Neurotoxikológia VII. Neurotoxikológiai vizsgáló módszerek elektrofiziológia és viselkedésvizsgálat

Átírás

1 Neurotoxikológia VII. Neurotoxikológiai vizsgáló módszerek elektrofiziológia és viselkedésvizsgálat

2 primer neuronális, idegi őssejtvagy glia sejttenyészetek kokultúrák (többféle sejttípus) sejtvonalak (neuroblastoma, glioma, astrocytoma) túlélő agyszeletek sejtpusztulás elektromos aktivitás neurotranszmitter-leadás nyúlványnövekedés In vitro modellek

3 Szinte minden elektrofiziológiai módszer használható neurotoxikus hatás kimutatására, molekuláris szinttől a teljes idegrendszer szintjéig. Patch clamp technikák Egyes ioncsatornák vizsgálata (single channel) Cell-attached patch clamp anyagadás nem lehetséges közvetlenül, intakt intracell. folyamatok Inside-out patch ha sejten belül van a vizsgált toxin célpontja Outside-out patch ha a sejt külső felszínén van a célpont - utóbbi 2 hátránya, hogy sejten belüli folyamatok nem érvényesülnek (washout) Elektrofiziológia

4 Elektrofiziológia Áramok alapján a csatorna nyitott vagy zárt állapotát lehet megkülönböztetni. Ha állandó A, akkor valóban egy db csatorna. Csatorna nyitvatartási idejét, nyitás valószínűségét, frekvenciáját változtathatják biz. anyagok. Pl. nehézfémek Ca 2+ -csatorna nyitvatartási idő ( flickery block ) TTX: Na + -csatorna nyitási frekvencia Pb 2+ : NMDAR nyitási frekvencia Egy csatorna regisztrálás, nehézfémek hatása Ca-csatornán

5 Whole-cell recording Mért ionáram Elektrofiziológia egyes csatornák konduktanciája csatornák nyitási valószínűsége csatornák nyitvatartási ideje Voltage clamp 1 v 2 éles mikroelektróddal (sejtméret) Whole-cell patch clamp intracell. folyadék = pipettában lévő folyadék (hátrány: intracell folyamatok elvesztése+előny: ionáramok farmakológiai szétválasztása) Perforált patch (pórusformáló anyagok: nystatin, amphotericin-b) - hátrány: nehezebben Gseal, idő, amíg beépülnek a pórusok - előny: ionokat átengedik a pórusok, szerves molekulákat nem (nincs washout, de lehet szelektíven ionáramokat blokkolni)

6 Courant [pa] Elektrofiziológia Whole-cell recording módszerrel mérhető anyaghatások: Ionáramok amplitúdó-változása (csatorna aktivátor/blokkoló) Csatorna aktivációjának, inaktivációjának feszültségfüggése Csatorna aktiváció, inaktiváció időtartama pl. DDT, piretroidok feszültségfüggő Na + -csatorna inaktiváció lassítása c003_002 MiNa4/ Intraneu9 Lobes antennaires nymphes J3 P80 3ms 10 fois 5120ms leaksub4 V= 70mV t=120s 200 Rs comp Esfenvalerate 10µM controle ms ms

7 Elektrofiziológia Szinaptikus transzmisszió vizsgálata Perifériás idegrendszer: pl. neuromuszkuláris junkció (izomösszehúzódás gátolva) Preszinaptikus működés- perineurális regisztrálás elektród az axonvégződéshez közel a mielinhüvelybe, Ranvier-befűződésekből + szinapszisból eredő Na +, K +, Ca 2+ áramokhoz köthető potenciálváltozások Posztszinaptikus működés motoros véglemezből intracelluláris elvezetés/patch clamp ACh adagolása v ideg ingerlése- nachr-on ható anyagok vizsgálata

8 Elektrofiziológia Központi idegrendszer (szinaptikus transzmisszió vizsgálata) Túlélő agyszeletek Extracelluláris regisztrálás (mezőpotenciálok) - legjobban jellemzett agyterület: hippocampus (POP spike, EPSP) - egyéb agyterületek, neocortex - plaszticitás (PP, LTP), görcskészség vizsgálata pl. ólom LTP, MeHg POP, EPSP EPSP slope population spike Fipronil (GABAR-antagonista rovarirtószer) hatása neokortikális mezőpotenciálra 1 mv 10 ms

9 Elektrofiziológia Intracelluláris regisztrálás Patch clamp - egyetlen sejt (membránpotenciál, bemenő ellenállás) - egyedi ionáramok - spontán miniatűr EPSP, IPSP Bensultap (neonikotinoid rovarirtószer) hatása ACh-nal kiváltott áramra Metilhigany hatása Purkinje-sejt tüzelésére

