receptor molekuláris szabályozási mechanizmusának tanulmányozása a receptorantagonista

Átírás

1 Celluláris és Molekuláris Élettan Doktori Program A dinamin szerepe az AT1-angiotenzinreceptor internalizációjában Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Szaszák Márta Témavezető: Dr. Hunyady László egyetemi docens Semmelweis Egyetem Élettani Intézet Budapest 2003 ÖSSZEFOGLALÁS A renin-angiotenzin rendszer számos kardiovaszkuláris betegség kialakulásában szerepet játszik. Az AT1-angiotenzinreceptort szelektíven gátló gyógyszereknek fontos szerepe van a népbetegségnek számító magasvérnyomás kezelésében. Az AT1-receptor a G- fehérjéhez kapcsolt, hét transzmembrán domén szerkezetű receptorok családjába tartozik. A receptor molekuláris szabályozási mechanizmusának tanulmányozása a receptorantagonista és -agonista vegyületek alkalmazásának szempontjából, valamint az endocitózis általános folyamatának megértése céljából alapvető fontosságú. Az angiotenzinreceptor endocitózisa befolyásolja a receptor jelátvitelét, illetve szerepet játszik a receptor érzékenységének, valamint a receptorszám hosszútávú szabályozásában. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogyan szabályozzák az angiotenzinreceptor klatrin-mediált internalizációjat az emlős sejtekben ubikviteren előforduló dinamin2 GTP-áz fehérje által létrehozott fehérjelipid, illetve fehérje-fehérje kölcsönhatások. A dinamin2 foszfolipdeket kötő, PH doménjében létrehozott pontmutáció, valamint az SH3 domént tartalmazó fehérjékhez kapcsolódni képes, prolingazdag doménjének az eltávolítása, gátolták a receptor internalizációját. Ezen felül azonban, amint azt funkcionális és konfokális mikroszkópos vizsgálatokkal megállapítottuk, a prolingazdag domén deléciója megszűntette a dinamin2 plazmamembrán-lokalizációját is. A dinamin lokalizációját hasonló módon megakadályozta, amikor az amfifizin és endofilin SH3 doménjét expresszáltuk a receptorral. Ezen SH3 domének a receptorinternalizációt is gátolták, amely gátlást a dinamin expresszálása felfüggesztett, ami arra utal, hogy az amfifizin és endofilin fehérjéknek a dinaminon keresztüli kapcsolódása szerepet játszik az AT1-receptor endocitózisában. A kísérleti eredményeink arra utalnak, hogy a dinamin, amfifizin és endofilin nem neuronális formája a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok dinamin-függő endocitózisa során hasonló szerepet játszik, mint ahogyan azt ezen fehérjék neuronális formái esetében leírták a szinaptikus vezikulák újrafelvétele során. Megállapítottuk, hogy e folyamat során a dinamin prolingazdag doménje a fehérje lokalizációjában, míg PH doménje valószínűleg inkább a molekula működésének szabályozásában játszik szerepet.

