Celluláris és Molekuláris Élettan Doktori Program

Átírás

1 Celluláris és Molekuláris Élettan Doktori Program AZ AT 1A -ANGIOTENZINRECEPTOR INTERNALIZÁCIÓJÁNAK MECHANIZMUSA Gáborik Zsuzsanna Témavezető: Dr. Hunyady László, egyetemi docens Semmelweis Egyetem Élettani Intézet Budapest 2001

2 ÖSSZEFOGLALÁS Az angiotenzin II fő élettani hatásait közvetítő AT 1 -angiotenzinreceptor a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok családjába tartozik. E receptorok érzékenységének szabályozásában több párhuzamos folyamat is szerepet játszik. A receptor aktiválódását követően a molekula foszforilálódik és deszenzitizálódik. A receptor érzékenységének helyreállítása (a reszenzitizáció) a receptor internalizációját követően jön létre. Mindkét folyamatban fontos szerepe van a ß-arresztineknek, melyek a foszforilált receptort szétkapcsolják a G-fehérjétől, majd a deszenzitizált receptort klatrin burkos gödröcskékhez irányítják. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy COS-7 sejtekben expresszált AT 1 -receptor karboxiterminális régiójának eltávolítása nem befolyásolta a receptor jelátvitelét, annak ellenére, hogy a receptorendocitózis sebességének jelentős csökkenését eredményezte. Munkacsoportunk korábbi adatai arra utaltak, hogy a receptor ezen régiójának agonista hatására történő foszforilációja feltétele a receptor endocitózisának. Az AT 1 -receptor a hormon legtöbb célsejtjében a klatrin mediált endocitózis útján kerül felvételre, azonban a ß-arresztinek szerepe a folyamatban vitatott volt. Kimutattuk, hogy a ß-arresztin-1 csökkent receptor affinitású (V53D), és a klatrinkötő régió eltávolításával nyert (1-349) mutánsait CHO sejtekben expresszálva az AT 1A -receptor endocitózisának gátlását okozták. A dinamin GTP-áz deficiens (K44A) mutánsának expresszálása szintén a receptorendocitózis sebességének csökkenését okozta CHO sejtekben. A receptorendocitózis folyamata nem volt sejtfüggő, ugyanis hasonló gátlást tapasztaltunk COS-7 és HEK-293 sejtekben is. Ez a gátló hatás fiziológiás angiotenzin II koncentrációknál jól kifejezett volt. Az agonista koncentráció növelésével azonban csökkent az agonista kötött receptorok közül az endocitózisra kerülők hányada. A 30 nm angiotenzin II koncentráció által indukált receptorendocitózis sebességét a ß- arresztin-1(1-349) és a dinamin-2(k44a) mutánsok expressziója nem csökkentette tovább. Vad típusú ß-arresztin expressziója azonban részben helyreállította a receptor endocitózisát. Adataink azt mutatják, hogy fiziológiás angiotenzin II koncentrációknál az AT 1 -receptor endocitózisa döntően ß-arresztin- és dinamin-függő mechanizmussal történik. Magas agonista koncentrációknál azonban az endogén ß-arresztin és egyéb, a klatrin mediált endocitózisban szerepet játszó fehérjék mennyisége limitálhatja a receptorendocitózis sebességét. 2

3 SUMMARY The AT 1 angiotensin receptor, which mediates the major physiological actions of angiotensin II, is a member of the G protein-coupled receptor (GPCR) family. The responsiveness of these receptors are regulated by multiple mechanisms. Agonist induced activation of GPCRs followed by phosphorylation and desensitization of the receptor. Resensitization of many GPCRs requires the agonist-induced endocytosis of the receptor. ß-arrestins have multiple functions since these molecules bind to the phosphorylated receptor and uncouple it from G-protein, and at the same time they also target the desensitized receptor to clathrin-coated pits. Although deletion of the C-terminal tail did not inhibit the signaling of the AT 1 receptor expressed in COS-7 cells, but impaired the endocytosis of the receptor. These findings are in good accordance with studies that agonist-induced phosphorylation of the receptor regulates its internalization kinetics. Several studies have suggested that agonist-induced endocytosis of the AT 1 receptor occurs via clathrin-coated pits, but the involvement of ß-arrestins in the receptor internalization process is controversial. In our experiments overexpression of ß-arrestin-1(V53D) mutant, which has reduced ability to bind to GPCRs, and ß-arrestin-1(1-349), in which the clathrin and the AP-2 binding domains are deleted, exerted inhibitory effects on the endocytosis of the AT 1 receptor. Coexpression of GTPase-deficient (K44A) mutant forms of dynamins also inhibited the endocytosis of the AT 1 -receptor in CHO cells. Similar results were obtained in COS-7 cells and HEK-293 cells. These inhibitory effects were only observed at physiological angiotensin II concentration. Studies on the angiotensin II concentration-dependence of the AT 1 -receptor endocytosis showed that at higher agonist concentrations its rate constant was reduced, and the inhibitory effects of dominant negative ß-arrestin and dynamin constructs were abolished. Furthermore, overexpression of wild-type ß-arrestin partially rescued the impaired internalization kinetics of the AT 1 receptor at 30 nm Ang II concentration. These data indicate that endocytosis of the AT 1 receptor is ß-arrestin and dynamin-dependent at physiological hormone concentration, but other mechanisms may dominate at higher agonist concentrations, since the ß-arrestin mediated pathway becomes saturated at high levels of receptor occupancy. 3

4 PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK Az értekezés alapját képező közlemények: I. Gáborik, Zs.; Mihalik, B.; Jayadev, S.; Jagadeesh, G.; Catt, K.J.; Hunyady, L.: Requirement of membrane-proximal amino acids in the carboxyl-terminal tail for expression of the rat AT 1a angiotensin receptor. FEBS Lett. 428: , (1998). IF: 3,581. II. Gáborik, Zs.; Szaszák, M.; Szidonya, L.; Balla, B.; Paku, S.; Catt, K.J.; Clark, A. J. L.; Hunyady, L.: ß-arrestin- and dynamin-dependent endocytosis of the AT 1 angiotensin receptor. Mol. Pharmacol. 59: , (2001). IF: 5,465 Az értekezéshez kapcsolódó egyéb közlemények: III. Hunyady, L.; Ji, H.; Jagadeesh, G.; Zhang, M.; Gáborik, Zs.; Mihalik, B.; Catt, K.J.: Dependence of AT 1 angiotensin receptor function on adjacent asparagine residues in the seventh transmembrane helix. Mol. Pharmacol. 54: , (1998). IF: 5,428. IV. Smith, R.D.; Baukal, A.J.; Zolyomi, A.; Gaborik, Zs.; Hunyady, L.; Sun, L.; Zhang, M.; Chen, H.-C.; Catt, K.J.: Agonist-induced phosphorylation of the endogenous AT 1 angiotensin receptor in bovine adrenal glomerulosa cells. Mol. Endocrinol. 12: , (1998). IF: 7,853. V. Fierens, F.L.P.; Vandeheyden, P.M.L.; Gáborik, Zs.; Minh, T.L.; De Backer, J.-P-; Hunyady, L.; Ijzerman, A.; Vauquelin, G.: Lys 199 mutation of the human angiotensin type 1 receptor differentially affects the binding of surmountable and insurmountable non-peptide antagonists. J.Renin-Angiotensin-Aldosterone System 1: , (2000). VI. Hunyady, L.; Catt, K.J.; Clark, A.J.L.; Gáborik, Zs.: Mechanisms and functions of AT 1 angiotensin receptor internalization. Regul. Pept. 91: 29-44, (2000). IF: 1,827. VII. Hunyady, L., Gáborik, Zs., Vauquelin, G., Catt, K.J.: Structural requirements for signalling and regulation of AT 1 -receptors. J.Renin-Angiotensin-Aldosterone System 2:S16-S23, (2001). 4