10 Elektrofiziológia Optikai technikák Feszültségérzékeny festékek Lassú: festék a membránpotenciál változásával transzportálódik a sejtbe Gyors: festék abszorpciója/fluoreszcenciája a membránpotenciállal változik Ionszenzitív festékek pl. Ca 2+ Sejten belüli Ca 2+ -koncentrációtól függően a festék fluoreszcenciája változik Belső optikai jelek detektálása In vivo: vérátáramlás lokális különbségei adnak optikai jelet In vitro: ionáramlás miatt sejtek duzzadnak/zsugorodnak, fénytörés változik Ca 2+ -szignálok sejttenyészetben

11 Elektrofiziológia In vivo regisztrálás Krónikus elektródok beépítése - Field potenciál mérés pl. LTP - Spontán EEG mérése Akut praparátum (altatott állat) Piretroid rovarirtószer ismételt adásával kiváltott görcsaktivitás

12 Elektrofiziológia Ingerületvezetési sebesség mérése Patkány, nyúl n. ischiadicus Pl. organofoszfát rovarirtók csökkentik a vezetési sebességet (demielinizáció)

13 Elektrofiziológia Szenzoros kiváltott potenciálok Komplex idegi hálózat vizsgálata Sok neurotoxin okoz szenzoros diszfunkciót Jel alakjának, latenciaidejének elemzése ERG (elektroretinogram) fotoreceptorok, ganglionsejtek Vizuális KP (fényfelvillanás vagy mintázatok hatására) Hallókérgi KP Szomatoszenzoros KP (neocortex vagy kisagy felett) Patkány ERG Vizuális KP

14 Viselkedésvizsgálatok Irwin-teszt aktivitásvizsgálat főként KIR-en ható szerek gyors tesztelésére felnőtt hím egereken reakció kézbevételkor, testtónus, testtartás, járás, éberség, bőr, szőrzet spontán viselkedés (pl. önápolás, hangadás) kóros jelenségek (remegés, görcsök, abnormális járás) reflexek (szemhéj, pupilla, kapaszkodás ferde lemezen, ráhelyezés)

15 Viselkedésvizsgálatok Open field (explorációs motilitás, viselkedéselemek) aktivitásnövekedés idegi eredetű aktivitáscsökkenésnek lehet más oka is (pl. perifériás neuropátia, bénulás) útvonal a szorongási szintről is informál Forgó rúd (Rotarod) mozgáskoordináció, egyensúlyozás

16 Viselkedésvizsgálatok Szenzoros működés vizsgálata pszichofizikai vizsgálatok pl. ingerküszöbök meghatározása fájdalomküszöb, latenciaidő mérése hot plate-tel reakcióidő mérése hang/fényimpulzusra megrezzenési válasz (startle reflex) PPI hiánya: dopamin-receptor agonisták, 5-HT2 receptor agonisták; NMDAR antagonisták; fejlődéstani beavatkozás (pl. izolált felnevelés, anyától elszakítás) A startle reflex gátlása (pre-pulse inhibition -PPI)

17 Viselkedésvizsgálatok Szenzoros működést károsító anyagok MeHg - látótércsökkenés CS 2 színlátás halláscsökkenés aminoglikozid ab, szalicilátok, szerves oldószerek, szerves ón-vegy akrilamid szomatoszenzoros érzékelés (axonopátia) metilbromid (szaglás) sodium-lauryl-sulphate: SLS (ízérzékelés)

18 Viselkedésvizsgálatok Tanulási vizsgálatok klasszikus kondicionálás operáns kondicionálás információ elsajátítása, kioltása

19 Memória vizsgálatok kondicionált félelmi reakció labirintus Morris vízi labirintus Viselkedésvizsgálatok

20 súly (g) Fejlődéstani neurotoxikológia prenatális vagy neonatális expozíció pl. nehézfémek, növényvédőszerek, toxinok, alkohol, kábítószerek nagy dózis morfológiai, kis dózis funkcionális eltérések Vizsgálatok fizikai fejlődés (szem, fül nyílása, szőrzet, testtömeg, elválasztás ideje) motoros koordináció (open field, rotarod) testtartás, reflexek tanulási és memóriatesztek szociális interakció első alom napok kon troll kez elt

21 Képalkotó módszerek daganatok, egyéb elváltozások kimutatása funkcionális vizsgálatok (agyterületek vérátáramlása, anyagcseréje)

22 Számítógépes rétegfelvételezés (Computer Tomography, CT)

23 Számítógépes rétegfelvételezés (Computer Tomography, CT) CT A képalkotáshoz röntgensugárzást használ, ehhez mindenképpen szükséges a kontraszt javítása különböző kontraszt anyagok használatával (pl. jód izotóp). A felvételek során röntgensugár-detektor és vele szemben elhelyezett röntgensugárforrás körbeforog sík metszetek rétegfelvétel A detektor sugárforrás páros a test hossztengelye mentén elmozdul a rétegfelvételek térbeli képpé alakíthatók MRI Hátránya: kicsi feloldóképesség sugárterhelés Az ábrán CT-vel csak egy, MRI-vel több metasztázis látható

