A mozgatás, tároló médiumok és az antibiotikumok hatása az osteochondralis 1. allograftok életképességére

Átírás

1 A Nyugat-magyarországi Regionális Szövetbank, Petz Aladár Megyei Oktató Kórház, Gyõr és a MÁV Kórház, Traumatológiai Osztály, Budapest* közleménye A mozgatás, tároló médiumok és az antibiotikumok hatása az osteochondralis 1 allograftok életképességére DR. CSÖNGE LAJOS, DR. BAKAY ANDRÁS*, DR. PELLET SÁNDOR, SIMONNÉ KORDOSS KATALIN, GODA MÁRIA Érkezett: március 19. ÖSSZEFOGLALÁS A porcsérülések, a csont tumoros és ízületi degenerációban szenvedõ betegek mûtéti kezelésében Magyarországon is egyre nagyobb számban transzplantálnak osteochondralis allograftokat. A klinikai sikeresség egyik fontos tényezõje az implantált porcgraft életképességének a megõrzése, mivel a mûködõ chondrocyták biztosítják a porcmátrix struktúrájának fennmaradását. A humán porcgraftokat aszeptikus tápoldatban +4 C-on tárolták 60 napon keresztül, 15 naponta megmérve az életképességi indexet egy metiltetrazóliumsó (MTT) konverzióján alapuló teszt segítségével. A szerzõk három tényezõt vizsgáltak a humán ízületi porc életképességének szempontjából: 1. a graftok passzív mozgatásának hatását 2. négyféle szövetkultúra tápfolyadék hatását (Ringer-oldat, RPMI-1640, IMDM, X-Vivo 10) 3. a gyõri Szövetbankban alkalmazott ceftazidim, amphotericin-b, penicillin kombináció potenciális toxikus hatását. A passzív mozgatásnak nincs sem pozitív, sem negatív hatása a porcszövetre. A graftok különbözõ tápfolyadékok hatására sem mutattak szignifikáns különbséget az életképességi indexben 60 tárolási napon keresztül. Mivel a médiumok között jelentõs árkülönbség van, meggondolandó az olcsóbbak használata. A cardiovascularis graftok sejtjeinél leírt toxikus hatás nem volt mérhetõ humán ízületi porc esetén a szerzõk által használt antibiotikumoknál és antimikotikumoknál, sem egyenként, sem kombinációban alkalmazva. Kulcsszavak: Osteochondralis autograft Transzplantáció; Szövetbank; Szövetkonzerválás Módszerek; Szövetkultúra médium; Antibiotikumok; L. Csönge, A. Bakay, S. Pellet, K. Simonné Kordoss, M. Goda: The effect of motion, medium and antibiotics on the vitality of osteochondral allografts The number of osteochondral allograft transplantation is increasing even in Hungary in the cases of cartilage injuries, joint degeneration and bone tumours. One of the most important factors concerning the success is to save vitality of the transplanted cartilage, because living chondrocytes are needed for keeping the structure of cartilage matrix. The human cartilage transplant is kept in aseptic solution on +4 Celsius for 60 days, measuring the vitality index with the MTT test. The authors investigated three different factors from the respect of human cartilage vitality: 1. Effect of passive motion. 2. Effect of four different mediums (Ringer solution, RPMI-1640, IMDM, X-Vivo 10). 3. Potencially toxic effect of ceftazidim, amphotericin-b, penicillin combination applied in Tissue Bank Gyõr. There was not any effect of passive motion on the cartilage. There was no difference concerning the vitality index in the three different mediums for 60 days, therefore the cheaper is the better. Contrary to the cardiovascular grafts there was no measurable toxic effect on the human cartilage with the mentioned antibiotics, neither alone nor in combination. Key words: Cartilage, articular Transplantation; Tissue banks; Tissue survival; Tissue culture Methods; Culture media; Tissue preservation Methods; Antibiotics Administration and dorsage; 1 Támogatta: OTKA T , ETT 55/2000, ETT 524/00 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

