A SEJTSZÓRÓDÁSBAN RÉSZTVEVO JELÁTVITELI UTAK VIZSGÁLATA: A PROTEIN KINÁZ C SZEREPE. Gujdár Annamária. Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei

Átírás

1 A SEJTSZÓRÓDÁSBAN RÉSZTVEVO JELÁTVITELI UTAK VIZSGÁLATA: A ROTEIN KINÁZ C SZEREE Gujdár Annamária Doktori (h.d.) értekezés tézisei Témavezeto: Dr. Faragó Anna egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és athobiokémiai Intézet (2004) Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

2 BEVEZETÉS Az invazív sejtproliferáció, azaz a sejtszóródással kísért proliferáció, számos fiziológiás folyamat nélkülözhetetlen eleme, patológiás körülmények között viszont a daganatok metasztázis képzésének egyik komponense. A legismertebb, fiziológiás szóródást indukáló faktor a hepatocita növekedési faktor (HGF), munkacsoportunk ennek a jelpálya rendszerét vizsgálja. A HGF akkor fejti ki biológiai hatásait, ha receptorához, a met protoonkogén által kódolt, tirozin-kináz aktivitással rendelkezo c-met-hez kötodik. A c-met heterodimer szerkezetu molekula,? és? alegységekbol áll, melyeket egy diszulfid híd köt össze. Az? alegység a sejt külso felszínén helyezkedik el, tömege 50 kda, erosen glikozilált. A? lánc, amely 145 kda-os, egy exracelluláris, egy transzmembrán és intracelluláris doménekbol áll. A receptor intracelluláris, C terminális, részén megtalálható a kináz domén, illetve az autofoszforilációra alkalmas tirozin oldalláncok, köztük a multiszubsztrát dokkoló hely, ahonnan a receptoraktiváció hatására különbözo jelpályák indulhatnak el. A ligand kötodése után két receptormolekula dimerizálódik, majd tirozin-kináz doménjeik segítségével egymást több tirozin oldalláncon keresztfoszforilálják az AT? helyzetu foszfátjának terhére. Ezt a jelenséget nevezik autofoszforilációnak, amely a tirozin-kináz receptorokra általánosan jellemzo. A Met receptoron elhelyezkedo, úgynevezett multiszubsztrát dokkoló helyekhez az oket specifikusan felismero fehérjék SH2 illetve TB doménjeikkel tudnak kötodni. 1

3 A c-met receptorra jellemzo, hogy a Gab1 dokkoló fehérje specifikus aminósav szekvenciájával közvetlenül is kötodik a fehérjéhez, HGF hatására több tirozin oldalláncon foszforilálódik, és a receptor muködésében kiemelkedoen fontos szerepet játszik. A Met receptor által stimulált invazív proliferációban esszenciális szerepe van a foszfatidilinozitol 3-kináznak (I3K), az Erk1/Erk2 MA kináz kaszkád aktiválódásának és az Src kináznak. (1.ábra) tirozin kináz domén multidokkoló hely jelerosítés Gab1 Shc Src kináz I(3)K Ras Stat LC? Rac Akt/KB Erk1/Erk2 branched morfogenezis migráció túlélési jel proliferáció migráció 1.ábra A Met receptorról induló különbözo jelátviteli utak 2

4 A Met receptor által indított jelpályában az I A osztályba tartozó I 3- kináznak van szerepe. Minthogy ez mind a receptor multidokkoló helyérol, mind a Gab 1-rol aktiválódik, a HGF a I3-kináz eros aktiválódását indukálja. A I 3-kináz aktiválódása szükséges a túlélési jelhez és a proliferációhoz. Egyik fontos szerepe a protein kináz B aktiválódásának az eloidézése. A HGF által indukált migrációhoz vezeto útvonalon esszenciálisnak tartják a I 3-kináz szerepét a Rac GT-köto fehérje aktiválódásában, és az aktin citoszkeleton átrendezodésében. Ugyancsak mind a Met receptorról, mind a Gab 1-rol elindulhat az Erk1/Erk2 MA kinázok aktiválásához vezeto jelpálya. AZ ÉRTEKEZÉSBEN ÖSSZEFOGLALT MUNKA KÖZVETLEN ELOZMÉNYEI A munkacsoport, melyhez elobb tudományos diákköri hallgatóként, majd hd hallgatóként csatlakoztam, évek óta foglalkozik az invazív proliferációt irányító jelpályák szabályozási folyamataival. Ezekhez a vizsgálatokhoz modell sejtként a HepG2 humán hepatoma sejtek szolgálnak. A HepG2 sejtek viszonylag differenciált sejtek, igen sok képességükben hasonlítanak a nem daganatos májsejtekhez. Az invazív proliferáció vizsgálatához azért különösen jó modellek, mert HGF/scatter faktorral enyhe szóródásra serkenthetoek, a HGF-hez teljesen hasonló jelpálya modulokat használó EGF egyáltalán nem képes szóródást indukálni ezekben a sejtekben, ezzel szemben a protein kináz C-t permanensen aktiváló forbol észter a HepG2 sejtek igen eros szóródását hozza létre. A munkacsoport vizsgálati stratégiája kezdettol fogva az EGF 3

