésével áll szoros összefüggésben, a- mint azt az előző közleményünkben kifejtettük /54/. Az ujrafertőzött nyulak vérsavójával kapott eredmények alapján SUL'C és ISZMAGILOVA /77/ megállapításaival ellentétben egyértelműen arra következtethettünk, hogy az oncosphaerák ismételt támadása nyomán a nyulakban fokozott mértékű ellenanyag-termelés indul meg, ami nyilván a reinfekció szolgáltatta ujabb antigénstimulusra vezethető vissza. Az ujrafertőzésre jelentkező "másodlagos immunválasz" során az ellenanyagok mennyisége újra emelkedett a vérsavókban, és a legutolsó vizsgált időpontban /40. nappal a reinfekció után/ az átlagos ellenanyagtiter lényegesen magasabb értéket ért el, mint a primer fertőzés után észlelt maximális átlagtiter. Ezenkivül az immundiffúziós analízisek tanúsága szerint az ujrafertőzött nyulak vérsavója több antigénkomponens ellen ható ellenanyagokat tartalmazott, mint a csak egyszer fertőzött állatoké.

31 Az ellenanyagok dinamikáját illetően SUL'C és ISZMAGILOVA /77/ megállapításai és a saját észleleteink között láthatóan igen nagy az eltérés, ami nem magyarázható meg a kisérleti állatok eltérő egyedi reagálóképességével és a felhasznált peteanyag különbözőségével. Ennek oka minden valószinüség szerint elsősorban az alkalmazott szerológiai módszerek eltérő érzékenységében, de legfőképpen az eltérő antigénpreparátumok használatában keresendő. Vizsgálatainkban a vérsavók ellenanyag-aktivitása nyulanként lényegesen eltért, sőt azonos állat esetében is a fertőzöttség korától és a fertőzések számától függően erősen változott, ami a nyulak eltérő egyedi reagálóképessége mellett elsősorban arra vezethető vissza, hogy a fertőzések eredményeként az egyes állatokban, amint azt a primer fertőzést követő 100. napon végzett boncolás kideritette, különböző számú élősködő fejlődött ki és telepedett meg. A különböző számú egyedből álló Cysticercus-populációk nyilván eltérő mennyiségű antigénhatásu anyagot produkálhattak, ami viszont kvantitative eltérő ellenanyag termelődésére vezetett. A fertőzések után különböző időben vett vérsavók CpK-val mint antigénnel elvégzett agargéldiffúziós analízisének eredményei alapján az a következtetés vonható le, hogy a T. pisiformis-oncosphaerák inváziója nyulakban komplex ellenanyagválaszt indukáli ami megerősiti korábbi megfigyeléseinket /53,54/ és összhangban van más féregfertőzöttségek esetében tett hasonló megállapításokkal /lásd pl. 6,31,32,33,34,35,42,50,73,88,89/. A fertőzött állatok vérsavójában minimum négy antigénkomponens ellen ható antitest fordul elő. Valamennyi állat vérsavója legalább egy antigénkomponenssel reagált, emellett az egyszer fertőzött nyulak vérsavójában az agargéldiffuziós-precipitációs próbában maximálisan két, a reinfekciót követően vett vérsavókkal ezzel szemben az esetek többségében három, maximum pedig négy antigén-ellenanyag rendszert sikerült kimutatni. Az a tény, hogy a fertőzés különböző stádiumaiban a vérsavókban eltérő számú antigénösszetevővel reagáló ellenanyagok fordultak