2 BEVEZETÉS A balesetek, sportsérülések, csont és porctumorok valamint a különbözõ porcfelszínt érintõ degeneratív megbetegedések növekvõ száma miatt egyre nagyobb az ízületi porcrekonstrukció iránti igény (31). A porcdefektusok, porcdegenerációk egy része több-kevesebb sikerrel spontán gyógyul, regenerálódik, azonban bizonyos porcdefektus méret fölött szükséges az ízületi felszín helyreállítása, amennyiben konzervatív módon kezelve nem várható annak gyógyulása, vagy legalább a beteg panaszainak csökkenése. Magyarországon Hangody László és mtsai (17, 18) értek el nemzetközi mércével mérve is figyelemre méltó eredményeket az autológ porcpótlás területén. Kadáver szövetdonorokból származó kis-, és nagyméretû csontot és porcot tartalmazó úgynevezett osteochondralis allograftokat gyakran használnak tumoros vagy degeneratív és traumás eredetû porcdefektus pótlására (4, 5, 6). A világon az elsõk között Pap és Krompecher közöltek e területen alapvetõ és máig gyakran citált megfigyeléseket ben (26). Daganatos betegeknél a szalagokat és ízületi tokot is tartalmazó nagy, úgynevezett masszív osteochondralis allograftok felhasználásával számos végtagmegtartó és ízületi felszínt helyreállító mûtétet végeznek (21, 22). Az osteochondralis graftokat megfelelõ donorszelekció, szerológiai szûrés és mikrobiológiai vizsgálat után szövetbankokban aszeptikus körülmények között konzerválják és tárolják, majd a transzplantációt végzõ klinikusnak átadják, amennyiben a recipiens számára megfelelõ allograft áll rendelkezésre (9, 13). A porc allograftok beépülésének és megfelelõ funkciójának egyik fontos tényezõje a graft porcmátrix struktúrájának megõrzése. Ezt többek között a chondrocyták által szintetizált mátrixmolekulák, glükózaminoglikánok (GAG), kollagén stb. biztosítják (20). Így az egyik legfontosabb feladat a porcsejtek életképességének és funkciójának megtartása. A kadáver eredetû osteochondralis graftok konzerválása során idáig leghatékonyabbnak a szövetkultúra médiumban történt tárolás bizonyult, amellyel még 60 nap tárolás után is 35%-os életképességi indexet detektáltak (10). Ezt a relatíve kedvezõ arányt azonban még tovább kellene növelni, minél jobb életképességet elérve, ami elõsegíti a klinikai gyógyulást is. A következõ tényezõket vizsgáltuk meg, amelyek befolyásolhatják az életképességet: 1. Mivel a felnõtt hialinporcot döntõen a synovialis folyadékban levõ anyagok táplálják diffúzió útján, amit elõsegít az ízületi mozgás, (24) meg kívántuk vizsgálni a passszív in vitro mozgatás hatását a porc életképességére szövetkultúra médiumban tárolva a graftokat. 2. Négyféle szövetkultúra médium hatását teszteltük. Az irodalomban ismert volt számos konzerváló oldat, amelyben hosszabb-rövidebb ideig tárolták az osteochondralis graftokat, de a kiválasztás gyakran önkényes, tudományos igényû bizonyítékok híján nem kellõen megalapozott, néha úgy tûnik véletlenszerû (2, 8, 7, 27, 16, 32). 3. Ismert a tároló médiumokban alkalmazott egyes antibiotikumok, antimikotikumok toxikus hatása a szívbillentyûk és érgraftok sejtjeire (1, 14, 19). Mivel porcgraftok esetén errõl még nem közöltek adatokat, ugyanezt a potenciális toxikus hatást megvizsgáltuk a konzervált porcban a Nyugat-magyarországi Regionális Szövetbankban rutinszerûen használt antibiotikum kombinációnál (11). ANYAG ÉS MÓDSZER Szövetdonorokból származó identikus kontralaterális femoralis osteochondralis graftokat 100 ml X-Vivo 10 tápfolyadékba helyeztünk aszeptikus körülmények között, kü- 248 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