2 SUMMARY The renin-angiotensin system has a role in the pathogenesis of several cardiovascular diseases. Drugs that selectively block the AT1 receptor have important roles in the treatment of hypertension. AT1 receptor belongs to the superfamily of G-protein-coupled receptors, which contain seven transmembrane regions. Elucidation of the molecular mechanisms that control the receptor function has a high importance in regard to the use of receptor antagonist and agonist compounds and for the understanding of the mechanism of endocytosis. Endocytosis of the angiotensin II receptor influences the signal transduction, causes resensitization of the receptor after its desensitisation and has a role in the long-term regulation of the number of receptors. The aim of our study was to examine the role of dynamin2 in the clathrin-mediated internalization of the AT1 receptor. Dynamin2 is a GTPase protein that is ubiquitously expressed in mammalian cells and can interact with lipids and several proteins. The internalization of the AT1 receptor was inhibitied by generating a pointmutation in the PH domain of dynamin, which can bind to phospholipids and by deletion of the proline-rich region that can interact with SH3 domain containing proteins. In addition the deletion of the proline-rich region has inhibited the plasmamembrane localization of dynamin as it was confirmed by confocal microscopic studies. Coexpression of the SH3 domain of amphiphysin and endophilin impeded the localization of dynamin in a similar way. These SH3 domains also inhibited the internalization of the receptor, which was overcome by the coexpression of dynamin suggesting that the specific interaction of dynamin with these SH3 domain containing proteins has a role in the endocytosis of the AT1 receptor. Our experiments show that the non-neuronal isoform of dynamin, amphipiysin and endophilin has a similar role during receptor endocytosis as it was described by their neuronal isoforms in the recycling of the synaptic vesicles. In addition, we concluded that the proline-rich domain of dynamin has a role in its localization, whereas the PH domain most probably regulates its function. IRODALMI HÁTTÉR Az AT1-receptor fő jelátviteli útvonala, foszfolipáz Cβ-1 enzim aktiválása a G q/11 - fehérje családon keresztül, amely inozitol-triszfoszfát választ és diacil-glicerol felszabadulást, valamint ennek következtében kalcium jelet és protein-kináz C aktiválást eredményez. Ezen kívül aktiválja a foszfolipáz A2 és foszfolipáz D enzimeket, amelyek arachidonsav felszabadulást okoznak, ami a prosztaglandinok prekurzora. Tartós Angiotenzin II kezelés során a legtöbb célszervben a sejtek hipertrófiája mutatható ki. Az Angiotenzin II ezen növekedési hatásainak létrehozásában számos jelátviteli folyamat szerepét felvetették. Az AT1-receptor aktiválja a foszfolipáz Cγ-1 enzimet, a JAK-STAT útvonalat, az Akt/PKB enzimet, valamint kis G-fehérjéket, köztük a Ras-t és a Rho-t. Az AT1-receptor az agonistakötést követően a jelátviteli útvonalak elindulása után, először foszforilálódik, ami elősegíti a β-arresztin kötődését a receptorhoz, amely fehérjék szétkapcsolják a G-fehérjétől, ezáltal deszenzitizálják. A β-arresztinek a receptort emellett, az AP2, adaptor komplexhez való kapcsolódáson keresztül, a klatrinburokhoz irányítják, és az aktivált receptor endocitózisra kerül. A szinaptikus vezikukák újrafelvételében számos járulékos fehérje, mint például az amfifizin, endofilin, dinamin, szinaptojanin szerepét leírták, amelyeknek a vezikula képződés során