5 és HGF jelpályák közti különbségek, illetve a HGF és a forbol észter által stimulált mechanizmusok közti hasonlóságok és különbségek kimutatásán alapul. Ezen vizsgálatok legfontosabb eredményei, amelyek az értekezésben összefoglalt munka kiindulási pontját jelentik, a következok: 1. Kiderült, hogy az ERK1/2 MA kinázok aktiválódása nélkülözhetetlen feltétele a HepG2 sejtek szóródásának, akár HGF, akár forbol észter által indukált szóródásról van szó. (Korábban csak a I 3-kináz szóródásban betöltött szerepét hangsúlyozták, az Erk1/2 aktiválódását csak proliferációs jelnek tartották.) 2. A munkacsoport kimutatta, hogy a HGF-fel indukált jelpályában a I3- kináz aktivitása hozzájárul az Erk1/Erk2 aktiválódás intenzitásának fokozódásához, míg az EGF jelpályájában a I3-kináznak nincs ilyen hatása. 3. Összehasonlítva a HGF, EGF, illetve a forbol észter által stimulált Erk1/Erk2 aktiválódás kinetikáját, nyilvánvalóvá vált, hogy a szóródást kiváltó stimulusok hosszantartó (6-8 óra, vagy több) Erk1/Erk2 aktiválódást hoznak létre, míg a szóródást kiváltani nem tudó EGF által létrehozott Erk1/Erk2 aktiválódás sokkal rövidebb ideig tart (3 óra alatt lecseng). 4. Az Erk1/Erk2 MA kináz kaszkád nagyon intenzív aktiválódása viszont, a p21 fehérje expressziójának fokozódása révén, összefüggésbe hozható a sejtszóródást kíséro átmeneti növekedés gátlással. Ezek a megfigyelések vezettek ahhoz a következtetéshez, hogy a vizsgált rendszerben, a biológiai válasz jellegét, vagyis hogy migrációval vagy proliferációval válaszol a sejt egy adott jelre, azt a mindkét válaszban szerepet játszó jelpályák aktiválódásának intenzitása és idotartama határozza meg. 4

6 5. A fenti következtetést egészítette ki egy másik megfigyelés (az ehhez vezeto kísérletekben már én is részt vettem), miszerint a HGF jelpályában (de az EGF jelpályában nem), a protein kináz C csökkenti az Erk1/Erk2 intenzív aktiválódásának idotartamát. A vázolt eredmények alapján rajzolódott ki az a feltételezés, hogy a HGF által indukált invazív proliferáció során a migráció és proliferáció koordinálását egy olyan szabályozó rendszer végezheti, amely a mindkét fajta válaszhoz vezeto jelpályák aktiválódásának intenzitását és idotartamát képes negatívan modulálni. A HGF jelpályában a negatív moduláló szerepre az Erk1/Erk2 aktiválódásra gyakorolt hatása révén felmerült a protein kináz C mint lehetséges jelölt, ugyanakkor, ezzel ellentétben, a forbol észter által kiváltott szóródásban a protein kináz C pozitív szerepe volt valószínusítheto. (2.ábra) AZ ÉRTEKEZÉSBEN ÖSSZEFOGLALT MUNKA CÉLKITUZÉSEI 1. Bizonyítani kívántam, hogy a protein kináz C ellentétes szerepeket játszik nem csupán a HGF és forbol észter Erk1/Erk2 aktiválódására, hanem általában a migrációra gyakorolt hatásában is. 2. Célom volt feltérképezni, hogy a HepG2 sejtek migrációja az aktin citoszkeleton milyen jellegu átrendezodését igényli, illetve a forbol észterrel indukált jelpályák miben hasonlítanak, és miben különböznek a Met receptor által indított jelpályáktól. 5

