Kísérletes szeptikus ízületi gyulladás okozta porcelváltozás vizsgálata kalorimetriával

Átírás

1 A Fejér Megyei Szent György Kórház, Ortopédiai Osztály, Székesfehérvár 1, a Pécsi Tudományegyetem, ÁOK, Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet 2 és a Pécsi Tudományegyetem, ÁOK, Patológiai Intézet 3 közleménye Kísérletes szeptikus ízületi gyulladás okozta porcelváltozás vizsgálata kalorimetriával DR. SILLINGER TAMÁS 1, DR. KOCSIS BÉLA 2, DR. KERESKAI LÁSZLÓ 3 Érkezett: november 19. ÖSSZEFOGLALÁS A szerzők kísérletes módszerrel kerestek bizonyítékot a szeptikus ízületi gyulladások porcot károsító hatására. Nyulak térdízületébe a humán ízületi fertőzéseket jellemző Staphylococcus aureus tenyészetet fecskendeztek. Feltételezték, hogy az ízületi gyulladás rövid időn belül létrejön, és ezt hamarosan követi a hialinporcban beállt szerkezeti változás, amelyet kaloriméteres vizsgálattal kívántak követni és bizonyítani. A mérésekkel bizonyosságot nyert, hogy bakteriális infekció során az ízületi porc károsodása már korán, az első napon elkezdődik, és ez a kalorimetriás vizsgálattal detektálható is. A szerzők a vizsgálatban nyert tapasztalatokkal a purulens ízületi kórképekkel foglalkozó sebészek figyelmét kívánják ráirányítani arra a tényre, hogy a kezelés mielőbbi megkezdése esetleg megelőzheti az arthrosishoz vezető porcelváltozásokat. Kulcsszavak: Arthritis, szeptikus; Térdízület Patológia; Ízületi porc Patológia; Kalorimetria, differential scanning; Termodinamika; Kutatás; Staphylococcus infekció; Állatkísérlet; T. Sillinger, B. Kocsis, L. Kereskai: Calorimetric examination of the cartilage changes, caused by experimental septic arthritis The authors searched for evidences experimentally, whether the septic arthritis could cause cartilage changes. Staphylococcus aureus bacterial culture was injected into the rabbit knee joint. The hypothesis was that the joint infection could develop quickly, followed by hyaline cartilage damage, proven by calorimetric follow-up examinations. They proved by calorimetric investigations, that the cartilage damage developed shortly, within the first day, followed by the bacterial infection. The aim of this experimental study was to call the surgeons attention to the early intervention in septic arthritis for the prevention of secondary osteoarthritic changes. Key words: Arthritis, infectious; Calorimetry, Differential Scanning; Cartilage, articular Pathology; Knee joint Pathology; Staphylococcal infections; Thermodynamics; Animals; BEVEZETÉS A mozgásszervi sebészettel foglalkozó szakemberek számára bármely ízület bakteriális fertőzésének megoldása még ma is komoly klinikai probléma és jelentős felkészülést igényel, a megfelelő kezelés hiányában fellépő porcdestrukció ugyanis az érintett ízület korai arthrosisához vezethet. Az ízületen belüli fertőzések során a fehérvérsejtek proteolytikus enzimmechanizmusának eredményeképpen a porcfelszínen létrejött fibrinborítás megakadályozza a tápanyagok diffúzióval történő bejutását, így hamarosan kialakul a destrukció (6). Felnőttekben leggyakrabban a térd érintett. A kezelés célja az ízületi fertőzés eliminálása, a dekompresszió és a funkció helyreállítása. Az artroszkópos debridement kedvező hatásáról megjelent közlemények a kezelésben irányt mutatnak, de nem foglalkoznak a porckárosodással, melynek mértéke a fertőzés kezdetétől eltelt idővel arányos (4, 5). A Staphylococcus aureus tenyészettel kísérletesen megfertőzött ízületek kezelésében 164 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