a membrén görbület kialakításában, illetve a vezikula levágódéséban van szerepük. Ezen fehérjék szerepével kapacsolatban nemneuronális szövetekben azonban sokkal kevesebb adat áll rendelkezésre. A dinaminok 100kDa molekulasúlyú GTP-ázok, melyeknek 3 izoformája ismert, a neuronális dinamin1, az ubikviteren előforduló dinamin2 és az elsősorban tüdőben kimutatott dinamin3. A dinamin a citoplazmában tetramer formában van jelen, amely tetramerek képesek még tovább polimerizálódni és egy gyűrű, illetve spirál alakú struktúrát kialakítani, a lefűződő klatrin burkos vezikula nyaka körül, amelyet in vivo is kimutattak. Molekuláris szerkezetéről ismert, hogy N-terminálisan egy GTP-áz domént tartalmaz középen egy PH domén található, C-terminálisan pedig egy prolin-gazdag domén. Azok a körülmények amelyek stimulálják a dinamin oligomerizációját, a GTP-áz aktivitást nagymértékben megnövelhetik. In vitro a dinamin kötődése, a C-terminális prolin gazdag régióján kersztül, SH3 domént tartalmazó fehérjékhez fokozza a GTP-áz aktivitást és az

3 oligomerizációt. Anionos foszfolipidek melyek pedig a PH doménhez kötődnek szintén stimulálják a GTP-áz aktivitást, illetve az oligomerizációt. A PH domén több száz fehérjében megtalálható struktúrális elem. A különböző fehérjék PH doménjei a különböző foszfoinozitidekhez különböző preferenciával kötődhetnek. A dinamin PH doménjéről kimutatták, hogy a foszfatidilinozitol-(4,5)- biszfoszfáthoz kötődik a legnagyobb affinitással, és ezért ennek a kapcsolatnak feltételeznek szerepet a dinamin membránlokalizációjában, amely kötődés a GTP-áz aktivitást is fokozza. A C-terminálisan elhelyezkedő prolin gazdag domén több mint 30% prolint tartalmaz. Ez a régió in vitro számos fehérje SH3 doménjével képes kölcsönhatásba lépni, amely kapcsolat a dinamin GTP-áz aktivitását fokozza. Ilyen SH3 domént tartalmazó fehérjék, melyek a dinamin lehetséges partnereiként szerepelhetnek az endocitozis során: például az amfifizin, endofilin, interszektin. Az amfifizin a dinaminon kívül kötődik a klatrinhoz, α- adaptinhoz, szinaptojaninhoz. Az amfifizin SH3 doménje a szinaptikus vezikula endocitózisát gátolja, valamint a szinaptikus vezikulák akkumulálódásához vezet a preszinaptikus membrán mentén. A dinamin amfifizinnel történő kapcsolata arra utal, hogy az amfifizin szerepelhet a dinamin lefűződő vezikula nyaka köré történő kapcsolódásban a plazmamembránon. Az endofilin lizofoszfatidsav-acil-transzferáz enzim aktivitással is rendelkezik, amelynek a membrángörbület kialakításában tulajdonítanak szerepet a vezikula képződése során. Viszont azon endofilin is gátolja az endocitózist, amelynek SH3 doménjét távolítják el és enzimaktivitása ép marad, ami a molekula fehérjekomplexeket kialakító szerepével lehet összefüggésben. A legtöbb adat amely a dinamin és az SH3 domént tartalmazó fehérjék közötti kapcsolatról a neuronális dinamin1 izoformát használják. A legtöbb endocitózisban szereplő fehérjének a neuronális izoformája mellett azonban a nem neurális izoformája is létezik, amely az endocitózisban betöltött általános szerepükre utal. A dinaminok, elsősorban a dinamin2, a jelátvitelben is szerepet hátszó fehérje. A dinamin endocitózisban betöltött szerepét a G-fehérjés receptorok internalizációja során a GTP kötés hiányos mutáns dinaminnal széles körben vizsgálták, azonban a dinamin endocitózisban betöltött szerepének pontos mechanizmusával kapcsolatban kevés adat áll rendelkezésre. CÉLKITŰZÉSEK A klatrin-mediált endocitózis egy több lépéses folyamat, amely számos fehérje finoman összehangolt