5 TARTALOMJEGYZÉK Összefoglalás 2 Summary 3 Publikációs jegyzék 4 Tartalomjegyzék 5 Rövidítések, jelölések 6 Bevezetés 7 Célkitűzések 9 Irodalmi háttér 10 Az angiotenzin II receptorok áttekintése 10 A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezeti és működésbeli hasonlósága 12 A receptorendocitózis 14 A receptorinternalizáció molekuláris mechanizmusa 14 Az AT 1 -angiotenzinreceptor endocitózisa 20 Módszerek 23 Eredmények 27 A receptor karboxi-terminális régiójának szerepe a receptorműködés szabályozásában 27 Az AT 1 -receptor internalizációjának mechanizmusa 29 Megbeszélés 41 A karboxi-terminális régió a receptorfehérje expressziójában és a receptor endocitózisában játszik szerepet 41 Az AT 1 -receptor endocitózisának mechanizmusa 42 Az endocitózis klatrin-burkolt vezikulákon keresztül történik 42 A receptorendocitózisban részt vesznek a ß-arresztin és dinamin fehérjék 43 Az AT 1 -receptor endocitózisát befolyásolja az agonista koncentrációja 44 Köszönetnyilvánítás 49 Irodalomjegyzék 50 Publikációk különlenyomatai 61 5

6 RÖVIDÍTÉSEK, JELÖLÉSEK Ang II Angiotenzin II Fluo-Ang II Fluorenszceinnel jelzett Ang II AT 1 -R egyes típusú angiotenzin II receptor AT 2 -R kettes típusú angiotenzin II receptor G-fehérje GTP-kötő fehérje IP 3 inozitol-triszfoszfát IP 2 inozitol-biszfoszfát k e endocitotikus sebességi állandó (perc -1 ) 7TM-receptor hét transzmembrán domént tartalmazó receptor CHO kínai aranyhörcsög ovárium eredetű sejtvonal HEK-293 humán embrionális vese eredetű sejtvonal COS-7 majomvese eredetű sejtvonal GRK G-fehérjéhez kapcsolt receptor kináz MAPK mitogén aktivált protein-kináz PKC protein-kináz C AP-2 adapter fehérje-2 Ábrajelölések: Az értekezés végén található két saját közlemény ábráira a közleményt jelölő római számmal és a közlemény eredeti ábraszámozásával hivatkozom. Az értekezés saját ábráit arab számokkal jelöltem. 6

7 BEVEZETÉS A vérkeringés és a só-vízháztartás szabályozásában alapvető szerepet játszó reninangiotenzin rendszer meghatározó effektor molekulája az oktapeptid angiotenzin II, mely a vérben keringő angiotenzinogénből renin és angiotenzin konvertáló enzim hatására keletkezik. Az Ang II a keringő hormon hatása mellett egyes szövetekben parakrin módon, a központi idegrendszerben pedig neurotranszmitterként is kifejti hatását. A szövetekben az Ang II élettani és terápiás szempontból fontos hatásait sejtfelszíni receptorok közvetítik, melyeknek emberben két típusa különíthető el: az egyes (AT 1 ) és a kettes típusú (AT 2 ) angiotenzinreceptor. Az ismert élettani hatások többsége az AT 1 -receptoron keresztül jön létre, mely a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok családjába tartozik. Az ebbe a családba tartozó több ezer receptor olyan különböző ingerek és molekulák felismerésében és jeltovábbításában vesz részt mint a fény, illatanyagok, Ca 2+ -ion, feromonok, hormonok és neurotranszmitterek. A receptorok közös szerkezeti jellemzője, hogy 7 transzmembrán (7TM) hélixből és az azokat összekötő extra- és intracelluláris doménekből épülnek fel. A receptor aktivációja során a transzmembrán hélixek orientációja megváltozik, ez a konformációváltozás közvetíti a jelet a sejt belseje felé. Az aktivált receptorok heterotrimer G-fehérjéken keresztül különböző jelátviteli utakat aktiválnak a sejtben, köztük enzimek, ioncsatornák és transzportfolyamatok működését befolyásolják. Egyes adatok arra utalnak, hogy a 7TMreceptorok egy része G-fehérjéktől független növekedési és differenciálódási hatások közvetítésében is szerepet játszik. A 7TM-receptorok aktiválódását a jelátviteli folyamat beindulása mellett a receptor működését szabályozó folyamatok aktiválódása is kíséri. Az agonistakötést követően a receptorok rövid időn belül deszenzitizálódnak. Számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében kimutatták, hogy ezt részben a receptor foszforilációja okozza. A receptor foszforilációjának egy további következménye, hogy az aktivált receptorok endocitózisra kerülnek. A 7TM-receptorok internalizációja döntő részben klatrinnal burkolt vezikulák segítségével történik. Az internalizáció során az endocitotikus vezikulákba jutott receptorokról a savas ph hatására leválik az agonista, a receptort intracelluláris foszfatázok defoszforilálják, így az újra aktiválható állapotban visszajuthat a sejtmembránba vagy lizoszómális degradációra kerül. A receptorok 7

8 endocitózisa csökkenti a sejtfelszíni receptorszámot, ezért sokáig ezt a folyamatot a hormon hatására létrejövő deszenzitizáció egyik részjelenségének gondolták. Az internalizáció mechanizmusának megértése viszont világossá tette, hogy az esetek nagy részében olyan receptor kerül felvételre a sejtbe, amely a G-fehérjétől szétkapcsolt, deszenzitizált állapotban van. Ennek következtében mai elképzeléseink szerint a receptorinternalizáció fő funkciója, hogy lehetővé teszi a deszenzitizált receptorok reszenzitizációját és visszajutását a plazmamembránba, és ezáltal hozzájárul a receptor érzékenységének helyreállításához. Míg ezek a receptorok érzékenységét és sejten belüli elhelyezkedését befolyásoló folyamatok az aktivációt követően rövid időn belül kialakulnak, tartósan fennálló ingerlés a sejtben található receptorok számának csökkenését, down-regulációját okozza. Mindezek a jelenségek nagymértékben befolyásolják a terápiásan alkalmazott receptor ligandok hatékonyságát és az alkalmazhatóság időtartamát. Számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében a molekula karboxi-terminális régiójának agonista kötést követő foszforilációja fontos szerepet játszik a receptor endocitózisában. Elsőként a ß 2 -adrenerg receptor esetében írták le, hogy a foszforilált receptorhoz kötődő ß-arresztin fehérjék amellett, hogy az aktivált receptort szétkapcsolják a G-fehérjétől, és ezáltal a receptort deszenzitizálják, a receptor endocitózisában is fontos szerepet játszanak, mert e molekulák képesek kötődni a receporhoz és a klatrin burok komponenseihez, és ezáltal adapter fehérjeként működhetnek a receptorinternalizáció során. A ß-arresztinek adapter fehérje funkcióját később más receptorok endocitózisában is sikerült kimutatni. Azonban néhány receptor, köztük az AT 1 -angiotenzinreceptor esetében az irodalmi adatok ellentmondóak voltak a receptorendocitózis mechanizmusával kapcsolatban. Kísérleteink kezdetekor az AT 1 - receptor endocitózisának molekuláris mechanizmusáról, a szükséges struktúrális elemekről, valamint a résztvevő fehérjékről kevés és részben ellentmondó ismeret állt rendelkezésre, mert az endogén AT 1 -receptorokon végzett vizsgálatok eredményei arra utaltak, hogy az internalizáció klatrin-mediált mechanizmussal történik [1;VI]. Expresszált receptorokon végzett vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a folyamat ß- arresztin és dinamin-independens, és ez alapján felvetődött a klatrin-independens folyamatok lehetséges szerepe [2]. 8