2 alkalmaztak már antibiotikumot önmagában és non-steroid gyulladáscsökkentőkkel kombinálva is. A vizsgálatok igazolták, hogy a porcdestrukciót bármely időszakban adott antibiotikum megállítani nem tudja, csak csökkenti a progresszió sebességét (15, 17). A kalorimetria a biológiai rendszerek szerkezeti és molekuláris tulajdonságainak vizsgálata fizikai kémiai, elsősorban termodinamikai módszerrel, melynek alapelve az, hogy a biológiai struktúrákról azok termikus gerjesztésével is szerezhetők adatok. Ennek napjainkban alkalmazott legfejlettebb formája az úgynevezett differential scanning calorimetry (DSC). A DSC-mérések során a fiziológiás körülmények között (koncentráció, ph, stb.) tartott mintát a körülbelül 1 ml térfogatú mérőcellába, míg a minta elkészítéséhez használt puffert az úgynevezett referencia cellába helyezzük. Ezután a két cellát egy hőelnyelő blokkba tesszük, amely fűthető és hűthető. Mérjük a cellák és a blokk, valamint a két cella közti hőmérséklet különbséget. A rendszert meghatározott program szerint felfűtjük az előre beállított kiindulási hőmérséklettől (például 0 C) a végállapot hőmérsékletéig (például 100 C) meghatározott fűtési sebességgel (például 0.3 C/perc). Ha a minta és a referencia termikus tulajdonságai azonosak, akkor azonos mennyiségű energia kell hőmérsékletük azonos módon történő változtatásához és így a kimenő jel zérus lesz. Ha a mintában egy endoterm (hőelnyelő) folyamat indul be valamilyen szerkezeti átalakulás következtében akkor hőmérséklete csak extra energia betáplálásával képes követni a referencia cella hőmérséklet változását úgy, hogy a két cella közti különbség továbbra is zérus maradjon. Természetesen exoterm folyamat esetén energiát kell elvonni a rendszerből. A betáplált, illetve elvont extra energia, amely állandó nyomáson zajló folyamatnál a fellépő hőkapacitás változást adja, jól mérhető és számítástechnikai matematikai manipulációt követően kalorimetriás görbe formájában ábrázolható. A humán térdízületi porc degenerációja osteoarthrosisban jól ismert, de Than és munkacsoportja a degeneratív elváltozások termodinamikai következményeit kalorimetriával is igazolni tudta, az intakt hialinporc kalorimetriás standardértékeinek megállapítása mellett. Ugyanezen munkacsoport kísérletesen előidézett arthrosis termodinamikai vizsgálatát is leírta állatmodellben (19 21). A közleményünkben ismertetett kutatás célja kísérletesen előidézett szeptikus arthritis okozta porckárosodás termodinamikai jellemzőinek vizsgálata volt. Feltételezésünk szerint a humán szeptikus arthritisek 80 százalékáért felelős Staphylococcus aureus törzs állatmodellen történő alkalmazása gyors ízületi infekciót és következményes porcdestrukciót eredményez, ami kalorimetriával reprodukálhatóan detektálható. ANYAG ÉS MÓDSZER A kísérlet során azonos körülmények között tartott 11 új-zélandi házinyulat (átlagos testsúlyuk 3 kg) oltottunk be eredetileg sebből izolált Staphylococcus aureus (OKI ) törzzsel (8), amelyet beoltás előtt biokémiai tesztek (9) segítségével azonosítottunk. Mueller Hinton táptalajon (Oxoid Ltd., UK) tenyésztett, majd végül telepképző egységet (CFU) tartalmazó, 1,5 ml baktérium szuszpenzió került befecskendezésre a nyulak bal térdízületébe. 24 órás időközökkel naponta egy állatot oltottunk be, a tizenkettediket megtartottunk kontroll céljából. A kísérlet teljes időtartama az első állat beoltásától kezdődően számítva 12 nap volt. Az állatokat normál körülmények közt tartottuk, folyamatos szilárd táplálék és folyadék felvétel lehetőségét biztosítottuk. Parenterális táplálék, folyadék, illetve gyógyszerbevitelben nem részesültek. A kísérleti alanyokat a megfertőzés után szoros megfigyelés alá vontuk, az ízületi duzzanatot, mint a synovitis egyértelmű jelét észleltük minden alkalommal. Az első kísérleti állat spontán elpusztulásakor (beoltást követő 12. napon) az összes többi Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