interakcióját követeli meg. GTP-ázok, kinázok, foszfatázok, ubikvitinkonjugáló enzimek, lipidmódosító enzimek, és az aktin citoszkeleton egyaránt kellenek a klatrinburok és a vezikula kialakulásához. A folyamatban nagyon sok fehérje szerepét felvetették, amelyek különböző fehérje-lipid és fehérje-fehérje kölcsönhatásokra képesek, de a vezikula létrejöttének finoman szabályozott lépéseinek pontos mechanizmusa a mai napig ismeretlen. Az egyik legtöbbet vizsgált és kulcsfontosságú szerepet játszó fehérje, a dinamin GTP-áz, amelynek a lefűződött vezikula levágódásában tulajdonítanak szerepet. Munkacsoportunk vizsgálatai igazolták, hogy az AT1-receptor internalizációja alacsony angiotenzin koncentrációnál β-arresztin és dinamin-függő módon történik, klatrinburkos vezikulákban. Kísérleteink megkezdésekor azonban ellentmondó adatok voltak az irodalomban azzal kapcsolatban, hogy a dinamin foszfolipidet kötő PH, vagy a más fehérjék SH3 doménjéhez kapcsolódni képes prolingazdag doménje játszik szerepet a dinamin plazmamembránhoz történő kapcsolódásában az AT1-receptor endocitózisa során. Nem volt arra sem adat, hogy a szinaptikus vezikula újrafelvételében szerepet jatszó adapter fehérjék, mint amilyen az endofilin és az amfifizin, egy G-fehérjéhez kapcsolt receptor, az AT1-receptor internalizációja során is hasonló szerepet tölthetnek-e be nem neuronális szövetekben. Kísérleteinkben összefoglalva a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Szerepet játszik-e a dinamin PH doménjének foszfolipid kötése az AT1-receptor endocitózisában? 2. Mi a dinamin prolingazdag doménje által kialakított fehérje-fehérje interakciók jelentősége az AT1-receptor internalizációjában? 3. A dinamin PH doménjének lipidkötése, vagy a prolingazdag domén által kialakított fehérje-fehérje kölcsönhatások játszanak szerepet a dinamin klatrinburkos struktúrákhoz történő kapcsolódásában az internalizáció során? 4. A szinaptikus vezikulák endocitózisában bizonyítottan szerepet játszó endofilin és amfifizin szerepet játszhat-e az AT1-receptor internalizációjában is, nem-neuronális szövetben? 5. Hogyan befolyásolja az endofilin és az amfifizin SH3 doménje a dinamin lokalizációját az AT1-receptor internalizációja során?

4 MÓDSZEREK A mutációk létrehozása a dinamin molekulában: A dinamin2 535-ös lizin aminosavának alaninra való cserélése, a dinamin2 cdns-ében irányított mutagenezissel, a Stratagene cég QuickChange Kit-jének segítségével történt. A prolingazdag domén deléciója, illetve a többi mutáció létrehozása is ugyanezzel a módszerrel történt. A dupla mutánsokban a dinamin K44A cdns-ét használtuk templátként a mutációk létrehozására. Transzfekció: CHO-sejteket tranziensen transzfektáltunk az AT1-receptor és a vad típusú vagy mutáns dinaminok, illetve az SH3 domének cdns-ével, az adott kísérleteknek megfelelően, Lipofectamin, illetve FuGENE transzfekciós reagenst használva. A receptorinternalizáció mérése: A receptorinternalizáció kinetikájának meghatározásához a sejteket 125 I-Ang II-vel inkubáltuk 37 C-on az ábrákon feltüntetett ideig. A sejt felszínén kötött és az intracelluláris ligandot a kötés ph érzékenysége alapján különítettük el. Az internalizációt az egyes időpontokban mért intracelluláris specifikus kötés és a teljes (extracelluláris + intracelluláris) kötés hányadosaként adtuk meg. Konfokális mikroszkópos vizsgálatok: A konfokális mikroszkópos vizsgálatokhoz, a sejteket 4%-os paraformaldehidet tarlamazó oldatban fixáltuk majd permeabilizáltuk. Először HA-epitóp ellenes elsődleges antitesttel, majd rodaminnal konjugált