9 CÉLKITŰZÉSEK A 7TM-receptorok családjába tartozó AT 1 -angiotenzinreceptor aktivációját követő folyamatokban főként a receptor intracelluláris régióinak szerepét valószínűsítik. Kísérleteink első felében a receptor karboxi-terminális régiójában a membránközeli aminosavak szerepét vizsgáltuk a receptor aktiválódását követő folyamatokban. Munkacsoportunk korábbi adatai arra utaltak, hogy a receptor foszforilálódik a karboxiterminális régió szerin és treonin aminosavain és ez a foszforiláció feltétele a receptor endocitózisának. Szintén ismert volt, hogy az endogén AT 1 -receptor főleg klatrinnal burkolt vezikulák révén kerül felvételre, de ennek mechanizmusára és az adapter fehérjék szerepére vonatkozóan ellentmondóak voltak az irodalmi adatok. Kísérleteink második felében a receptor endocitózisának mechanizmusát vizsgáltuk, ezen belül a következő kérdésekre kerestünk választ: 1. A tranziensen expresszált AT 1 -receptor CHO sejtekben is klatrin mediált útvonalon kerül-e felvételre? 2. Kimutatható-e a ß-arresztin fehérjék szerepe az AT 1 -receptor endocitózisának folyamatában CHO sejtekben? 3. Van-e szerepük a klatrinnal burkolt vezikulák lefűződésében szerepet játszó dinamin GTP-ázoknak az AT 1 -receptor internalizációjában CHO sejtekben? 4. Hasonló mechanizmussal jön-e létre az internalizáció egyéb (pl. COS-7 és HEK-293 sejtekben? 5. Befolyásolja-e az agonista koncentrációja a receptorendocitózis mechanizmusát az általunk használt tranziens expressziós rendszerben? 9

10 IRODALMI HÁTTÉR Az angiotenzin II receptorok áttekintése Az angiotenzin II egy oktapeptid hormon (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), mely fontos szerepet játszik a szervezet vérkeringésének és só-vízháztartásának szabályozásában. A renin hatására felszabaduló angiotenzin I-ből az angiotenzin konvertáló enzim hasítja le a biológiailag aktív angiotenzin II-t. Az Ang II a keringő hormon hatásán kívül egyes szövetekben parakrin hatásokat is közvetít, és a központi idegrendszerben neurotranszmitterként is szerepet játszhat. Az Ang II a célszervek sejtjeinek felszínén található receptoraihoz kötődve intracelluláris jelátviteli utakat indít be, melyek azonnali válaszokat (aldoszteronszekréció, vazokonstrikció, szomjúságérzet), valamint hosszútávú növekedési és proliferációs folyamatokat szabályoznak. A renin-angiotenzin rendszer terápiás jelentőségét alátámasztják az angiotenzin konvertáló enzim gátlókkal és az AT 1 -receptort blokkoló vegyületekkel elért kedvező eredmények a magasvérnyomás és más keringési betegségek kezelésében. Az AT 1 - és AT 2 -angiotenzinreceptorok jellemzése Az Ang II sejtfelszíni receptorainak két altípusa különíthető el emberben: az egyes típusú (AT 1 ) és a kettes típusú (AT 2 ) angiotenzinreceptor [3;4]. Az AT 1 és AT 2 - receptorok a 7 transzmembrán hélixet tartalmazó receptorok családjába tartoznak, amelyeknek közös jellemzője, hogy heterotrimer GTP-kötő fehérjéken keresztül fejtik ki hatásaikat. Az Ang II mindkét receptorhoz hasonlóan nagy affinitással kötődik, de az AT 1 és AT 2 -receptorok farmakológiailag a típusspecificitást mutató nem-peptid antagonista kötésük alapján elkülöníthetőek. A receptorokat később molekuláris biológiai módszerekkel is azonosították, az AT 1 -receptor (AT 1 -R) emlősökben 359, az AT 2 -receptor (AT 2 -R) 363 aminosavból álló glikozilált fehérje. A két receptor egymással % homológiát mutat [5-7]. A szerkezeti homológia ellenére a receptorok funkciója teljesen eltérő. Szöveti eloszlásukra jellemző, hogy az AT 1 - receptor található meg a hormon ismert célszerveiben, míg az AT 2 -R a magzati szövetekben, agyban és a reproduktív szervekben expresszálódik nagyobb mennyiségben [3;4]. Az AT 1 -R aktivációja G q -fehérjén keresztül intracelluláris Ca 2+ -jel kialakulásához és PKC aktiválódásához vezet, valamint sejtnövekedési és 10

11 differenciálódási hatásai is ismertek, az AT 2 -R pedig a legtöbb sejtben növekedést gátló hatásokat közvetít, tirozin-foszfatázokat aktivál és apoptózist indukál [4]. További különbség, hogy míg az AT 1 -R szabályozásában fontos szerepet játszik a receptor endocitózisa [8;VI], addig endogén és expresszált AT 2 -receptorral végzett kísérletek azt mutatták, hogy ez a receptor nem kerül felvételre a sejtbe agonista hatására [9;10]. Mivel az ismert élettani hatások döntő többsége az AT 1 -receptorokon keresztül jön létre a továbbiakban ezzel a receptorral kívánok foglalkozni. K A G R P C D D Q I R K I G DE A S S N L A M NH 2 E.C. T N Y E S R Y R W P N I F H N H E G E T S M N I C A F G V I H D C K I S L S V T Q D Y A H F L I I I T L Y P L V F Y C V I V D M V V I A P W I K N G A R D L T P L S Y L S A I H L G F L A T I S L T V V A S I L F F F N V V L C L D Y G A A L S P T L T M K L N I F I P Q T L I H I A G P I C F V A F I A L S G V A F G 70L N L S L N L F L M W L P L W Y F S N F F F N F L I I L V F C T I I I L F L C L V N V V I S V L C T S T S A I P F L A I V D I V K T Y M I Y Y T R A L I Y L V I R F G L W F I G K F K L M Y L A T A K D D K N F M K I R L R K V R K P K H P M K S R L K A Y E I Q K N K Y F L Q A S S S M N D S P R K Y S L T S MKT S L S S H S K A K P P I Y K L L K P A S C F E V E COOH 319 I.C ábra A patkány AT 1A -angiotenzinreceptor aminosav szekvenciája. Piros színnel az értekezésben tárgyalt aminosavakat jelöltem. Zöld szín jelöli azokat az aminosavakat, amelyekre, mint irodalmi adatokra hivatkozom az értekezésben. Az ábrán fekete alapon a 7TM-receptorok rodopszin családjában kb. 500 szekvencia vizsgálata alapján legalább 85%-ban konzervált aminosavak vannak feltüntetve [179]. Az aminosavakat egybetűs kódjukkal jelöltem. 11