3 állatot túlaltattuk, és steril körülmények között a femur condylusokból porcmintákat izoláltunk. A minták sem csontot, sem ízületi belhártyát nem tartalmaztak, csak a hialinporcot távolítottuk el a makroszkóposan jól látható csont porc határon. A post mortem elváltozások kivédése érdekében a mintavételt közvetlenül a leölést követően elvégeztük. Ízületenként legalább négy mintát vettünk, amelyek nagysága körülbelül 5 5 mm, 20 és 30 mg között változó volt. A nyulak térde a bakteriális gyulladás makroszkópos jeleit mutatta, az ízületi folyadékot leoltva véres agar táptalajon a beadott Staphylococcus aureus (OKI ) törzs valamennyi esetben kitenyészett. A mintákat foszfát pufferben tároltuk, kontrollként az egészséges nyúl térdízületi hialinporca szerepelt. A kalorimetriás méréseket (amelyek révén a biológiailag fontos makromolekulák termikus denaturációjában szerzett tapasztalatokat hasznosítottuk jelen vizsgálat során) a korábban ismertetett módon SETARAM Micro DSC II kaloriméterrel végeztük (9 14). Minden egyes minta egy meghatározott felmelegítés lehűtés cikluson ment át a C fokos tartományban 0,3 K/min felfűtési sebességgel. A kísérletek során rozsdamentes Hastelloy cellákat használtunk, 850 μl átlagos mérőtérfogattal, 0,1 mg pontossággal elvégzett azonos tömeg bemérés mellett. Nem volt szükség a minta és a referencia cellák között hőkapacitás korrekcióra. A kalorimetriás entalpiaváltozás meghatározását (amely a vizsgált minta szerkezetének termikus úton történő megbontásához szükséges energiát adja) a SETARAM két rögzített pontú integráló szoftverével végeztük. További jellemző termikus paraméterek az átalakulási hőáram görbe maximumához tartozó hőmérséklet (T m, minél magasabb, annál stabilabb a vizsgált szerkezet), valamint a hőáram maximumának feléhez tartozó denaturációs hőmérséklet tartomány (minél keskenyebb, a mintában lévő különböző szerkezeti elemek annál szorosabb kapcsolatban vannak egymással, annál inkább egy jól csomagolt egységként viselkednek). Az alkalmazott termikus analitikai módszert már sikeresen alkalmazták más ortopédiai (1 3), illetve kísérletes sebészeti (18) problémák megoldásában is. EREDMÉNYEK A megfertőzés utáni obszervációs időszakban már korán, átlagosan 23 (16,5 28) óra múlva a nyulak viselkedésének változása mellett a térdízület duzzanatát észleltük minden egyed esetében. Az első állat a beoltástól számított 270 óra múltán spontán elpusztult, így ez jelentette a kísérleti ciklus idejének befejezését. A kísérletesen előidézett purulens arthritis progressziója jól látható az 1. ábrán, ahol a mért kalorimetriás eredményeket tüntettük fel a beoltási idő függvényében. Az I. táblázat tartalmazza a szeptikus esetek adatait. Egészséges esetben a DSC-vel három fő hőmérsékleti átmenetet tudtunk megkülönbözetni: 49,7, 55 és 63,4 C-nál, ahol 0,55 J/g volt a teljes entalpiaváltozás (a vizsgált minta termikus denaturálásához szükséges energia). A fő átmenetnél széles T ½ intervallum volt (a denaturációs hőmérsékleti tartomány szélessége a hőáram görbe maximumának felénél), amely azoknak a strukturális elemeknek a gyenge kooperatív tulajdonságát jelzi, amelyek ebben a tartományban denaturálódnak. Az ízületbe fecskendezést követő első napon már észleltük az ízület duzzanatát, amely szignifikáns entalpia csökkenéssel járt (0,375 J/g). Az első és a harmadik átmeneti hőmérséklet közel változatlan maradt (49,3 és 63,7 C), míg a második magasabb hőmérséklet irányába mozdult (57 C), amely az infekció okozta strukturális változások jele (I. táblázat). A harmadik napon a két alacsonyabb hőmérsékletű endoterm folyamat egy kiszélesedettbe egyesült 50 C körüli maximummal és csökkent kalorimetriás entalpiával (0,342 J/g). Az ötödik napon az infekció hatása négy elkülöníthető termikus denaturációs folyamatban kulminálódott (36, 50, 55 és 62,8 C-os T m -mel) és a harmadik naphoz képest megnőtt kalorimetriás entalpia (0,551 J/g) is jelezte a porc szer- 166 Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

