Sejtváz Mikrofilamentum (aktin)

Átírás

1 Hermann H., Aebi U. 2000, Curr Op. Cell Biol., 12: Sejtváz 7-9 nm Mikrofilamentum (aktin) 25 nm 10 nm Mikrotubulus Intermedier filamentum

2 Sejtváz

3 Intermedier filamentumok - IF: egyes Metazoákban, pl. gerincesekben, fonálférgekben puhatestűekben - nem minden sejttípusban van IF - legősibbek: laminok - könnyen hajlanak - nehezen törnek - mechanikus stabilitás

4 Kreplak L. globuláris fej NH2 Intermedier filamentumok helikális központi domén globuláris farok COOH Parallel coiled-coil dimer (vimentin) vimentin neurofilament glial filament

5 Intermedier filamentumok frog NF, 11 nm neurofilamentum Herbert E. Lowndes PPT Leapman 1997

6 Intermedier filamentumok Parallel Anti parrallel Protofilamentum (unit) a: IF unit-ok b: immature IFs c: mature IFs 8 parallel protofilaments Chang, Goldman 2004

7 GFAP gene and transcripts 1969, Eric Shooter és mtsai közölték először az AA szekvenciáját 1984, Lewis, Cowan és mtsaik klónozták meg a gént (mouse) majd 1989, Reeves és mtsai a humán változatot A GFAP gén. 9 exons + 2 alternatív exon (7a: 7. intron eleje). Middeldorp kódoló régióban fajok közt nagy homológia - humán génben 9 exon és 8 intron (+4 alternatív exon és intron) - 76 különböző mutációt írtak le: mind az Alexander disease-zel kapcsolatos De: igen ritka (no more than 500 reported case)

8 Alternatív splicing a humán GFAP génben: szürke-exon; piros-exon, aminek egy része kihasítódott (spliced out). Általában alternatív splicing csak kevés IF-re jellemző: LaminA, perpherin, GFAP. Middeldorp 2011

9 GFAPa: a leggyakoribb mrns izoforma GFAPb: emberben nem kimutatható GFAPg: emberben nem írták le részletesen csontvelőből, lépből izolálták először CNS-ben nagyon kis mennyiségben van jelen GFAPd: exon7+ (7.intronban 8.9. exonokban folytatódik) rat GFAPe: exon7a (8-9.exon hiányzik), rat Middeldorp (2011) szerint GFAPd/e lényegében ugyanaz GFAPd nevet használják GFAP 164: out of frame splice variáns GFAP exon6: out of frame splice variáns u.a. fehérje: GFAP 1+ GFP 135: in frame splice variáns Alzheimer, Down HC neuronokban expresszálódó izoformák GFAPk: exon7b (8-9.exon hiányzik) 2011: GFAP alternatív splicing regulációról eddig csak 1 cikk szól Middeldorp 2011

10 GFAP isoform proteins - HEAD domén intaktsága feltétele az összeszerelődésnek - összeszerelődést foszforiláció szabályozza (főleg vimentinben vizsgált!) - GFAP: 6 foszforilációs hely (5-head, 1-tail), nagyon konzervatív helyek, - foszforiláció fontos sejtciklus során a redisztribúcióban - GFAPd-ban van még egy foszforilációs hely - poszt-transzl mod. még: glycosilation, citrullination - TAIL domén: type III IF-ban főleg a protofilamentum kapcsolatok stabilizálása, filament-szélesség szabályozása, IF network kialakulás szabályozása - GFAP esetén TAIL funkció nem teljesen tisztázott: talán IF és más fehérjék kapcsolódási pontja is Middeldorp 2011