12 Az AT 1 -angotenzinreceptor általános jellemzése Az AT 1 -receptornak rágcsálókban további két, egymással 90 % homológiát mutató altípusa (AT 1A és AT 1B ) ismeretes [5;11;12]. Az AT 1A altípus főként érfal simaizomsejtekben, májban, vesében, tüdőben és a központi idegrendszerben fordul elő, míg az AT 1B altípus dominál a mellékvesében és a hipofízisben. Más emlősökben nem található meg e két AT 1 -R altípus megfelelője, és az eddigi adatok alapján az AT 1A és AT 1B altípusok között sincs jelentős farmakológiai és funkcionális különbség [4]. A patkány érfal simaizomsejtből származó AT 1A -R aminosav szekvenciája az 1. ábrán látható. Az AT 1 -R klasszikus jelátviteli útján G q/11 családba tartozó heterotrimer G-fehérjék aktiválásán keresztül foszfolipáz C-ß1 enzimet aktivál, ami foszfatidilinozitol-4,5- biszfoszfát hasításával inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP 3 ) és diacil-glicerol (DAG) keletkezéséhez vezet. A másodlagos hírvivők keletkezése intracelluláris Ca 2+ -jel kialakulását és protein-kináz C aktivációját eredményezi. A receptor jelátvitelében a klasszikus G-fehérjén keresztül létrejövő hatások mellett egyre több alternatív jelátviteli útvonal szerepét írták le, többek között intracelluláris tirozin-kinázok, foszfolipáz C- 1, JAK-STAT útvonal és Akt/protein-kináz B aktiválását, valamint a kis G-fehérjék közül a Rho, Ras és Rac aktivitásának szabályozását [4;13-17]. A jelátviteli utak aktivitását hasonlóan más 7TM-receptorokhoz szabályozza a receptor gyors deszenzitizációja, valamint hosszú távon a receptorszám down-regulációja a sejtben [8;18-22]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezeti és működésbeli hasonlósága A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezete A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok a membránreceptorok legnépesebb családját alkotják, gerincesekben a családnak több mint 1000 tagja ismert, a receptorokat kódoló gének a genom több, mint 1%-át teszik ki. A receptorok olyan különböző ingerek és molekulák által közvetített jelek továbbításában vesznek részt mint a fény, illatanyagok, Ca 2+ -ion, különböző szerkezetű hormonok és neurotranszmitterek. A transzmitterek széles skálája ellenére a családba tartozó receptorok szerkezete nagyfokú homológiát mutat. A hét hidrofób aminosavból álló transzmembrán -hélixet három intracelluláris (IC1, IC2, IC3) és három extracelluláris (EC1, EC2, EC3) hurok 12

13 kapcsolja össze. A receptorok aminoterminális része extracellulárisan található, míg a karboxi-terminális régió a citoplazmában van. A rodopszin kristályszerkezetének megismerése kapcsán a közelmúltban vált világossá, hogy e karboxi-terminális régió kezdeti szakaszán egy nyolcadik -hélix található [23]. A szekvenciákban tapasztalható eltérések mellett a receptorok N-terminális extracelluláris és C-terminális intracelluláris doménjük, valamint az intracelluláris hurkok hosszában térnek el egymástól. A receptorok szekvencia homológiája alapján eddig hat különböző receptorcsaládot találtak [24]. Az 1-es családba tartozik a legtöbb eddig megismert 7TM-receptor, mint a rodopszin, adrenerg és AT 1 -receptorok. A receptorok aminosav szekvenciájában található különböző mértékben konzervált elemek legtöbbször fontos szerepet játszanak a receptor működésében. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok működésének és szabályozásának jellemzői A családba tartozó receptorok agonista kötésének, aktiválódásának és G-fehérje kötésének közös struktúrális jellemzői vannak. A kisméretű ligandok, köztük az Ang II is, a receptor transzmembrán hélixei által képzett hidrofób ligandkötő zsebbe kötődnek be, míg a nagyobb méretű ligandok ezen felül az extracelluláris hidrofil hurkokhoz és az N-terminális régióhoz is kötődnek [25-27]. Az agonista kötődése stabilizálja a receptor aktív konformációját, a membránhélixek orientációjának megváltozása közvetíti a jelet a sejt belseje felé [27]. A receptor G-fehérje kötésben a második és harmadik intracelluláris hurok aminosavainak szerepét írták le a legtöbb receptor esetében, valamint néhány receptor esetében a karboxi-terminális régió szerepét is valószínűsítik [25;28;29]. A receptor aktív konformációja fokozza a G-fehérje -alegységén a GDP- GTP cserét, a GTP kötött G disszociál a ß alegységről és a receptorról, és a szabad, GTP-t kötő és ß alegységek enzimek és ioncsatornák aktivitását befolyásolják. Az agonista kötését követően a jelátvitel másodperceken-perceken belül deszenzitizálódik, ennek egyik oka a receptor foszforilációja másodlagos hírvivők által aktivált kinázok vagy specifikus receptor kinázok által [30-32]. Ezt szinte azonnal követi a receptorok endocitózisa. 13

14 A receptorendocitózis Számos sejtfelszíni receptor képes a membránról lefűződő vezikulák révén a sejt belsejébe kerülni, ezt a folyamatot nevezzük receptorendocitózisnak [33;34]. A sejtek ezen az úton vesznek fel különböző tápanyagokat, hormonokat, növekedési faktorokat, de egyes vírusok is ezen az úton jutnak be a sejtbe. A legtöbb tápanyagot kötő receptor, mint például az LDL és transzferrin receptorok, konstitutív internalizációval kerülnek felvételre, függetlenül a ligand kötésétől. A hormon és növekedési faktor receptorok endocitózisát azonban a specifikus agonista kötése indítja be [33;34]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisa A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisát először béka vörösvérsejteken írták le, ahol megfigyelték, hogy a sejtfelszíni ß 2 -adrenerg receptorok száma agonista hatására csökken és ezzel párhuzamosan nő az intracellulárisan található receptorok száma [35]. Az endocitózissal bejutott receptorok mennyiségét a hidrofób és hidrofil ligandok segítségével mért kötés különbségéből lehetett meghatározni [36]. Később a ß 2 -adrenerg receptor intracelluláris vezikulákban történő megjelenését immunhisztokémiai vizsgálatokkal és GFP-vel (zöld fluoreszcens fehérje) jelölt receptor élő sejtben történő vizsgálatával egyaránt igazolták [37;38]. A továbbiakban számos 7TM-receptor endocitózisát kimutatták hasonló vizsgálatokban [39-42]. A receptorinternalizáció molekuláris mechanizmusa A receptorendocitózis mechanizmusa Az endocitózis történhet klatrinnal burkolt [33] vagy burok nélküli vezikulákkal [43], és kaveolák segítségével [44]. A klatrin-mediált endocitózis szerepe jól ismert a tápanyag receptorok és a növekedési faktor receptorok endocitózisában, valamint a szinaptikus vezikulák újrafelvételében [45]. Az eddigi kutatások eredményei azt mutatják, hogy a 7TM-receptorok endocitózisának is ez a fő mechanizmusa [46]. Néhány esetben azonban a 7TM-receptorok endocitózisában a kaveolák [47;48] és a nem burkolt vezikulák szerepét is leírták [49;50], de a pontos mechanizmus még tisztázásra vár. Több 7TM-receptor esetében is felvetették, hogy a receptorok aktiválódásuk során a kaveolákba helyeződnének át [51-53], az A 1 adenozinreceptor esetében azonban ennek 14