4 kezetében beállt drámai változást. A hetedik napon két endoterm átmenetet kaptunk (50,2 és 63,15 C) az addig mért legalacsonyabb entalpiaváltozás mellett (0,24 J/g), amely a fellazuló porcstruktúrára utal, és nem tapasztaltunk további változást sem a T m -ekben sem az endoterm denaturáció energiájában a 9. és 11. napokon. Ez a négy nap lehet az utolsó stádiuma a kísérletesen előidézett szeptikus arthritis okozta porcelváltozás kifejlődésének. Ezekkel a mérésekkel összhangban állnak a kórszövettani vizsgálat eredményei. Az első napos fertőzés mintájában volt némi hyperaemia, a vörösvértestek jelenléte az akut gyulladás korai fázisát jelentette. Az ötödik és hatodik napos mintákban a korai porcpusztulást az egyenetlen, berepedezett porcfelszín, a porcmagok kezdődő destruációja, valamint a porc felszínén a jelentős granulocyta felhalmozódás mutatta (2. ábra). A hetedik és nyolcadik napos mintákban a porcfelszín teljes felszínének berepedése, a porcsejtek pusztulása, a sejtmagok eltűnése, valamint intraossealis elhalás és gennyedés volt látható. A spontán elhalt állat szövettani mintájában észleltük a legsúlyosabb porc- és csontdestrukciót lágyrész-tályog kíséretével. 1. ábra Kísérletesen előidézett szeptikus arthritis okozta porcdestrukció kalorimetriás görbéi az inokulációtól eltelt idő függvényében. 2. ábra Egyenetlen, berepedezett porcfelszín, felszíni granulocyta jelenlét. I. táblázat Kísérletesen előidézet szeptikus arthritis okozta porcdestrukció legjellemzőbb fázisainak hődenaturációs maximum hőmérsékletei és teljes kalorimetriás entalpiája Kísérleti fázis T m / ºC ΔH/ (J/g) Kontroll 49, ,4 0,55 1 nappal az inokuláció után nappal az inokuláció után nappal az inokuláció után nappal az inokuláció után nappal az inokuláció után nap exit Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

5 MEGBESZÉLÉS Hasonló kísérletre vonatkozó adat az irodalomban nem található, ezért eredményeinket csak önmagukban tudjuk tárgyalni. A kísérlet során bizonyosságot nyert, hogy bakteriális infekció során az ízületi porc károsodása már korán, az első, második napon elkezdődik, és ez a kalorimetriás vizsgálatokkal mérhető, valamint a szövettani mintákról leolvasható. A vizsgálat nem adott felvilágosítást, hogy ezek az elváltozások reverzibilisek, vagy irreverzibilisek voltak, ez irányban a kórszövettani vizsgálat adott eredményt. A két vizsgálat eredményeit egybevetve megállapíthatjuk, hogy mindkét módszerrel detektálható a korai változás, amely a kórszövettani mintákban már a 3. nap tájékán porcpusztulást igazol. Az 5. napon a DSC által jelzett drámai változás a kórszövettani metszeteken a porcréteg teljes elhalását jelentette. A hisztopatológiai vizsgálat többletet adott a kalorimetriás vizsgálathoz képest, mivel részben a folyamat intraossealis képét is elénk tárta, másrészt a porcsejtmagok eltűnésével az irreverzibilitás tényét is megmutatta. A kalorimetria nem alkalmas részletes strukturális következtetések levonására, mivel nem morfológiai elváltozás detektálására alkalmas módszer, csak azoknak a termodinamikai következményeit képes detektálni. Ezért nem tudunk arra vonatkoztatóan következtetni, hogy milyen molekuláris, biológiai elváltozások okozzák az általunk észlelt eltéréseket. Jóllehet a szövettani vizsgálataink verifikálták az eltéréseket a porcban, csontban és a környező lágyrészekben, a porcon belüli eltérések felmérése ezzel a módszerrel sem lehetséges. Feltételezésünk, és a korábbi mozgásszervi kalorimetriás kutatásokra alapozva leginkább a kollagén rostok denaturációja feltételezhető. Jelenleg újabb vizsgálatok történnek annak irányában, hogy az ízületen belüli szeptikus folyamatok milyen időtartam előtt állíthatók