32 elő, és hogy az ujrafertőzött állatok szélesebb antigénspektrum ellen ható antitesteket produkáltak, a cysticercusok fejlődésével összefüggésben levő kvalitativ antigénkülönbségekre utalhat. Lehetséges ugyanis, hogy az egyszer fertőzött állatok vérsavójában ki nem mutatott antitest-tipusok termelődésének megindításáért felelős antigének a primer fertőzés során egyáltalán nem képződnek, hanem csak a reinfekcióval bevitt és a megelőző fertőzés nyomán már bizonyos fokú immunitásra szert tett gazdaszervezetben elpusztuló parazitákból szabadulnak f e l. Az is lehetséges azonban, hogy pusztán kvantitativ különbségekről van szó, amennyiben ezek az antigénkomponensek a primer fertőzés folyamán is képződnek ugyan, de mennyiségük alatta marad annak a küszöbértéknek, ami az agargéldiffuziós-precipitációyal kimutatható ellenanyag-mennyiség termelődésének kiváltásához szükséges. Ezt a küszöbértéket csak a reinfekcióból származó u- jabb antigénstimulussal érjük el. Mindezekre a kérdésekre vonatkozóan azonban egyelőre nem rendelkezünk semmilyen közvetlen bizonyítékokkal. Végleges tisztázásuk még további részletes vizsgálatokat igényel. Az immunglobulinok és az ellenanyagok a primer és szekunder C. pisiformis-fertőzöttség esetén A nyulakban jelenleg három immunglobulin-osztály, az IgG, IgM és IgA ismert, amelyek a nehéz polipeptid-láncaik szerkezeti és ezáltal antigén-differenciái alapján különíthetők el /16,18,19, 74/. Ellenanyagokat mind a három immunglobulin-osztályban kimutattak /2,15,57,58,59,63, 66/86/. Általában azt tartják, hogy a primer antigénstimulusra adott válaszként a nyulak bármelyik antigén ellen mind a három immunglobulin-osztályba tartozó antitesteket termelhetnek, de az a- dott szituációk speciális körülményeitől függően egyik vagy másik ellenanyag-tipus dominál /2,27,57,61,66,86/. A másodlagos immunválaszt elsősorban IgG tipusu ellenanyagok gyors termelődése jellemzi, de anamnesztikus reakciót az IgM- és IgA-ellenanyagok képződésében is megállapítottak /1, 8, 12, 36, 66, 85/.

33 Arra vonatkozóan, hogy a C. pisiformis-fertőzöttséqre adott immunválasz folyamán termelődő ellenanyagok melyik immunglobulinosztályba tartoznak, az irodalomban nincsenek adatok. A fertőzött nyulak vérsavójával végzett sófrakcionálásos vizsgálataink eredményei világosan mutatják, hogy az euglobulinfrakció teljes egészében tartalmazza az IHA-, az agargéldiffuziós-precipitációs és a lárvaprecipitációs próbával kimutatható ellenanyagokat. Az euglobulin kisózása után a vérsavók teljesen elveszítették eredeti szerológiai aktivitásukat. Az euglobulinfrakcióban észlelhető volt ugyan némi t i tercsökkenés a teljes vérsavó ellenanyag-aktivitásához viszonyítva, ez azonban részben a szerológiai próbák módszeres hibájának, részben pedig a kisózással kapcsolatos globulin-veszteségnek tulaj donitható. A preparativ agargé1-elektroforézissel, az ioncserélő kromatográfiával és az immunelektroforézissel végzett vizsgálataink, valamint a merkaptoetanol-kezelés eredményei szerint a T. pisiformis-oncosphaerákkal mesterségesen fertőzött nyulakban nem lehetett, legalábbis az ellenanyagok kimutatására általunk alkalmazott módszerekkel, egy "korai IgM" és egy "késői IgG" ellenanyagválaszt kimutatni, ami a tipikus ellenanyagválasz számos antigén esetében /7,8,10,75,79,81/. Több adat is bizonyitja azonban, hogy az IgM- és az IgG-ellenanyagok termelődése nem szekvenciálisan, hanem szimultán megy végbe, sőt az IgG-antitestek az IgM tipusuaknál korábban is megjelenhetnek /1,2,9,27, 60,63,68,86/; máskor viszont az antigén kémiai természetétől, formájától és az adagjától függően kizárólag prolongált IgMellenanyag-termelés észlelhető, amit egyáltalán nem követ az IgG-ellenanyagok képződése /8,67,78,79,80,85,87/. Vizsgálataink során a vérsavókban legkorábban a fertőzöttség első hetében k i mutatott ellenanyagokat az IgG globulinnal lehetett azonosítani. A primer fertőzöttség későbbi időszakában is csak IgG tipusu ellenanyagok fordultak elő, amelyekre jellemző volt, hogy az agargéldiffuziós-precipitációs és a lárvaprecipitációs, valamint az IHA-próbával egyaránt kimutathatók, a DEAE-Sephadex A-50 anioncserélő kromatográfia során csaknem teljes egészükben