15 ellenkezőjét tapasztalták [54]. Újabb adatok szerint a plazmamembrán koleszterintartalmának megváltoztatásával befolyásolni lehet az ET A -endothelinreceptor endocitózisában részt vevő endocitotikus útvonalak arányát [55]. Legtöbb adat a klatrin-mediált endocitózisról áll rendelkezésre, melynek legfontosabb összetevője a 190kDa molekulatömegű klatrin. Három-három klatrin nehézlánc és a hozzá szorosan kötődő klatrin könnyűlánc összekapcsolódva háromágú strukturát, klatrin triszkeliont hoz létre. Ezek in vitro és in vivo képesek oligomerizálódni, létrehozva egy öt és hatszögekből álló hálózatos szerkezetet [56]. Ez a klatrinból álló háló veszi körül a lefűződő vezikulát, így az elektronmikroszkóposan jól elkülöníthető a nem burkolt vezikuláktól. A klatrin burokban számos más fehérje is található, többek között az adapter protein (AP) komplexek. Ezek szerepe egyrészt a klatrin rögzítése a membránhoz másrészt a tápanyag és növekedési faktor receptorokhoz kötődve azokat a klatrinnal borított gödröcskék területére irányítják [33;56;57]. A 7TM-receptorok esetében az AP komplexek mellett egy másik adapter fehérje, a ß-arresztin szerepét is valószínűsítik a receptor klatrin burokhoz kapcsolásában [58;59]. A különböző G-fehérjéhez kapcsolt receptorok klatrin-mediált endocitózisában azonban jelentős eltérések mutatkozhatnak. Különbözhet a receptorendocitózis sebessége, például az A1 adenozinreceptor lassan internalizál (t 1/2 90 perc), míg az A3 receptor jóval gyorsabban (t 1/2 19 perc) [48;60]. Ezek a különbségek a receptorendocitózis kinetikájában tükrözhetik a különböző endocitotikus utakat, vagy a receptorok eltérő affinitását az endocitotikus út adapter fehérjéihez. A transzferrin és a ß 2 -adrenerg receptor esetében kimutatták, hogy bár mindkettő endocitózisa klatrin-mediált, nagyrészt elkülönült vezikulákkal kerülnek felvételre, amelyek hőmérséklet érzékenysége és ß-arresztin tartalma eltérő [61]. Különböző lehet a receptorok endocitózisának foszforiláció függése [62-64], valamint, hogy mennyire érzékenyek az endocitotikus út különböző fehérjéinek, mint ß-arresztin, dinamin vagy a GIT1, az ADP ribozilációs faktor GTP-áz aktiváló fehérjéjének jelenlétére és mennyiségére [48;65-67]. A foszforiláció szerepe a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában Számos 7TM-receptor esetében leírták, hogy a receptor foszforilációja specifikus receptor kinázok (GRK) által, a receptor homológ deszenzitizációján túl a receptor 15

16 internalizációjában is szerepet játszhat [63;68-71]. A receptorok a harmadik intracelluláris hurok régióban és a karboxi-terminális régióban található szerin és treonin aminosavakon foszforilálódnak [30;72]. Ezeknek a szekvenciáknak a jelenléte szükséges az m1, m2 és m3 muszkarinos Ach-receptorok [73], a -opioid receptor [74] és az AT 1 -R (IV.) endocitózisához. További vizsgálatok arra engedtek következtetni, hogy a GRK-ok internalizációt elősegítő hatása a ß-arresztinek jelenlététől függ [59]. A ß 2 -adrenerg receptor internalizációjának mértéke különböző sejttípusokban a GRK2 és a ß-arresztin expressziós szintjével mutat összefüggést és a két fehérje szinergista módon szabályozza a receptor endocitózisát [71]. A jelenlegi ismeretek alapján a receptor foszforilációja fokozza a ß-arresztin fehérjék affinitását a receptorhoz és ezáltal segíti elő a receptor endocitózisát [75;76]. A ß-arresztinek mint adapter fehérjék szerepe a receptorinternalizációban Az arresztin fehérjéket először a retina pálcikáiban írták le, mint a rodopszin deszenzitizációjában szerepet játszó fehérjéket [77]. Az arresztinek a foszforilált receptorhoz kötődve fizikailag megszüntetik a receptor-g-fehérje kapcsolatot [30;32;78]. A továbbiakban a ß 2 -adrenerg receptor deszenzitizációjában is azonosítottak hasonló fehérjét, amit ß-arresztinnek neveztek el [79]. Az arresztin családnak jelenleg négy tagját ismerjük, közülük a vizuális arresztinek kizárólag a retina fotoreceptoraiban expresszálódnak. A ß-arresztin-1 és ß-arresztin-2 azonban a retinán kívül minden sejtben expresszálódik, és a deszenzitizációban játszott szerepük mellett a 7TMreceptorok endocitózisában is részt vesznek adapter fehérjeként [59]. Ezt a funkciót az teszi lehetővé, hogy a molekula N-terminális régióján keresztül képes az aktivált receptorhoz, karboxi-terminális részén keresztül pedig a klatrinburok komponenseihez kötődni, s ezáltal a receptort a klatrin-burkos gödröcskék területére irányítja [58]. A ß- arresztin N-terminális régiójában található az aktivált receptort felismerő domén (24-180), egy másodlagos receptorkötő domén ( ), és egy foszfát-szenzor domén [32]. A ß 2 -adrenerg receptor foszforilációja a ß-arresztin kötését szorosára növeli in vitro [75]. A molekula a karboxi-terminális részén rendelkezik egy klatrin-kötő régióval, mely homológiát mutat az AP-2 megfelelő régiójával [30;80;81]. Újabb adatok azt mutatják, hogy a C-teminális régió struktúrái a klatrintól függetlenül kötődnek az AP-2 ß2-adaptin alegységéhez is [82;83]. Ezek a szakaszok a vizuális arresztinekből 16