3 lön-külön mûanyag zacskóba lehegesztve. Ez a tápoldat eredetileg lymphocyta kultúrák életben tartására szolgál, az USA-ban klinikai transzplantációs célra szánt szövetek általános tároló illetve mosóoldata, amelyet az FDA (Food and Drug Administration) engedélyezett ilyen célra. A donorokat az Európai Szövetbankok Szövetségének standardjai alapján szelektáltuk, a graftok eltávolítása post mortem legkésõbb 24 órán belül megtörtént aszeptikus körülmények között (13). Az egyes graftokat egyenként sterilen lezártuk a médiumot tartalmazó mûanyag zacskókba és +4 C-on tároltuk õket ugyanolyan körülmények között. A 0., 15., 30., 45., és 60. napon történt a graftok életképességének vizsgálata teljes vastagságú porcbiopsziákból, subchondralis csont nélkül. A mozgatási kísérletnél 10 naponta mértük az életképességet. Egy-egy graftból 8-10 négy mm átmérõjû biopszia életképességét vizsgáltuk. A porcszövet életképességét az általunk porcra adaptált módszerrel teszteltük: metiltetrazóliumsó 1mg/ml-es oldatában inkubálva az élõ chondrocyták mitokondriális enzimei a sót lila pigmentté alakítják (MTT-Formazan), ami cellosolve oldattal kioldható. A színintenzitást - amely arányos a vitális enzimek aktivitásával - spektrofotométerrel mértük 563 nm-es hullámhossznál. Az életképességet egy ún. életképességi indexszel fejeztük ki: elnyelés 563 nm-nél/mg porc/ml oldószer (10). Az eltérõ donorporcok életképesség változását az egyes idõpontokban relatív %- os életképességben fejeztük ki (100 %-nak véve a 0 napos, friss kadáverporc életképességét), hogy összehasonlíthatók legyenek. 1. Passzív mozgatás E célra speciális hûtõszekrénybe építhetõ szerkezetet konstruáltunk teflon csúszótengelyekkel, amely képes hosszú idõn keresztül folyamatos mozgatásra, csapágykárosodás nélkül. A laboratóriumi rázógépek e célra nem alkalmasak. 9 donorból származó identikus kontralaterális graftcsoportot vizsgáltunk. Az egyik csoportot mozgattuk, 1/sec frekvenciával 10 cm-es amplitúdóval folyamatosan +4 C-on tárolva, a másik csoportot nem mozgattuk, ugyanolyan hõfokon tárolva. A tároló folyadék a fiziológiás viszonyokat némileg utánozva intenzíven és folyamatosan mosta az osteochondralis allograftok porcfelszínét. 2. Szövetkultúra-médiumok A hét donorból származó identikus kontralaterális osteochondralis femoralis graftot 100 ml tápfolyadékba tettünk. négyféle tápoldatot alkalmaztunk: 1. Ringer oldat (Petz Patika, Gyõr) 2. RPMI-1640 (Gibco,UK) 3. IMDM = Iscove s Modified Medium (Sigma.St- Louis, MS) 4. X-Vivo 10 (BioWhittaker, Walkersville, MD). 3. Antibiotikumok, antimikotikum Hét donorból származó tibia graftot tároltunk 60 napig az elõzõleg leírt körülmények között. A tárolás megkezdésekor egy alkalommal négyféle kombinációt adtunk a folyadékhoz: a. amphotericin-b (Fungizone, Squibb,Svájc) 50 mg/liter b. ceftazidime (Fortum Glaxo, UK) 1 g/l + 2 Mó IU penicillin/l (Ampicillin Krka, Szlovénia) c. az elõzõk kombinációja:a + b d. kontroll csoport, gyógyszerek nélkül. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

4 EREDMÉNYEK A mozgatott és nem mozgatott osteochondralis graftok indexét a vizsgálati idõpontokban összehasonlítottuk 2 mintás Student T próba segítségével. Az eredmények a 20. napig azt mutatták, hogy az alacsony frekvenciájú in vitro passzív mozgatásnak minimálisan van csak kedvezõ hatása az ízületi porcszövet életképességére. Ez a különbség p=0,05 valószínûségi szint mellett azonban egyik idõpontban sem mutat szignifikanciát (1. ábra). A tápfolyadékokban tartott osteochondralis graftok sem mutattak szignifikáns indexkülönbséget egyik vizsgált idõpontban sem. (2. ábra). A különbözõ antibiotikum-antimikotikum kombinációk egyike sem csökkentette a porcok életképességi indexét (3. ábra). Passzív mozgatás hatása a porc életképességére in vitro Mozgatás nélkül Mozgatással Relatív %-os életképesség Idõ (napok) 1. ábra p=0.05 szintnél egyik idõpontban sem mérhetõ szignifikáns eltérés a mozgatott és nem mozgatott graftok életképességének indexe között MEGBESZÉLÉS Az elmúlt 25 évben elõtérbe került porcrekonstrukciós konzervatív gyógyszeres illetve mûtéti eljárások közül az egyre inkább elõtérbe kerülõ osteochondralis allograft transzplantációval kapcsolatban néhány speciális körülményt vizsgáltunk meg jelen tanulmányunkban. Ezeknek szerepük lehet az eredményes transzplantációban. A sikeres gyógyulás fontos tényezõje a porc illetve a chondrocyták életképessége és mûködõképessége, amely a porcmátrix molekuláinak szintéziséért és így az egész porcszövet épségéért felel. Elõzetes kísérleteinkbõl világossá vált, hogy a konvencionális cryopraeservatiónál (fagyási károsodástól védõ, úgynevezett cryoprotektív anyagok jelenlétében történõ komputer vezérelte fokozatos fagyasztás) legalább 60 napig jobb életképességi indexet lehet elérni, ha a porcot +4 C-on tároljuk szövetkultúra médiumban (10). 