meg, akár gyógyszerrel, akár a humán sebészi eljárásokban jól ismert ízületi átöblítés módszerével (16). A kísérletben nyert tapasztalatokkal szeretném felhívni a figyelmet arra a klinikai gyakorlatból ismert, de tudományosan ritkán igazolt tényre, hogy a prearthrotikus állapotnak tekinthető szeptikus arthritis gyors kezelést igényel az irreverzibilis porckárosodások megelőzése céljából. IRODALOM 1. Domán I., Illés T., Lőrinczy D.: Differential scanning calorimetric examination of the human intervertebral disc: establishment of calorimetric standards of different stages of degeneration. Thermochim. Acta, : Domán I., Tóth Gy., Illés T., Lőrinczy D.: Differential scanning calorimetric examination of the human intervertebral disc. A preliminary study. Thermochim. Acta, : Gazsó I., Kránicz J., Bellyei Á., Lőrinczy D.: DSC analysis of the abnormalities of human leg skeletal muscles. A preliminary study. Thermochim. Acta, : Ivey M., Clark R.: Arthroscopic debridment of the knee for septic arthritis. Clin. Orthop : Jackson R.W., Parsons C. J.: Distension-irrigation treatment of major joint sepsis. Clin. Orthop : Jerosch J., Hofstetter I., Schröder M., Castro W. H. M.: Septic arthritis: Arthroscopic management with local antibiotic treatment. Acta Orthop. Belg : Kloos W. E., Bannerman T. L.: Staphylococcus and micrococcus. In: Murray P. R., Baron E. J., Pfaller M. A., Tenover F. C., Yolken R. H. (eds.): Manual of clinical microbiology. Washington DC. ASM p. 8. Lányi B., Konkoly-Thege M.: Hungarian National Collection of Medical Bacteria. National Institute of Hygiene Catalogue Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet

6 9. Lőrinczy D., Belágyi J.: Effects of nucleotide on skeletal muscle myosin unfolding in myofibrils by DSC. Biochem. Biophys. Res. Com : Lőrinczy D., Belágyi J.: Nucleotide binding induces global and local structural changes of myosin head in muscle fibres. Eur. J. Biochem : Lőrinczy D., Belágyi J.: Scanning calorimetric and EPR studies on thermal stability of actin. Thermochim. Acta, : Lőrinczy D., Belágyi J.: Comparative study of myosins in solutions and supramolecular complexes. Effect of nucleotides. Thermochim. Acta, : Lőrinczy D., Hartvig N., Belágyi J.: Analysis of nucleotide myosin complexes in skeletal muscle fibres by DSC and EPR. J. Biochem. Biophys. Method : Lőrinczy D., Könczöl F., Gaszner B., Belágyi J.: Structural stability of actin as studied by DSC and EPR. Thermochim. Acta, : Riegels-Nielsen P., Frimodt-Moller N., Sorensen M., Jensen J.S.: Antibiotic treatment insufficient for established septic arthritis. Staphylococcus aureus experiments in rabbits. Acta Orthop. Scand : Smith M. J.: Arthroscopic treatment of the septic knee. Arthroscopy : Smith R. L., Kajiyama G., Schurman D. J.: Staphylococcal septic arthritis: antibiotic and nonsteroidal anti inflammatory drug treatment in a rabbit model. J. Orthop. Res : Szántó Z., Benkő L., Gasz B., Jancsó G., Rőth E., Lőrinczy D.: Differential scanning calorimetric examination of the tracheal cartilage after primary reconstruction with continous sutures. A preliminary study. Thermochim. Acta, : Than P., Kereskai L., Lőrinczy D.: Az emberi hialinporc vizsgálata differential scanning kalorimetriával. Magyar Traumatológia Ortopédia Kézsebészet Plasztikai Sebészet, : Than P., Lőrinczy D.: Differential scanning calorimetric examination of the osteoarthritic hyaline cartilage in rabbits. Thermochim. Acta, : Than P., Vermes Cs., Schäffer B., Lőrinczy D.: Differential scanning calorimetric examination of the human hyaline cartilage. A preliminary study. Thermochim. Acta, : Dr. Sillinger Tamás Fejér Megyei Szent György Kórház Ortopédiai Osztály 8000 Székesfehérvár, Seregélyesi út 3. Magyar Traumatológia, Ortopédia, Kézsebészet, Plasztikai Sebészet