34 az eluciós görbe első csúcsát alkotó frakciókban jelentek meg, amelyek kizárólag IgG globulint tartalmaztak; ellenanyag-aktivitásukat a redukálás és az alkilezés nem változtatta meg. A primer fertőzöttségből származó vérsavókban egyik módszerrel sem tudtunk IgM tipusu antitesteket kimutatni. A szekunder fertőzés után is IgG tipusu ellenanyagok domináltak a vérsavóban, a reinfekciót követő 20. naptól azonban egészen a megfigyelési idő végéig /40. nap a rá fertőzés után/ minden vizsgált vérsavóban IgM tipusu ellenanyagokat is sikerült kimutatni. Az IgM-ellenanyagok jelenlétét vizsgálataink több eredménye is igazolta. Ezt bizonyította a vérsavók merkaptoetanol-kezelésének eredményei. DEUTSCH és MORTON /23/ vizsgálatai óta ugyanis az IgM globulin 2-ME-érzékenységét és az IgG globulin viszonylagos 2-ME-stabilitását a két immunglobulin-osztályba tartozó ellenanyagok elkülönítésére alkalmas módszernek tekintik. Vizsgálataink során a 2-ME-kezelés /alkilezéssel/ a primer fertőzöttségből származó vérsavók ellenanyag-aktivitását csak minimálisan változtatta meg, a reinfekció után vett vérsavók ellenanyaghatását viszont kifejezetten redukálta. Az IgG és az IgM tipusu ellenanyagokat DEAE-Sephadex A-50 anioncserélő kromatográfiával sikerült egymástól elkülöníteni. A 2-ME-érzékeny ellenanyagok, amelyek a frakcionálás során visszanyert ellenanyag-aktivitásnak mindössze %-át képviselték, az anioncserélőről az IgM-et tartalmazó frakciókban e- luálódtak. Noha ezek a frakciók, amint ezt az immunelektroforetikus analizisek is kiderítették, gyors elektroforétikus vándorlásu IgG-t is tartalmaztak kis mennyiségben, ellenanyag-aktivitásukat akkor is megtartották, ha az IgG-molekulákat monospecifikus anti-igg immunsavóval abszorbeáltuk. Az abszorbeálást követően végzett 2-ME-kezelés pedig a szerológiai aktivitást teljesen megszüntette. Ezzel ellentétben az IgG-vel eluálódott ellenanyagok, amelyek a vérsavó ellenanyag-aktivitásának zömét képviselték, rezisztensek voltak a 2-ME-kezeléssel szemben. 128

35 Az IgM-ellenanyagok jelenlétét igazolták a féregantigének segítségével az ujrafertőzött nyulak vérsavójából előállított antigén-antitest komplexek ellen termelt immunsavókkal kapott e- redmények i s. Az ilyen anti-komplex immunsavók immunelektroforetikus analíziséből ugyanis kiderült, hogy a Taenia- és Cysticercus pisiformis-antigének ellen nyulakban képződő ellenanyagok antigén-ellenanyag komplex formájában heterológ állatokba oltva olyan antitestek produkcióját váltották k i, amelyek a normál nyulvérsavó immunelektroforézise során az IgG globulinon kivül még egy másik serumkomponenssel is reagáltak, amit az IgM globulinnal lehetett azonositani az immunelektroforetikus kép és a következő megfontolások alapján. Az anti-komplex immunserummal kimutatott ez a második komponens nem lehetett a nyulkomplementum valamelyik összetevője, mivel a komplexek képzése előtt a vérsavókat dekomplementáltuk. Megállapították, hogy 32 y\ig övalbuminnak és 288 yug anti-ovalbuminnak 1 ml anti-bsa nyulsavóhoz való adása teljesen eltávolitja a komplementumot /83/, mi pedig ennek a mennyiségnek közel kétszeresét alkalmaztuk vizsgálatainkban, és a kezelést megismételtük. A komplexbe v i t t IgG globulin könnyü-láncai ellen termelődött ellenanyagok következménye sem lehetett, mert ha az anti-komplex immunserumokból az IgG-ellenes antitesteket immunkémiailag tiszta IgG-vel abszorbeáltuk, az immunsavók továbbra is kimutatták ezt a komponenst. Tisztitott IgM-mel történt abszorbeálás után viszont az anti-komplex immunsavók elveszítették reagálóképességüket ezzel a komponenssel. Mindezek pedig azt bizonyitják, hogy az antigén-antitest komplexekkel való immunizálás folyamán az IgG globulinnal reagáló ellenanyagokon kivül az IgM globulinra specifikus antitestek is termelődtek. Az agargéldiffuziós-precipitációs módszert alkalmazva csak az IgG globulint tartalmazó frakció precipitálta a CpK-t mint antigént. Az IgM globulint tartalmazó frakciók ezzel szemben e- gyetlen esetben sem hoztak létre látható precipitációt, jóllehet az IHA-próbával kimutatható mennyiségben tartalmaztak ellenanyagokat. Ez az észleletünk ellentétben látszik állni az anti-komplex immunsavók vizsgálatával kapott és a fentebb megvitatott eredményekkel, amelyek azt mutatták, hogy az ujrafer-