17 hiányoznak [30]. A ß-arresztinek szerepét elsőként a ß 2 -adrenerg receptor internalizációjában mutatták ki, a ß-arresztinek domináns-negatív pontmutánsainak endocitózist gátló hatása alapján [59]. Ezeket a csökkent receptorkötő képességű az 53- as (ß-arresztin-1) vagy 54-es (ß-arresztin-2) pozíciójú valin helyett aszparaginsavat tartalmazó mutáns ß-arresztin fehérjéket elterjedten használják a 7TM-receptorok endocitózisának vizsgálatában [2;41;84-87]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorokat az alapján, hogy endocitózisuk gátolható-e domináns-negatív ß-arresztinnel két csoportba osztották, arresztin-dependens és -independens receptor internalizációs mechanizmusról beszélve [2;84;88]. Korai kísérletek alapján az AT 1 -R endocitózisát is az arresztinindependens endocitózisok közé sorolták [2]. A 7TM-receptorok ß-arresztin függő endocitózisához szükség van a dinamin GTP-ázok működésére is, de a ß-arresztintől független internalizációs folyamatok egy része dinamintól független mechanizmussal is létrejöhet [48;88;89]. A receptorinternalizáció szerepe a receptor érzékenységének szabályozásában A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisának eredetileg a receptorok deszenzitizációjában tulajdonítottak szerepet [36;90]. Az utóbbi időben megjelent közlemények azonban új megvilágításba helyezték a receptorendocitózis szerepét a receptorok szabályozásában. A receptorok agonista indukált homológ deszenzitizációja az agonista kötését követően másodpercek-percek alatt bekövetkezik és mai ismereteink szerint ezt elsősorban a receptor GRK hatására létrejövő foszforilációja okozza [31;48;91;92]. Amint a fentiekből kitűnik a 7TM-receptorok nagy részénél a receptor deszenzitizációját majd internalizációját egyaránt a ß-arresztinek kötődése hozza létre. Ennek következtében olyan receptorok kerülnek felvételre, melyek a G-fehérjéktől már szétkapcsolt állapotban vannak, ezért az internalizáció jelentősége a receptor deszenzitizációja szempontjából nem számottevő. Ezzel szemben a receptorinternalizáció fontos szerepet játszhat a receptor érzékenységének helyreállításában, a reszenzitizációban, mert az endocitózis során a foszforilált receptor intracelluláris kompartmentekbe jut, ahol savanyú foszfatázok defoszforilálják [93]. A ß 2 -adrenerg receptorok esetében kimutatták, hogy az internalizációs vezikulákban a receptorok kisebb mértékben foszforiláltak mint a sejtfelszíni receptorkészlet [93;94]. A defoszforilált receptor visszajuthat a sejtmembránba és ott újra képes agonistát kötni és 17

18 aktiválni a jelátvitelt [32;95]. Egyre több adat bizonyítja a receptorendocitózis szerepét a receptorok reszenzitizációjában. Közvetlen bizonyítékot jelentett, hogy a receptorendocitózis gátlása specifikus gátlószerekkel megakadályozta a receptorok reszenzitizációját, anélkül, hogy befolyásolta volna a receptorok jelátvitelét vagy deszenzitizációját [96;97]. A ß 2 -adrenerg receptor internalizációra nem képes mutánsainak jelátvitele és deszenzitizációja normális volt, a receptor reszenzitizációja azonban szintén gátolt volt [98]. Az endocitózis szerepét a receptor reszenzitizációjában számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében bizonyították [96;97;99-101]. 2. ábra A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisának lehetséges mechanizmusa és szerepe a receptor érzékenységének szabályozásában. A 7TM-receptorok endocitózisának valószínűsített folyamatát ábrázolja a ß 2 -adrenerg receptor endocitózisa alapján [32]. Az agonistakötést követően a receptorokat G-fehérjéhez kapcsolt receptor kinázok (GRK) foszforilálják, ez elősegíti a ß-arresztinek kötődését a receptorhoz, mely fehérjék az aktivált receptort szétkapcsolják a G-fehérjétől, és ezáltal a receptort deszenzitizálják. A ß-arresztin fehérjék emellett a receptort a klatrin burokhoz irányítják és így az aktivált receptorok endocitózisra kerülnek. Az internalizáció során az endocitotikus vezikulákba jutott receptorokról a savas ph hatására leválik az agonista, a receptort intracelluláris foszfatázok defoszforilálják, így a receptor újra aktiválható állapotban visszajuthat a sejtmembránba vagy lizoszómális degradációra kerül. A: agonista, P: foszfátcsoport. 18

19 Dinamin GTP-ázok szerepe a receptorendocitózisban Az endocitotikus vezikula képződésének utolsó lépése a vezikula leválása a plazmamembránról, ebben a folyamatban fontos szerepe van 100 kda molekulatömegű GTP-áz fehérjének, a dinaminnak. E fehérje szerepét eredetileg a Drosophila melanogaster hőmérsékletszenzitív shibire mutánsaiban írták le, ahol azt figyelték meg, hogy a szinaptikus vezikulák lefűződése károsodott a dinamin GTP-kötő doménjének mutációja következtében [102;103]. Emlősökben a dinamin három izoformáját írták le, melyek közül a dinamin-1 csak neurális szövetekben, a dinamin-2 minden szövetben expresszálódik, a dinamin-3 pedig a testisben, valamint szintén neurális szövetekben fordul elő [104;105]. A dinamin nyugalomban homotetramerek formájában található meg a sejtben, de megfelelő felszín jelenlétében a tetramerek spirál vagy gyűrű alakban összekapcsolódva szupramolekuláris struktúrákat alkotnak [ ], ezek a struktúrák in vivo is megfigyelhetőek a klatrinnal burkolt gödröcskék nyaka körül [110;111]. Az összeépülés nagymértékben növeli a dinamin GTP-áz aktivitását, ami szükséges a vezikulák lefűződéséhez [112]. A vezikulák leválásának pontos mechanizmusa még nem ismert, a dinamin szerepére vonatkozóan eddig három modell született. Kettő szerint a dinamin spirál GTP hidrolízis hatására bekövetkező konformációváltozása közvetlenül felelős a vezikula lehasadásáért, a spirálnak a vezikula nyaka körüli összeszorulása, vagy a spirál megnyúlása révén [113;114]. A harmadik modell szerint a dinamin további effektor molekulák működését szabályozva vesz részt a folyamatban [115;116]. A dinamin N- terminális részén található a GTP-áz domén, az ebben létrehozott Lys 44 Ala (K44A) mutáció nagymértékben csökkenti a molekula GTP-áz aktivitását, ezért ha ezt a mutáns fehérjét sejtekben expresszáljuk akkor az endogén fehérje funkciójának gátlásán keresztül domináns-negatív módon gátolja az endocitózist [117;118]. A dinamin-1 ezen mutánsát használták számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében a fehérje endocitózisban betöltött szerepének vizsgálatára [2;41;89;119;120]. 19