kecskéből származó egér elleni másodlagos antitestet inkubáltuk a sejteket. A felvételeket Zeiss LSM 510-es pásztázó lézer konfokális mikroszkóppal készítettük. Western blot analízis: Immundetektáláshoz az expresszált proteineket proteáz inhibitorokat tartalmazó Laemmli pufferben vettük fel. A fehérjéket 8%-os denaturáló poliakrilamid gélen választottuk el, majd nedves blotolással nitrocellulóz membránra transzferáltuk. Ezt követően, a blotokat a megfelelő elsődleges antitesttel és tormaperoxidázzal konjugált megfelelő másodlagos antitesttel festettük A Western blot reakciók detektálása SuperSignal West Pico Kit segitségével történt. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS A dinamin2 PH doménjének a szerepe az AT 1 -receptor internalizációjában Kísérleteink egyik fő célja annak meghatározása volt, hogy a dinamin PH doménje által közvetített fehérje-lipid kölcsönhatások szerepet játszanak-e a receptorinternalizáció során. Ennek vizsgálatához a dinamin PH doménjében egy olyan pontmutációt hoztunk létre, amelyben az 535-ös lizin aminosavat cseréltük ki alaninra Az 535-ös lizinnek, a PH doménen belül, pozitív töltése révén a foszfoinozitidek koordinálásában van szerepe A dinamin-k535a mutánst az AT1-receptorral koexpresszálva a receptorendocitózist domináns negatív módon gátolta. Ez az adat arra utal, hogy a dinamin PH doménjének lipidkötése szerepet játszik az AT1-receptor endocitózisában. A dinamin2 prolingazdag régiójának szerepe az AT1-receptor internalizációjában A másik lehetséges lokalizálásban szereplő régió a dinaminban a prolingazdag domén, amely fehérje-fehérje interakciók kialakítására képes. A dinamin2 prolingazdag régiójának a szerepét az AT1-receptor endocitózisa során, a prolingazdag domén kezdetén lévő 746-os prolin aminosavat kódoló bázishármas stopkodonra történő kicserélésével vizsgáltuk. Az így nyert dinaminban az összes lehetséges SH3 domént kötő régiót delécióval eltávolítottuk Ezen dinamint az AT1-receptorral koexpresszálva, az AT 1 -receptor endocitózisára domináns negatív gátló hatással volt. Ez a domináns negatív gátló hatása szokatlan abból a szempontból, hogy azok a mutációk általában, amelyek a fehérje más helyre történő lokalizációját okozzák, nem gátolják az endogén fehérjét a funkciójának betöltésében. Azonban a dinaminról bebizonyították, hogy a citoszolban tetramer, illetve oligomer formában van jelen a klatrinburokba történő beépülés előtt, és valószínű módon a mutáns és endogén fehérjék vegyesen alkotnak oligomereket, amely azt okozza, hogy az endogén fehérje funkciója gátlódik

5 A PH domén és a prolingazdag domén szerepének vizsgálata a dinamin lokalizációjában kettős mutánsok segítségével A fenti adatok arra utaltak, hogy mindkét doménnek szerepe van az AT1-receptor endocitózisa során, viszont nem adtak információt arra nézve, hogy melyik domén játszik szerepet a dinamin klatrinnal borított struktúrákhoz történő lokalizálásában. A továbbiakban ezért olyan dupla mutáns dinamin fehérjéket hozztunk létre, amelyben a prolingazdag domén deléciója, illetve a PH domén pontmutációja mellett a K44A pontmutációt is jelen volt. A K44A mutációt tartalmazó dinamin, a klatrin-mediált endocitózis gátlására legszélesebb körben használt dinamin mutáns, melynek csökkent a GTP-kötése és csökkent GTP-áz aktivitása Hipotézisünk az volt, hogy az a mutáció, amelyik a molekula plazmamembránhoz való lokalizációját gátolja, az a K44A mutáció domináns negatív hatását felfüggeszti. Míg ha a mutáció nem a lokalizációt befolyásolja akkor a K44A dinamin hatását nem