3 tényezõ vizsgálatával kerestünk választ arra a kérdésre: hogy lehet ezt az arányt tovább növelni, illetve a potenciális veszélyeket elkerülni? 250 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

5 A porcgraftok életképességi indexe különbözõ médiumokban 120 Relatív %-os életképesség Ringer X-Vivo 10 IMDM RPMI Tárolási idõ (napok) 2. ábra Bár az X-Vivo 10 médium bizonyult a legjobbnak a tárolás folyamán, a különbség nem szignifikáns Antibiotikumok hatása a porc életképességére Relatív %-os életképesség Tárolási idõ (napok) Amphotericin-B Kombináció Ceftaz+penic Kontroll 3. ábra Ceftaz+penic=ceftazidim+penicillin Az általunk alkalmazott antibiotikum és antimikotikum sem egyenként, sem együtt nem csökkentette a porc életképességét. A 60. napig a passzív mozgatásnak sem kedvezõ, sem kedvezõtlen hatása nincsen az osteochondralis allograftok egyébként intakt porcára a leírt kísérleti körülmények között (1. ábra). Ez feltehetõen a fiziológiás ízületi mozgáskor fellépõ dinamikus kompresszió és ízületi nyomásnövekedés hiányának tudható be, amely elõsegíti porc tápanyagfelvételét a synovialis folyadékból (24). Így az osteochondralis graftok passzív mozgatásával érdemi életképesség emelkedés nem várható. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

6 Egy elõzõleg már ismert jelenség is megfigyelhetõ volt a kísérletek folyamán, tudniillik a rendkívül tápanyag gazdag szövetkultúra médium extrém módon serkentette a chondrocyták mûködését. Benya és Nimni 9 hetes tárolási periódus alatt a GAG és kollagén szintézisben nyolcszoros, a DNS szintézisben harmincszoros növekedést figyelt meg az 1. és 3. héten (7). A 9. hét végére az elõbbiek négyszeres, a DNS a hétszeres szintre csökkent a miénkhez hasonló tárolási körülmények között. Ezt mások is megerõsítették (28). Más szerzõk az említett molekulák kiindulási szinten maradásáról számoltak be (32). Ez egybevág a mi elõzetes megfigyelésünkkel is ti. az anyagcsere és az életképességi index fluktuációt mutat a tárolás folyamán, gyakran még a kiinduló értékeket is meghaladva (10). Ez a porcszövet speciális tulajdonsága, amit más szövettípusoknál még nem írtak le. A graftoknál nagyon fontos hogy az összehasonlítást ugyanarról a területrõl származó teljes vastagságú porcból végezzük, mert a chondrocyták rendkívüli változatosságot mutatnak méret, sejtsûrûség, anyagcsere intenzitás és biokémiai tulajdonságok tekintetében, amelyek nemcsak egyénenként, hanem ugyanazon ízületen belül, sõt a porcszövetben rétegenként is változnak (3, 12). Így nagy jelentõsége van annak például, hogy terhelõ vagy nem terhelõ felszínrõl származik a biopszia. A humán femoralis condylus porcának átlagos sejttartalma sejt/mm 3, míg például a hallócsontok kis ízületei chondrocytát tartalmaznak (30). köbmilliméterenként. Mivel az általunk alkalmazott életképességi teszt a sejtek terminális oxidáción és a Szentgyörgyi-Krebs ciklusban résztvevõ enzimek aktivitásán alapul a fenti tényezõk figyelembe vétele elengedhetetlen (25, 29). A különbözõ tároló médiumok közül 60 napos tárolás folyamán legjobbnak az X-Vivo 10 bizonyult a porcéletképességet tekintve, a többihez képest a különbség azonban nem szignifikáns. Különösen meglepõ az aminosavakat, vitaminokat, fehérjéket nem tartalmazó - Ringer oldatban tárolt porcok életképességének magas szintje. Ez arra utal, hogy a tárolás folyamán nincsen