20 -arresztin R1 A P S R2 V53D B dinamin klatrin kötő régió AP-2 kötő régió GTP-áz PHD GED PRD K44A 3. ábra ß-arresztin és dinamin fehérjék felépítése. A: A ß-arresztin fehérjék szerkezetének sematikus képén a számozás az aminosav pozíciókat jelöli. A fehérje doménjeinek elhelyezkedése a következő: R1: N-terminális regulátor domén (1-24 aminosavak); A: receptor aktivációt felismerő régió ( as); P: foszfát-szenzor régió ( as); S: másodlagos receptorkötő régió ( as); R2: C-terminális regulátor domén ( ); klatrin kötő régió as és ß2-adaptin [32]. A V53D a Val 53 Asp mutáció helyzetére utal, a 349-es pozíció a deléció helyét jelöli a ß-arresztin-1(1-349) mutánsban. B: a dinamin molekuláris felépítésében az ábrán jelölt régiók a következőek: GTP-áz domén as, PHD: pleksztrin-homológia domén ( as), GED: GTP-áz effektor domén ( ), PRD: prolin gazdag domén ( as) [105]. A K44A jelzés a Lys 44 Ala mutáció helyzetét jelöli. Az AT 1 -angiotenzinreceptor endocitózisa Az AT 1 -receptor endocitózisának mechanizmusa Az Ang II felvételét a sejtekbe több mint 25 évvel ezelőtt írták le endothel és simaizomsejtekben [121;122]. Későbbiek során kimutatták, hogy a ligand a receptor kötés után a plazmamembrán burkos gödröcskéiben koncentrálódik és rövid időn belül endocitózisra kerül, majd a bejutott vezikulák endoszómákkal fuzionálnak és a ligand lizoszómaszerű kompartmentekben tűnik fel [10;123;124]. A receptor endocitózisát számos, az AT 1 -receptort expresszáló sejtféleségben leírták [ ], és a morfológiai adatok többsége azt mutatta, hogy a receptor burkos vezikulákkal kerül felvételre. Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal igazolták, hogy patkány érfal simaizom és 20

21 glomerulosa sejtekben a bekerült AT 1 -R a klatrin-burkos gödröcskékben és vezikulákban található [124;126]. A klatrin mediált útvonal gátlása K + -deplécióval vagy fenilarzén-oxid kezeléssel számos sejtben gátolta a receptor internalizációját, többek között simaizom, glomerulosa és vese epithel sejtekben [8;125;128;133;134;VI]. Későbbi vizsgálatok HEK-293 sejtekben a receptor kolokalizációját mutatták ki transzferrin receptorral [10]. Az AT 1A -receptort stabilan expresszáló CHO sejtvonalban a receptor endocitózisa szintén gátolható volt hiperozmotikus szacharóz kezeléssel [135]. Polarizált sejtekben végzett kísérletek viszont azt mutatták, hogy az AT 1 -receptor endocitózisának több útja is lehetséges egyazon sejtben. Vese proximális tubulussejtben és stabilan transzfektált LLPCK C14 sejtekben a receptorendocitózis kinetikája és mechanizmusa különböző volt az apikális és bazolaterális membránban. Az endocitózis gyorsabb volt az apikális membránban, valamint fenilarzén-oxid kezeléssel és tirozinkináz inhibitorokkal gátolható volt, míg a bazolaterális membránban expresszálódó receptorok endocitózisát nem befolyásolták ezek a kezelések [130;131;133]. A kaveolák lehetséges szerepét is felvetették a receptor endocitózisában, ugyanis szacharóz grádienses vizsgálatokban az AT 1 -R a kaveolinnal azonos frakcióban jelent meg, valamint a kaveolin fehérje és a receptor koimmunprecipitálhatóságát agonista függőnek találták [53]. Annak megállapítása, hogy a kaveolák milyen százalékban vesznek részt az AT 1 -R internalizációjában további vizsgálatokat igényel. Az AT 1 -receptor endocitózisának struktúrális követelményei Az AT 1 -R klónozása lehetővé tette a vad típusú és mutáns receptorok vizsgálatát olyan sejtvonalakban, amelyek nem rendelkeznek endogén AT 1 -receptorokkal. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy az AT 1 -R Ang II hatására számos sejttípusban gyorsan felvételre kerül, a t 1/2 kevesebb, mint 10 perc [10; ]. Az AT 1 -R endocitózisát peptid antagonisták is indukálják, azonban a nem peptid antagonista losartan, illetve candesartan nem kerül felvételre a sejtbe [135;140;VI], ami arra utal, hogy a receptor jelátvitelhez és endocitózishoz vezető aktív konformációi nem egyeznek meg teljesen. Ezt támasztják alá azok a kísérletek, amelyekben a receptor bizonyos mutációi szelektíven befolyásolták a jelátvitel és az endocitózis folyamatát. A második TM hélixben található Asp 74 szubsztitúciója gátolta a G-fehérje aktivációt, de az internalizációt csak minimális mértékben csökkentette [137;141]. A receptor karboxi- 21

22 terminális részén található szerin és treonin aminosavak eltávolítása az internalizációt jelentős mértékben gátolta míg a jelátvitelt nem befolyásolta [136]. A karboxi-terminális régió szerin és treonin aminosavainak szerepe valószínűsíti a receptorfoszforiláció jelentőségét a receptorendocitózis folyamatában. Voltak korai adatok, amelyek azt mutatták, hogy a receptor agonista hatására foszforilálódik receptor kinázok és PKC által [21; ]. Számos adat azonban arra utal, hogy a PKC hatására bekövetkező foszforilációnak nincsen szerepe a receptor endocitózisában [145;146]. Ezzel szemben az AT 1 -R receptor-kinázok hatására történő foszforilációja nagy valószínűséggel fontos szerepet játszik a receptor internalizációjának szabályozásában, ugyanis kimutatták, hogy azok a szerin és treonin aminosavak, melyek szerepet játszanak az AT 1 -R endocitózisában, Ang II-vel történő stimulációt követően foszforilálódnak [147;148]. Ugyanakkor leírták, hogy az AT 1 -R internalizációja a ß-arresztin2 (V54D) és a dinamin- 1(K44A) mutánsaival nem gátolható HEK-293 sejtekben. Vad típusú ß-arresztin expressziója azonban fokozta a receptorendocitózist HEK és COS-7 sejtekben és ez a növekedés gátolható volt domináns-negatív dinaminnal [2]. Ezen adatok alapján arra a következtetésre jutottak, hogy az AT 1 -R ß-arresztintől és dinamintól független úton kerül felvételre, de nagy mennyiségű ß-arresztin jelenlétében a ß-arresztin- és dinamindependens útat is tudja használni internalizációja során. Később azonban Zhang és munkatársai azt találták, hogy az AT 1 -receptort expresszáló HEK-293 sejtekben agonista stimuláció hatására a ß-arresztin diffúz citoplazmatikus lokalizációja megváltozik és a fehérje a plazmamembránhoz lokalizál [2]. Ez arra utalt, hogy az AT 1 - R interakcióba tud lépni a ß-arresztinnel és valószínűsítette a fehérje funkcióját a receptor működésében. 22