11 GFAP network Asztro: Vimentin+ GFAP+ Nestin+ Kopolimerizáció! Vimentin/GFAP Michalczyk, Ziman

12 GFAP network - vimentin -/- egérben (egér OK!) csak GFAP tartalmú IF: kompaktabb filamentumok - GFAP-/- egérben IF mennyiség kisebb in vitro, in vivo pedig az összes vizsgált agyterületen az asztrocitákból hiányzik (egér OK!)!! Control Vim -/- - úgy tűnik, vimentinnek kell a GFAP a polimerizációhoz (nestin is jó...) - GFAP overexpresszió: Rosenthal-fiber akkumuláció asztrocitákban Control Vim -/- Eng 1998 Eliasson 1999 Middeldorp 2011

13 GFAP network - csak a GFAPa variáns képes homomer ön-összeszerelődésre - az összes többi splice-variánsnak kell egy már meglevő (vimentin) network GFAP expresszió - eredetileg asztrocita-specifikusnak gondolták (Eng, 1971) - később leírták több glia típusban és nem gliális/nem-cns sejtekben is Pl.: chondrocytes, fibroblasts, lymphocytes, liver stellate cells, kidney podocyte GFAP expresszió szabályozása - GFAP promoter klb szakaszai más-más TF kötő-hely (ripoter egér nem mindegy, melyik régióról van meghajtva!!) - pl. gfa2 promoter (humán GFAP gene -2163/+47, A,B,C,D régióra osztva) - B régió: kell a CNTF indukálta asztrocita differenciációhoz /-35 element: NFI TF kötő-hely: hiányában nem tud hosszabb nyúlványokat növeszteni az asztro Middeldorp 2011

14 GFAP expresszió az idegrendszerben - humán agyban GFAP expresszió kb héten kezdődik radiális gliában (agyterülettől függően) - SVZ őssejtekben felnőttkorban is megmarad - vimentin+ vimentin+/gfap+ GFAP+ - de bizonyos területeken végig vimentin+/gfap+, pl. Bergmann-glia, corpus callosum és HC asztrociták - életkorral GFAP expresszió (és asztrociták volumene) nő (nem a gliaszám nő) (~reaktív gliózis) Majom corpus callosum, GFAP western, évek - GFAP a CSF-ben is nő (neurológilag egészséges emberekben) vérben nem kimutatható - GFAP 1+ fejlődő humán agyban nincs jelen, felnőttben Alzheimeres betegek HC neuronjaiban illetve kis asztro populáióban, melyre extra hosszú nyúlványok jellemzőek - többi izoformáról inkább mrns szintű adatok vannak Middeldorp 2011 Sloane 2000

15 GFAPd - GFAPd asztrociták az SVZ-ben őssejtek lehetnek (legalább egy szubpopulációjuk) GFAPd in adult human brain A: Subpial G: SVZ Roelofs 2005 SVZ astrocyte ribbon Sanai fejlődés során GFAPd VZ radiális gliában megjelenik GFAPa-val együtt (13-15.hét, humán) és megmarad SVZ sejtekben, és RMS-ben - humán SVZ-ben, NS sejtvonalakban GFAPd expresszió magas - GFAPd expresszió még: central canal környékén, glia limitans-ban, gliomákban, gliotikus sejtekben (tehát ahol magas GFAP tartalom kell) - GFAPd nem tud ön-összeszerelődni, csak ha GFAPa is jelen van, jóval nagyobb arányban (1:10, kémcsőben) tehát GFAPd jelen lehet normál GFAP-ban is, valószínűleg más kötési lehetőségeket teremtve: lásd pár diával később: ab-crystallin! Middeldorp 2011

16 funkciói - mechanikai stabilitás, sejtalak fenntartása, bár...: - GFAP -/- egér: normális, fertilis, vagyis GFAP nem esszenciális DE azért van mégiscsak egy csomó defekt! - valamennyi vimentin azért maradhat GFAP-/- sejtekben is (ha nem is struktúrált)... - GFAP-/-/vimentin -/- egér: (egér OK!) teljesen IF mentes asztrociták: köszönik, megvannak... - vim-/- egér: kompaktabb GFAP a: jellegzetes IF rostok (*) vad típusú asztrocitában b: GFAP-/- asztroban ritkás IF rostok (nyilak) c: vimentin-/- asztroban kompakt GFAP rostok d: GFAP-/-/vimentin-/- asztroban egyáltalán nincsenek IF rostok Mi, mitochondrion; thick arrows, endoplasmic reticulum and/or cluster of ribosomes; arrowheads, microtubules Eliasson 1999 kontroll vim-/- GFAP-/- GFAP-/-/ vim-/-