7 3. Igyekeztem felderíteni azt a biokémiai mechanizmust, amelynek segítségével a protein kináz C betöltheti a negatív modulátor szerepét a HGF jelpályában. HGF c-met Gab1 Erk1/2 MA kinázok Foszfatidilinozitol 3-kináz növekedési jel túlélési jel migráció 2. ábra A HGF jelpálya munkacsoportunk korábbi munkája során kialakult modellje EREDMÉNYEK 1. Kimutattuk, hogy a KC ellentétes szerepet játszik a HepG2 sejtek forbol észterrel, illetve HGF/scatter faktorral kiváltott szóródásának szabályozásában. Míg az elsoért a KC intenzív aktiválódása a felelos, a 6

8 HGF által indukált szóródás intenzitását a KC aktivitása negatívan modulálja. 2. Megfigyeltük, hogy a forbol észterrel kiváltott eros migrációt nagyszámú, hosszú aktin filamentum képzodése kíséri. A forbol észterrel aktivált KC hatására indukálódó aktin polimerizáció nem gátlódik a I 3- kináz enzim gátlásakor, jelezve, hogy ebben a mechanizmusban nem a I 3-kinázé az iniciátor szerep. A forbol észterrel indukált migrációt nem gátolja az Src tirozin-kináz gátlása sem. 3. Kimutattuk, hogy a p21-aktivált protein kináz (AK) aktiválódik forbol észterrel kezelt sejtekben és ezt a jelenséget sem védi ki sem a I 3-kináz, sem az Src kináz gátlása. A AK1 izoforma mennyisége átmenetileg csökken a migráció során. 4. Kimutattuk, hogy a HepG2 sejtek migrációját az? 2 és? 1 integrinek expressziójának fokozódása kíséri. Megállapítottuk, hogy a forbol észterrel aktivált KC integrin expresszió fokozódást indukál, míg a HGF jelpályában a KC csökkenti az integrin expresszió intenzitását. A növekedési faktorral kiváltott integrin expresszióhoz szükséges a I 3- kináz aktivitása is. 5. Kimutattuk, hogy a HGF hatására aktiválódó I 3-kináz aktiválódásának idotartama a KC gátlásakor növekszik. A KC-nak nincs ilyen hatása az EGF jelpályában, ahol a I 3-kináz aktiválódását a dokkoló foszfotirozinok elvesztése terminálja. Valószínu, hogy a KC HGF jelpályára gyakorolt negatív hatásának a molekuláris alapja, a migráció stimulálásában esszenciális szerepet játszó I 3-kináz aktiválódása idotartamának csökkentése. Ezzel szemben, az is valószínusítheto, hogy a forbol észterrel nagyon intenzíven aktivált KC olyan, alternatív jelpályán keresztül képes stimulálni a migrációt, amelyhez nem szükséges a I 3- kináz aktiválása. 7

9 HGF Met I Gab1 I I Y Y Y I 3K LC Nem I 3K Forbol észter KC Erk1/2 Túlélési jel - + KC Erk1/2 Növekedési jel Aktin citoszkeleton Migráció 3. ábra A KC migrációra gyakorolt ellentétes hatásainak modellje (Az Y jelölés a foszfotirozinokat szimbolizálja.) 8

10 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK Az értekezésben bemutatott eredmények közvetlen elozménye: Szabolcs Sipeki, Erzsébet Bander, Gyöngyi Farkas, Annamária Gujdár, D. Kirk Ways, Anna Faragó rotein kinase C decreases the hepatocyte growth factor-induced activation of Erk1/Erk2 MA kinases. Cellular Signalling 12 (2000) IF: 3,3 Az értekezésben összefoglalt munka az alábbi közleményeken alapul: Annamária Gujdár, Szabolcs Sipeki, Erzsébet Bander, László Buday, Anna Faragó horbol ester-induced migration of HepG2 cells is accompained by intensive stress fibre formation, enhanced integrin expression and transient down-regulation of p21-activated kinase 1 Cellular Signalling 15 (2003) IF: 4,4 Annamária Gujdár, Szabolcs Sipeki, Erzsébet Bander, László Buday, Anna Faragó rotein kinase C modulates negatively the hepatocyte growth factorinduced migration, integrin expression and phosphatidylinositol 3-kinase activation Cellular Signalling 16 (2004) IF:4,4 9