23 MÓDSZEREK Receptor mutánsok létrehozása A patkány érfal simaizomból származó 1A típusú angiotenzin II receptort kódoló cdns-t pcdna3 eukarióta expressziós vektorba építettük be, mely tartalmazza a plazmid baktériumban történő fenntartásához és sokszorosításához, egyszálú DNS templát készítéséhez és a receptorfehérje eukarióta sejtekben történő expressziójához szükséges szabályozó elemeket. A receptor cdns-ben a mutációkat irányított mutagenezissel, Kunkel féle módszer segítségével hoztuk létre [149]. A módszer lényege, hogy az AT 1A -receptor cdns-t tartalmazó plazmidról mutáns baktériumok és helper fág segítségével olyan egyszálú DNS templátot készítettünk, mely random előfordulási helyeken timin bázisok helyett uracilt tartalmazott. Erről a templátról a tervezett mutációt tartalmazó primerrel DNS-polimeráz és DNS-ligáz segítségével kétszálú DNS molekulát hoztunk létre, amelyet baktériumokba juttattunk. A baktériumokban működő repair mechanizmus a két DNS szál közötti eltérést kijavítja, melynek során az uracil tartalmú templát felhasználása jelentősen növeli az általunk tervezett mutáns DNS-t tartalmazó baktérium kolóniák előfordulási valószínűségét. A baktériumokból kolóniákat szelektáltunk, melyekből plazmidot izoláltunk és a mutációs primerrel bevitt restrikciós hely segítségével azonosítottuk a mutáns cdns-eket. Valamennyi előállított mutáns AT 1 -R szekvenciáját szekvenálással ellenőriztük. A vad típusú és mutáns dinamin fehérjéket kódoló cdns-eket Dr. Kazuhisa Nakayama (Tsukuba Science City, Ibaraki, Japán), a ß-arresztin-1 cdns-eket Dr. Marc G. Caron (Durham, Észak-Karolina, USA) és Dr. Stephen S. G. Ferguson (London, Ontario, Kanada) bocsátotta rendelkezésünkre. Mutáns és vad típusú fehérjék expressziója A mutáns és vad típusú receptorok működésének vizsgálatához a fehérjéket sejtkultúrában fenntartott COS-7, CHO-K1 és HEK-293 sejtekben expresszáltuk. A COS-7 és HEK sejteket DMEM, a CHO sejteket Ham s F-12 médiumban növesztettük, amely 10% borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100 g/ml streptomycint, és NaHCO 3 -ot tartalmazott. A 24 lyukú lemezeken tenyésztett sejteket 48 órával a 23

24 kísérletek előtt transzfektáltuk a receptor cdns-eket, valamint dinamin vagy ß- arresztin1 cdns-eket tartalmazó plazmidokkal Lipofektamin (Life Technologies) vagy FuGENE (Roche Diagnostics) segítségével. A tanszfektálást követően a sejtek tranziensen expresszálják a receptort és a vizsgálni kívánt egyéb fehérjéket, ami lehetőséget teremt a receptor működésének vizsgálatára emlős sejtekben. A fehérjék expressziója a transzfekciót követő második napon volt maximális, ezért kísérleteinket minden esetben ekkor végeztük. Kötési vizsgálatok A mutáns és vad típusú angiotenzinreceptorok ligandkötési sajátosságait és a sejtfelszíni expresszált receptorok mennyiségét 125 I-dal jelzett Sar 1,Ile 8 ]Ang II (peptid antagonista) kötés alapján határoztuk meg. A sejtekhez azonos mennyiségű jelzett és növekvő mennyiségű nem jelzett ligandot adtunk Hepessel pufferolt, 1 mg/ml BSA-t tartalmazó DMEM vagy F-12 médiumban, majd 4 C-on 6 órán át inkubáltuk. A sejtek PBS-es (137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 10 mm NaHPO 4, 1,8 mm KH 2 PO 4, ph: 7,4) mosása után a kötött radioaktivitást -számlálóval határoztuk meg. Az így nyert leszorítási görbék Scatchard analízisével meghatároztuk az egyes mutáns receptorok ligandkötésének affinitását és a sejt felszínén expresszált receptorok számát. Inozitol-foszfát válasz mérése A mutáns angiotenzinreceptorok jelátviteli folyamatot aktiváló képességének hatékonyságára az Ang II hatására létrejövő inozitol-foszfát válasz alapján következtettünk. A transzfektált sejteket a kísérleteket megelőzően óráig 3 H- inozitol jelenlétében inkubáltuk 20 Ci/ml myo-[2-3 H]inozitolt (Amersham), 2,5 % borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100 g/ml streptomycint tartalmazó médiumban. Az ily módon előjelzett sejteket 30 percig előinkubáltuk 10mM LiCl jelenlétében a inozitol-foszfát átalakulások minimalizálása érdekében [150]. A sejtekhez LiCl-t tartalmazó Hepessel pufferolt médiumban 1 M Ang II adtunk és 20 percig inkubáltuk 37 C. 10 %-os perklórsavval történő leállítást követően a mintákból az inozitol-foszfátokat tartalmazó vízoldékony frakciót kivontuk, majd az inozitolfoszfátokat ioncserélő Dowex oszlop segítségével elválasztottuk. Az 1 M-os 24

25 ammónium-formiáttal eluálható inozitol-bisz- és inozitol-triszfoszfátokat tartalmazó frakció radioaktivitását mértük szcintillációs számláló segítségével. Az így kapott inozitol-foszfát válasz nagyságát a sejtfelszíni expresszált receptorok száma is befolyásolja, ezért a kapott inozitol-foszfát válaszokat az expresszált receptorok száma alapján normalizálva is feltüntettük [151]. A receptorinternalizáció mérése A receptorinternalizáció kinetikájának meghatározásához a sejtekhez 125 I-dal jelzett Ang II-t adtunk Hepessel pufferolt médiumban 250 l térfogatban, majd a sejteket 37 C-on inkubáltuk az ábrákon feltüntetett ideig. Az internalizáció leállításához a mintákat jégre tettük és kétszer 1 ml jéghideg PBS-sel mostuk. A sejt felszínén kötött ligandot a kötés ph érzékenysége alapján savas mosófolyadékban (15 mm NaCl, 50 mm ecetsav, 0,5 ml) történő inkubálással (10 perc) távolítottuk el. Ezután a sejteket SDS/NaOH keverékével szolubilizáltuk az intracelluláris radioaktivitás méréséhez. Az internalizációt az egyes időpontokban mért intracelluláris specifikus kötés és a teljes (extracelluláris + intracelluláris) kötés hányadosaként adtuk meg. Az internalizáció kinetikáját jellemző endocitotikus sebességi állandót (k e ) az első 5 perc mérési eredményei alapján számítottuk Wiley és Cunningham által kidolgozott algoritmusok felhasználásával [152]. Ez az állandó azt mutatja meg, hogy az agonistát kötött receptorok mekkora hányada kerül endocitózisra 1 perc alatt. A gáltószeres vizsgálatokban a gátlószereket tartalmazó médiumban előinkubáltuk a sejteket 37 C-on, majd az internalizációs kísérleteket is ugyanebben a médiumban végeztük el. A szacharózt 0,45 M koncentrációban adtuk a médiumhoz. Konfokális mikroszkópos vizsgálatok A mikroszkópos vizsgálatokhoz a sejteket fedőlemezen növesztettük és 48 órával a vizsgálatok előtt transzfektáltuk. A kísérletek előtt a sejtekhez 50 nm fluoreszceinnel jelzett Ang II-t (Fluo-Ang II) (NEN Life Science Products) és 25 ng/ l Alexa-Fluor 594- gyel konjugált transzferrint (Molecular Probes) adtunk Hepessel pufferolt F-12 médiumban majd 37 C-on inkubáltuk. A képek elkészítéséhez egy Olympus BH2-es mikroszkópra felépített Bio-Rad MRC-1024 pásztázó lézer konfokális rendszert 25