intenzív anyagcsere a tápoldat és a porc között. Ezt alátámasztja az a megfigyelésünk is, hogy a tápoldatok ph-ja 60 nap alatt semmit sem változott. Így a drága, humán rekombináns transferrint, albumint és IGF-t (insulin like growth factor) is tartalmazó X-Vivo 10 alkalmazása az életképesség megõrzésének szempontjából feleslegesnek tûnik. Mivel a többinél sokkal drágább is, (60 USD vs. 1-3 USD /l), meggondolandó az olcsóbb médiumok használata a szövetbanki gyakorlatban. A hosszabb ideig tárolt, élõ szövetek antibiotikus kezelése körültekintést igényel. Az aszeptikus eltávolítás és feldolgozás ellenére minden osteochondralis graftot potenciálisan inficiáltnak tekintünk és a lehetõ legszélesebb spektrumú antibiotikus kezelést alkalmazzuk. A ceftazidimet kombinálni kell penicillinnel, mivel az Enterococcus csoportra nem hatásos (15). Az életképesség megõrzésének kényszere miatt az ismert sterilizációs módszerek (gázsterilizálás, hõlégsterilizálás, irradiáció, kémiai sterilizálás stb.) nem jöhetnek szóba (9). Figyelembe kell venni a lehetséges gyógyszerallergiát, sterilitási követelményeket éppúgy, mint a graft sejtjeinek toxikus veszélyeztetettségét. Ez elsõsorban az antimikotikumok esetében merült fel a szövetbankok gyakorlatában. A cardiovascularis graftok (szívbillentyûk, erek) konzerválásakor igazolták az amphotericin-b toxikus hatását az endotel és fibroblaszt sejtekre (1, 14, 19), de például az antibiotikumok közül a streptomycin is csökkenti a sejtek életképességét (14). Ezért mindenképpen indokolt volt az általunk használt gyógyszereket megvizsgálni. Humán konzervált porcról ilyen vonatkozásban nem volt még irodalmi adat. Az általunk rutinszerûen, más graftoknál (elsõsorban félvastag bõrnél) alkalmazott és bevált gyógyszereknek nincs káros hatása sem külön-külön, 252 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

7 sem együttesen alkalmazva. E gyógyszerek gyorsan, néhány órán belül elbomlanak az adott tápoldatban, de sem behatásuk ideje alatt, sem bomlástermékeiknek a tárolás folyamán 60 napig nincsen az életképességi indexre gyakorolt negatív hatása. Ezért tapasztalatunk szerint jól és eredményesen alkalmazhatók az osteochondralis allograftok hosszú távú tárolásakor is az adott kombinációban. E három probléma tisztázásával sikerült e speciális területen felmerülõ gyakorlati kérdésekre választ adni. Ez hozzájárulhat ahhoz, hogy a hazai és nemzetközi gyakorlatban a jelenleg elérhetõ legjobb minõségû, életképes porccal rendelkezõ osteochondralis graftokat transzplantáljanak a sajnos egyre növekvõ számú ízületi sérülésben, csont tumorban, illetve kisebb részben porcdegenerációban szenvedõ betegbe. IRODALOM 1. Aguirregoicoa V., Kearney J. N., Davies G. A., Gowland G.: Effects of antifungals on the viability of heart valve cusp derived fibroblasts. Cardiovasc. Res : Amiel D., Harwood F. L., Hoover J. A., Meyers M.: A histological and biochemical assessment of the cartilage matrix obtained from in vitro storage of osteochondral allografts. Consz. Tis. Res : Aydelotte M. B., Schumacher B. L., Kuettner K. E.: Heterogeneity of articular chondrocytes. In: Articular cartilage and osteoarthritis. Eds. Kuettner K. et al. New York. Raven Press p. 4. Bakay A., Csönge L., Farkas I., Papp G., Fekete L.: Inkongruenciával gyógyult tibia plató törések megoldása osteochondralis allografttal. Magy. Traumatol. Ortop. Kézseb. Plaszt. Seb Suppl Bakay A., Csönge L., Fekete L.: The mushroom-shaped osteochondral patella allograft. Int. Orthop : Bakay A., Csönge L., Fekete L.: Osteochondral resurfacing of the knee joint with allograft. Clinical analysis of 33 cases. Int. Orthop : Benya P. D., Nimni M. E.: The stability of the collagen phenotype during stimulated collagen, glycosaminoglycan, and DNA synthesis by articular cartilage organ cultures. Arch. Biochem. Biophys : Brighton C. T., Shadle