17 Nestinről , Lendahl, Zimmermann, McKay nestin IF leírása először CNS őssejtekben! - embrionálisan: fejlődő idegrendszer, izom és szívizomprogenitorok, fejlődő here, vese - felnőttben: SVZ, SGZ, neuromuszkuláris junkció, vese podociták

18 /nestin-gfp

19 Nestinről.. Nestin KO modell : - nestin-/- egér: embrionálisan letális, sokkal kevesebb NSC és magasabb mértékű apoptózis a velőcsőben DE citoszkeleton mégis OK (vimentin) - vimentin -/- NS sejtekben: nestin nem tud filamentumokba polimerizálódni, de nem nagyobb az apoptózis nestin kell az NSC túléléshez és differenciációhoz, de ez a funkciója nem a citoszkeletális szerepével kapcsolatos!! NSC tenyészet

20 Nestinről.. És egy másik Nestin KO modell : - normális CNS development DE - károsodott motoros koordináció

21 GFAP funkciói migráció, motilitás - eredetileg: IF-nek nincs szerepe motilitásban - vimentin -/- fibroblasztok: csökkent motilitás és kemotaxis - GFAP overexpresszió glioma sejtekben: motilitás gátlódik - GFAP-/- és vim-/-és GFAP-/-/vim-/- : minden esetben a gyorsan mozgó szubpopuláció eltűnik - mutáns GFAP (rod domain) formák expresszáltatása: motilitás nő - mutáns GFAP (tail domain) expresszáltatása: motilitás nem változik GFAP funkciói proliferáció - GFAP-/-: asztrociták tenyészetben csökkent proliferáció - mitózis alatt HEAD domén kinázai szabályozzák IF szét/összeszerelődését

22 GFAP spéci! funkciója autofágia Chaperone-mediated autofágia (CMA): citoszolikus fehérjék transzlokálódnak a lizoszómákba, ahol degradálódnak ( cellular quality control és aminosav-forrás) LAMP2A: lizoszóma asszociált fehérje GFAP nem csak intermedier filamentum kompartmentumban lehet!! GFAP and LAMP-2A of mouse 3T3 fibroblasts. Percentage of colocalization calculated in 20 cells is indicated. Bandyopadhyay 2010

23 GFAP funkciói autofágia EF1: protein transzlációt szab. fehérje - kerestek más lizoszóma asszociált proteineket: GFAP és EF1a (elongációs faktor 1) - GFAP stabilizálja a transzlokációs komplexet: ez CMA autofágiát támogatja - EF1a GTP jelenlétében disszociál GFAP-ről, ami aztán más GFAP alegységekkel összeáll ezáltal csökken a GFAP szint ami stabilizálhatná a TL komplexet - GFAP knock-down esetén CMA mértéke nő: vagyis összességében, normál GTP tartalom mellett GFAP inkább gátolja CMA-t Bandyopadhyay 2010

24 GFAP funkciói vezikula trafficking és asztrocita/neuron interakció - GFAP-/- egérből szinaptoszóma prepi: csökkent Glu uptake, csökkent glutamaterg vezikula transzport - GFAP hiányában gliális GLAST és érdekes módon a neuronális EAAC1 glutamát transzporter szintje is csökken - GFAP hiányában gliális GLT-1 glu transzporter kipakolódása nem történik meg szinaptoszóma

25 GFAP funkciói asztrocita/neuron interakció - GFAP szabályozza GLAST kipakolódását a plazma-membránba GFAP -ko-immunprecipitáció: GFAP, GLAST, NHERF1 (PDZbinding protein), ezrin GLAST - membánban -GFAP stabilizálja az asztro-nyúlványt és a GLAST membránban tartását klb. linkerek (ezrin, NHERF1) révén - hypoxiás területeken GLAST eltűnik asztro membránból itt GFAP is visszahúzódik sejttestbe (K) GFAP/GLAST hypoxia GFAP/GLAST control