függeszti fel. A K535A és a K44A mutációk kombinációjának hatása a K44A mutáció hatásához volt hasonló Ez az adat arra utal, hogy a PH domén, annak ellenére, hogy képes lipidekhez kötődni, mégsem játszik szerepet a dinamin plazmamembránhoz való lokalizációjában az AT1-receptor endocitózisa során, hiszen a lipidkötés megszűntetése nem képes felfüggeszteni a K44A mutációt hordozó dinamin gátló hatását. A K44A/ PRD kettős mutációt tartalmazó fehérje hatása viszont hasonlónak bizonyult, mint annak a dinaminnak a hatása, amely a prolingazdag domén delécióját tartalmazta önmagában Ez a gátló hatás viszont kisebb, mint a K44A pontmutáns dinamin hatása önmagában, vagyis felfüggesztette a K44A mutáció által okozott gátló hatást. Ez az adat arra utal, hogy a prolingazdag domén a dinamin lokalizációjában szerepel, és ennek eltávolítása megakadályozza a dinamin klatrinburkos gödröcskékhez való lokalizációját. A dinamin mutánsok kolokalizációja β2-adaptinnal a klatrinburkos gödröcskékben Az egyes dinamin fehérjék plazmamembránhoz való lokalizációját a GFP-β2- adaptinnal történő kolokalizációval bizonyítottuk, amely az AP2, adapter fehérje egyik alegysége és bizonyítottan a plazmamembránhoz, illetve a klatrinburkos gödröcskékhez lokalizál, ezért mint a klatrinburkos gödröcskéket jelölő fehérje használható. A vad típusú és K535A mutációt tartalmazó dinamin2 nagyfokú kolokalizációt mutatott a klatrinburkos gödröcskéket jelölő β2-adaptinnal. A K44A dinamin szintén kolokalizált a β2-adaptinnal, de a klatrintól független struktúrákban is jelen volt, és nagyobb intracelluláris vezikulákban is megtalálható volt, ellentétben a vad típusú dinamin2-vel. A K44A/K535A dupla mutációt hordozó dinamin2 hasonló, részleges kolokalizációt mutatott a β2-adaptinnal. A prolingazdag domén deléciós mutáns esetében, és a K44A/ PRD esetében a kolokalizáció egyátalán nem volt megfigyelhető a β2-adaptinnal, ami arra utal, hogy ezek a fehérjék egyátalán nem kapcsolódnak a klatrinburkos gödröcskékhez A mikroszkópos vizsgálatok adatai igazolják a funkcionális vizsgálatok alapján levont következtetéseket, hogy a dinamin prolingazdag régiója, és nem a PH domén az, ami szerepet játszik a dinamin klatrinburkos gödröcskékhez történő kapcsolódásában az AT1-receptor internalizációja során. Az amfifizin és az endofilin SH3 doménjének hatása az AT1-receptor internalizációjára A dinamin a prolingazdag régióján keresztül számos fehérje SH3 doménjéhez képes kötődni. Következő kísérleteinkben ezeknek, a prolingazdag régióhoz kötődő lehetséges partnereknek a szerepét vizsgáltuk az AT1-receptor internalizációja során. Két ilyen fehérje az amfifizin és az endofilin, amelyek a dinaminon kívül számos más fehérjével is kapcsolatba tudnak lépni és ezáltal szerepelhetnek a dinamin membránlokalizációjában. Ahhoz, hogy tanulmányozzuk ezen fehérjék hatását a receptorinternalizació kinetikájára a GFP-hez kapcsolt amfifizin es endofilin SH3 doménjét koexpresszáltunk az AT1-receptorral CHO sejtekben. A GFP-hez kapcsolt SH3 domének expressziós szintjét GFP ellenes antitesttel, Western-blottal ellenőriztük. Mindkét SH3 domén koexpressziója a receptor endocitózisára domináns negatív gátló hatást gyakorolt. Ezzel szemben, a kontrollként alkalmazott GFP önmagaban, illetve az Nck N-terminális SH3 doménje, ami in vitro nem kötődik a dinaminhoz, nem gátolta a receptor endocitózisát Az endofilin es az amfifizin SH3 doménjének gátló hatása azt bizonyítja, hogy ezeknek a fehérjéknek a dinaminnal való kölcsönhatása szerepet játszik az AT1-receptor internalizációja során.