24 Pozitron emissziós topográfia (PET) Bizonyos szempontból hasonlít a CT-hez a pozitronemissziós tomográfia (PET). Ennél a módszernél egy nem stabil izotóp bomlásakor kibocsátott pozitron egy elektronnal való találkozásakor kisugárzott gamma-fotonokat detektálják. A pozitron egy antianyag-részecske, az elektron antirészecskéje. Amikor egy részecske és annak antianyag-párja találkozik, akkor mindkét anyagi részecske megsemmisül, és két nagyenergiájú foton sugárzódik ki egymással ellentétes irányban (baloldali ábra). A PET berendezés ezeknek a fotonoknak a számát méri. A páciens szervezetébe olyan izotópot juttatnak, amely bomlásakor pozitront sugároz ki. Erre tipikus példa a fluor 18-as izotópja. A fluoratomokat egy, a cukorral rokon vegyületben megkötött formában (fluor-dezoxi-glukóz) adják a páciensnek. Ez az anyag így a szervezet anyagcsere-folyamatait követve olyan helyekre jut el, ahová a cukor is eljutna. A kibocsátott pozitronok száma és így a másodlagos folyamatban keletkező fotonok száma arányos a fluoratomok számával. Vagyis, ha egy tomografikus intenzitástérképet vesznek fel, tér- és időbeli képet kaphatnak az anyagcsere-folyamatok lezajlásáról. Így ez a módszer lehetőséget nyújt pl. az agy különböző területeinek és az ott lezajló folyamatoknak a vizsgálatára. Az agy működéséről pozitronemissziós tomográfiával kapott információ egy agyvérzéses beteg esetén.

25 Pozitron emissziós topográfia (PET) A képalkotáshoz a radiofarmakonból felszabaduló g-fotonokat használja A szervezetbe radioaktív izotóppal jelzett farmakonokat juttatnak. A beadott anyagok a felhasználás helyein felhalmozódnak. A beadott anyagok mennyiségi változása időben követhető. Metionin transzverzális PET kép. Jobb oldali frontális glioma Radiofarmakonok: 18F-dezoxi-D-glükóz (FDG) a cukor felhasználást mutatja 11C-metionin az aminosav anyagcserét jelzi 18F-Dopa preszinaptikus D2 receptoraktivitást jelzi 11C-racloprid posztszinaptikus D2 receptoraktivitást jelzi 18F-FDG coronalis mellkas PET. Tüdő daganat és áttétei 18F-FDG transzverzális PET kép. Csökkent cukoranyagcsere bal oldalon az epileptogén areának megfelelően (alsó sor, nyíl); ugyanitt vérátáramlás fokozódás ictalis SPECT vizsgálat során (felső sor)

26 Mágneses rezonancia képalkotás (MRI) A képalkotáshoz a magmágneses rezonancia változását használja, a vízben található hidrogénatomok jelét érzékeli (H- NMR). A szervezetet erős mágneses térbe helyezve, az átmágneseződik. A vizsgált szerv fölé ún. gradiens tekercset helyeznek. Állandó mágneses tér a hidrogén atomok mágneses dipólusa egyirányú nagy frekvenciájú rádiósugárzás a mágneses dipólus megváltozik mérik az alapállapotba visszatérő H atomok kibocsátotta elektromágneses hullámokat A egyes kis térrészekről (voxel) érkező információkat a számítógép integrálja. Előnye: jó felbontású (mm) kép 4-8 s-nyi időfelbontás Funkcionális MRI (fmri) Állandó erős mágneses teret kialakító szupravezető tekercs Gradiens tekercsek, a vizsgált szerv körül

27 Ultrahang 20 ezer Hz-nél nagyobb rezgésszámú, az emberi fülnek hallhatatlan hang. Némelyik állat, pl. a denevér és a kutya hallanak bizonyos ultrahangjeleket. A nagyon nagy frekvenciájú hangot a különféle anyagok (pl. az emberi test különféle szövetei) más-más mértékben verik vissza. Ha egy hanglokátort összekapcsolnak egy számítógéppel, akkor pontosan megjeleníthető a vizsgált anyag szerkezete (gyógyászatilag előnyös módon, mert viszonylag kicsi a sérülés, az ártalom valószínűsége). Az ultrahangot ezért általánosan használják orvosi átvilágításra (ultrahang diagnosztika pl. a magzat vizsgálatára - a képen). Használják műszaki célokra is (pl. vasúti sínek repedéseinek felderítésére). Az ultrahangot nagyfrekvenciás rezgés-átalakítókkal (transzduktorokkal) hozzák létre és érzékelik. Az ultrahanggal foglalkozó tudományágat ultrahangtannak nevezik.