26 GFAP funkciói asztrocita/neuron interakció - GFAP -/- egérben kisagyi Purkinje szinapszisok LTD deficiensek : GFAP valószínűleg fontos a Bergmann glia/purkinje sejt kommunikációban LTD indukciója és fenntartása során A: kisagy, Purkinje sejtek dendritjeit Bergmann glia (sötét vonalak, nyílhegyek) veszik körül. A két B betű Bergmann glia sejttestét jelenti a Purkinje sejttesthez közel. Csillag: kapilláris B: S100+ Bergmann glia Purkinje mellett - GFAP -/- hippocampusban LTP normális/ más cikkek szerint enhanced LTP (pl. spike amplitúdó nő, stb.) Hatton, Parpura 2004

27 GFAP funkciói sérülés, hegképződés - reaktív gliózis: GFAP upreguláció: gliális hegszövet Sofroniew, Vinters 2010 Cerebra microinfarcts. - GFAP-/-/vimentin-/- egér: hibás hegképzés - csak GFAP-/- vagy vimentin -/- egér: hegképzés kb egyforma - csak GFAP-/-: traumás és ischemiás állapotra is érzékenyebbek, ekkor neuronvesztés is nagyobb (HC piramis-sejt pusztulás nagyobb)

28 GFAP funkciói BBB, myelináció GFAP-/- vad GFAP-/- vad - GFAP-/- egér: 14-ből 7 öreg (18 hónaposnál idősebb) egérnél hydrocephalus!! - abnormális myelináció - gyengén vaszkulariált fehérállomány vad GFAP-/- GFAP-/- -BBB hibás, rövidebb asztro nyúlványok, megnövekedett extracell tér - late onset CNS dysmyelination v.ö: GFAP tartalom életkorral nő, lásd pár diával korábban! 18 hónaposnál idősebb egerek a,b: hydrocephalus f,g : reduced cc thickness Liedtke 1996

29 GFAP interacting proteins Plektin - nagyméretú fehérje, (c500 kda), - majd minden emlős sejtben: aktin/mt/if kapcsolat és sejt-sejt kapcsolat - GFAP rod-doménjéhez köt val.szeg - Alexander disease-ben mutáns GFAP és csökkent plektin-szint: Rosenthalfiber formation Tien 2006 Presenilin - specifikusan GFAPd farki részével kapcsolódik - transzmembrán fehérje, mutáns változatai : Alzheimer s disease Lamp2a és EF1a - lásd korábban, autofágia

30 GFAP interacting proteins proteins - nagy család, rengeteg (több mint 100) szignalizációs fehérjét (kinázok,foszfatázok, transzembrán receptorok... ) tudnak kötni, minden eukarióta sejtben vannak! - asztroban 7 izoformájuk van jelen, a g izoforma GFAPval vimentintől függetlenül kötődik, GFAP foszforiláltságtól (és sejtciklustól) függően - emberben inkább e, b, izoformák vannak GFAP-val kapcsolatban In interphase, the filamentous structure of GFAP is in a lower phosphorylation state, which then gradually increases during S to G2/M phases of the cell cycle. During interphase, proteins were observed distributed freely or colocalized with dots of soluble GFAP, with little bound to GFAP filaments. Hyperphosphorylation of the IF proteins resulted in the disassembly of IF networks when cells entered mitosis in some cell types. During prophase, proteins were mainly bound to GFAP filaments that were about to disassemble. Therefore, proteins can associate with nonfilamentous GFAP in astrocytes during interphase, and bind to filamentous GFAP during the G2/M phase of the cell cycle. These results indicate that the cell cycle dependent association of with GFAP filaments and the subsequent filament disassembly is likely to be due to phosphorylation of GFAP by cell cycle-dependent kinases.