6 Annak igazolására, hogy az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménje valóban specifikusan a dinamin prolingazdag régiójához kapcsolódva gátolták az endogén dinamin fiziológiás kapcsolatait, a dinamin2 koexpresszálásának hatását vizsgáltuk a receptor internalizációjára. A dinamin2 koexpresszálása az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménjével részben, illetve teljesen kivédte az SH3 domének gátló hatását. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a dinamin prolingazdag regiójának kapcsolódása az endofilinhez és amfifizinhez szerepet játszhat a dinamin klatrinburkos gödröcskékhez való irányításában az AT1 receptor internalizációja során, és felveti e fehérjék lehetséges szerepét az AT1-receptor internalizációjában. A dinamin2 lokalizációja az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménjét tartalmazó sejtekben A dinamin2 sejten belüli elhelyezkedése nagy mértékben megváltozott azokban a sejtekben, ahol az amfifizin illeteve az endofilin SH3 doménje koexpresszálódott a dinamin2-vel, azokhoz a sejtekhez képest amelyben csak a dinamin2 expresszálódott. Ezekben a sejtekben a dinamin plazmamembrán-lokalizációja megszűnt. A GFP-hez kapcsolt endofilin SH3 doménje a plazmamembrán-lokalizáció megszűnése mellett a dinamin egyenletes citplazmatikus eloszlásának megszűnését is okozta. Ezekben a sejtekben a dinamin festődése, hasonlóan a prolingazdag domén delécióját tartalmazó dinaminhoz, pettyezettséget mutatott, és kolokalizált az endofilin SH3 doménjével. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA Összefoglalva a kísérleti eredményeket, megállapítottuk, hogy a dinamin2 PH doménje és prolingazdag doménje is szerepet játszik az AT1-receptor internalizációjában. Az amfifizin, illetve az endofilin SH3 doménje domináns negatív gátló hatást fejt ki a AT1-receptor endocitózisára. A mutáns és vad típusú dinaminok, illetve az SH3 domének lokalizációjával kapcsolatos konfokális vizsgálatok azt mutatják, hogy a dinamin2 prolingazdag doménjén keresztül létrejövö kapcsolat az SH3 domént tartalmazó fehérjékkel, és nem a PH domén lipid kötése szükséges a dinamin2 klatrinburkos gödröcsékhez történő megfelelő lokalizációjához. A foszfolipidet kötő PH domén valószinűleg inkább a dinamin funkciójának, pl. GTPáz aktivitásának szabályozásában játszik szerepet. Az amfifizin és az endofilin SH3 doménjének gátló hatása az AT1- receptor endocitózisára felveti ezen fehérjék szerepét a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok internalizációjában nem-neuronális szövetben. Kísérleteink új adatokat szolgáltattak az endocitózis mechanizmusában szereplő fehérje-lipid és fehérje-fehérje kölcsönhatások szerepének megértéséhez.

7 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés alapjául szolgáló közlemények: 1. Szaszák M, Gáborik Z, Turu G, McPherson PS, Clark AJ, Catt KJ, Hunyady L.Role of the proline-rich domain of dynamin-2 and its interactions with Src homology 3 domains during endocytosis of the AT1 angiotensin receptor. J Biol Chem Jun 14;277(24): I.F.: 7, Gáborik Z, Szaszák M, Szidonya L, Balla B, Paku S, Catt KJ, Clark AJ, Hunyady L. Beta-arrestin- and dynamin-dependent endocytosis of the AT1 angiotensin receptor. Mol Pharmacol Feb;59(2): I.F.: 5,297 Egyéb közlemények: 1. Le MT, Vanderheyden PM, Szaszák M, Hunyady L, Vauquelin G. Angiotensin IV is a potent agonist for constitutive active human AT1 receptors.distinct roles of the N-and C- terminal residues of angiotensin II during AT1 receptor activation. J Biol Chem Jun 28;277(26): I.F.: 7, Hunyady L, Baukal AJ, Gáborik Z, Olivares-Reyes JA, Bor M, Szaszák M, Lodge R, Catt KJ, Balla T. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol Jun 24;157(7): I.F.: 12, Baig AH, Swords FM, Szaszák M, King PJ, Hunyady L, Clark AJ. Agonist activated adrenocorticotropin receptor internalizes via a clathrin-mediated G protein receptor kinase dependent mechanism. Endocr Res Nov;28(4): I.F.: 0, Le MT, Vanderheyden PM, Szaszák M, Hunyady L, Kersemans V, Vauquelin G. Peptide and nonpeptide antagonist interaction with constitutively active human AT(1) receptors. Biochem Pharmacol Apr 15;65(8): I.F.: 3,34