C. A., Jimenez S. A., Irwin J. T., Lane J. M., Lipton M.: Articular cartilage preservation and storage. I. Application of tissue culture techniques to the storage of viable articular cartilage. Arthr. Rheum : Csönge L: Szövetbank: lehetõség és kihívás. Lege Artis Medicinae, : Csönge L., Newman-Gage H., Rigley T., Bravo D., Conrad E. U., Strong D. M.: Preservation of chondrocyte viability during long term refrigerated storage of osteochondral allografts. In: Advances in tissue banking. Eds. Philips G. O., Strong M. D., von Versen R., Nather A. Singapore. World Scientific. Vol p. 11. Csönge L., Pellet S., Szenes Á., Joó I.: Application of antibiotics in the preservation of allo-, and xenograft skin. Burns, : Eggli P. S., Hunziker E., Schenk R. K.: Quantitation of structural features characterizing weight- and less weight-bearing regions in articular cartilage: a stereological analysis of medial femoral condyles in young adult rabbits. Anat. Rec : European Association of Tissue Banks: General standards for tissue banking. EATB, Vienna Fenf X. J., Hove C. E., Mohan R., Walter P. J., Herman A. G.: Effects of different antibiotics on the endothelium of the porcine aortic valve. J. Heart Valve Dis : Glaxo (U. K.): Fortum Information Booklet. 7. p. 16. Hagerty R. F., Calhoon T. B., Lee W. H., Cuttino J. T.: Human cartilage stored in plasma. Surg. Gynecol. Obstetr : Hangody L., Kárpáti Z.: Súlyos, körülírt térdízületi porckárosodások sebészi kezelésének új lehetõsége. Magy. Traumatol. Ortop : Hangody L., Kis G., Kárpáti Z.: Arthroscopic autogenous osteochondral mosaicplasty for the treatment of femoral condylar articular defects. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc : Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

8 19. Hu J. F., Gilmer L., Hopkins R., Wolfinbarger L.,: Effects of antibiotics on cellular viability in porcine heart valve tissue. Cardiovasc. Res : Lach J. W., Vasan N. S.: Glycosaminoglycans of cartilage. In: Cartilage. Vol. 1. Ed. Hall B. K. New York. Academic Press p. 21. Mankin H. J.,Doppelt S. H., Tomford W. W.: Clinical experience with allograft implantation:the first 10 years. Clin. Orthop : Mankin H. J., Gebhardt M. C., Tomford W. W.: The use of frozen cadaveric allografts in the management of patients with bone tumors of the extremities. Orthop. Clin. North Am : Mayne R., von der Mark K.: Collagens of cartilage. In: Cartilage. Vol. 1. Ed Hall B. K. New York. Academic Press p. 24. McKibbin B., Maroudas A.: Nutrition and metabolism in adult articular cartilage. Ed. Freeman M. A. R. 2. ed. London. Pitman Medical Publishing p. 25. Mosmann T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxic assays. J. Immunol. Methods : Pap K, Krompecher S: Arthroplasty of the knee. Experimental and clinical experiences. J. Bone Joint Surg A: Sammarco V. J., Gorab R., Miller R., Brooks P. J.: Human articular cartilage storage in cell culture medium. Orthopedics, : Schachar N. S., Cucheran D. J., McGann L. E., Novak K. A., Frank C. B.: Metabolic activity of bovine articular cartilage during refrigerated storage. J. Orthop. Res : Slater T. F., Sawyer B., Strauli U.: Studies on succinate-tetrazolium reductase systems III. points of coupling of four different tetrazolium salts. Biochimica et Biophysica Acta : Stockwell R.A.: Cell density, cell size and cartilage thickness in adult mammalian articular cartilage. J. Anat : Tomford W. W., Springfield D. S., Mankin H. J.: Fresh and frozen articular cartilage allografts. Orthopedics, : Wayne J. S., Amiel D., Kwan M. K., Woo S. L. Y., Fierer A., Meyers M.: Long term storage effects on canine osteochondral allografts. Acta Orthop. Scand : Dr. Csönge Lajos Nyugat-magyarországi Regionális Szövetbank, Petz Aladár Megyei Kórház 9023 Gyõr, Vasvári P. u. 2. Tel.: 96/ , 20/ Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet