Írta: Dr. Garami Miklós. Témavezeto: Dr. Fekete György. Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Budapest, 2004.

Átírás

1 Genetikai és epidemiológiai vizsgálatok cisztás fibrózisban, 21-hidroxiláz defektus okozta congenitalis adrenalis hyperplasiában és a natriuretikus hormonok génexpressziójában Írta: Dr. Garami Miklós Témavezeto: Dr. Fekete György Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris orvostudományok: A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu Ph.D. program keretében Szigorlati bizottság: Elnök: Tagok: Dr. Horváth Attila, tanszékvezeto egyetemi tanár, MTA doktora Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinika Dr. Szalai Csaba, tudományos munkatárs, Ph.D. Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Dr. Marcsek Zoltán, osztályvezeto, Ph.D. Fodor József Országos Közegészségügyi Központ Opponensek: Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, MTA doktora Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Dr. Váradi András, tudományos tanácsadó, MTA doktora MTA Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézet

2 GENETIKAI ÉS EPIDEMIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK CISZTÁS FIBRÓZISBAN, 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS OKOZTA CONGENITALIS ADRENALIS HYPERPLASIÁBAN ÉS A NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZIÓJÁBAN Doktori (Ph.D.) dolgozat Dr. Garami Miklós Témavezeto: Dr. Fekete György Semmelweis Egyetem

3 TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 6. FOGALMI MEGHATÁROZÁSOK 8. EGY BETUS ÉS HÁROM BETUS AMINOSAV-SZIMBÓLUMOK 10. BEVEZETÉS 15. CÉLKITUZÉSEK 19. IRODALMI HÁTTÉR 18. I. CISZTÁS FIBRÓZIS 18. A cisztás fibrózis jelentosége epidemiológia 18. Klinikai tünetek 19. Diagnosztikai módszerek 20. CF diagnózisának feltételei 24. CFTR-gén 25. CFTR felépítése és szerepe egészséges szervezetben 26. CFTR gén mutációinak osztályozása 27. Genetikai és klinikai heterogenitás, a rendszerezés és prognózis megalkotásának szükségessége 28. II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS OKOZTA CONGENITALIS ADRENALIS HYPERPLASIA 30. Congenitalis adrenalis hyperplasia jelentosége - epidemiológia 30. CAH regiszter 32. Prenatalis vizsgálatok hidroxiláz locus 34. Genetikai és klinikai heterogenitás, a rendszerezés és prognózis megalkotásának szükségessége 35. 2

4 III. NATRIURETIKUS HORMONOK (hanp, hbnp) 38. Pitvari natriuretikus hormon felfedezése történelmi visszatekintés 38. A natriuretikus hormon család 38. Az ANP kémiai szerkezete 39. Az ANP fiziológiája 41. Az ANP regulációja 42. A plazma ANP koncentrációja 43. Natriuretikus peptidek génexpressziójának szövetspecifikus szabályozása 43. Natriuretikus peptidek jelentosége cardiomyopathiában 44. MÓDSZEREK 47. I. CISZTÁS FIBRÓZIS KLINIKAI ÉS GENETIKAI ADATAINAK VIZSGÁLATA 47. Cisztás Fibrózis Regiszter 47. Beteganyag 48. Statisztikai analízis 51. A genotípus-meghatározás módszertana 51. II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS VIZSGÁLATÁNAK MÓDSZERTANA 55. Beteganyag 55. DNS mintavétel 55. PCR amplifikáció 55. III. EMBERI NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZIÓJÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZOK VIZSGÁLATÁNAK MÓDSZERTANA 56. Plazmid konstrukciók 56. Sejt preparáció, transzfekció 56. Gél shift, DNA fehérje footprint, Northern blot analízis, szekvenálás és radioimmunoassay (RIA) 57. Mechanikus stressz 57. Beteganyag 57. 3

5 EREDMÉNYEK 59. I. A cisztás fibrózis (CF) megbetegedésnek a klinikai gyakorlatban is hasznosítható, feltételezett klinikai és genetikai összefüggéseivel kapcsolatos megállapítások 59. II. A congenitalis adrenalis hyperplasiát (CAH) okozó 21-(szteroid)-hidroxiláz enzim defektusnak a klinikai gyakorlatban is hasznosítható, klinikai és genetikai összefüggéseivel (genotípus vs. fenotípus elemzés) kapcsolatos megállapítások 61. III. Emberi natriuretikus hormonok génexpresszióját befolyásoló mechanizmusokkal kapcsolatos megállapítások 63. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 65. I. CISZTÁS FIBRÓZIS MEGBETEGEDÉS GENOTÍPUS FENOTÍPUS ELEMZÉSE 65. Magyarországi CF-es populáció genotípusának jellemzése (mutációs spektrum) 65. Magyarországi CF-es populáció klinikai adatainak elemzése a genotípus tükrében 68. II. 21-OHD DEFEKTUS OKOZTA CAH GENOTÍPUS FENOTÍPUS ELEMZÉSE 71. Magyarországi 21-OHD-os populáció genotípusának jellemzése (mutációs spektrum) 75. III. NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZÓJÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZOKKEL KAPCSOLATOS EREDMÉNYEK ELEMZÉSE 73. ANP génexpresszióját befolyásoló hemodinamikai változások 73. BNP génexpresszióját befolyásoló hemodinamikai változások 73. ANP gén transzkripciós regulációja 77. BNP gén transzkripciós regulációja 77. AZ ÉRTEKEZÉSBEN SZEREPLO VIZSGÁLATOKBAN EGYÜTTMUKÖDO NEMZETKÖZI INTÉZMÉNYEK 80. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 81. 4

6 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK TUDOMÁNYOS CIKKEK (KÖZLEMÉNYEK: I. IX.) IDÉZHETO ELOADÁS-KIVONATOK (ABSZTRAKTOK) (KÖZLEMÉNY: X.) ISMERETTERJESZTO CIKK TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZET ELSO SZERZOS TUDOMÁNYOS ELOADÁSOK 87. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ SZOROSAN KAPCSOLÓDÓ EGYÉB SZAKMASPECIFIKUS ALKOTÁSOK (közlemény: XI.) 93. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ EGYÉB SAJÁT KÖZLEMÉNYEK TUDOMÁNYOS CIKKEK ISMERETTERJESZTO CIKKEK TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZETEK IDÉZHETO ELOADÁS-KIVONATOK (ABSZTRAKTOK) 96. IRODALOMJEGYZÉK 101. ÖSSZEFOGLALÓ 131. ABSTRACT

7 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 21-OHD: 21-hidroxiláz enzimdefektus ABC-transzporterek: ATP Binding Cassette AGS: adrenogenitális szindróma ANP: pitvari natriuretikus hormon (atrial natriuretic peptide) AR: autoszomalis recesszív öröklodés menet ASA: allél-specifikus amplifikáció BNP: agyi natriuretikus hormon (Brain Natriuretic Peptide) CAH: congenitalis adrenalis hyperplasia CAT: kloramfenikol-acetiltranszferáz (Chloramphenicol Acetyltransferase) CBAVD: veleszületett, kétoldali vas deferens hiánya (Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens) CF: cisztás fibrózis CFTR-gén: cisztás fibrózis transzmembrán regulátor gén (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator gene) CVS: chorionboholy-mintavétel (Chorionic Villus Sampling) CYP21: 21-hidroxiláz enzim génje CYP21P: 21-hidroxiláz enzim pszeudogénje DIOS: disztális bélszakasz obstrukciója okozta szindróma (Distal Intestinal Obstruction Syndrome) FEV 1 : eroltetett kilégzés térfogata (Forced Exspiratory Volume) FRC: funkcionális reziduális kapacitás (Functional Residual Capacity) HGP: Emberi Genom Kutatási Program (Human Genom Project) JNK: c-jun N-terminal kináz (c-jun N-terminal Kinase) LO: késoi forma (Late Onset) MAPK: mitogén-aktivált fehérje kináz (Mitogen-Activated Protein Kinase) NC: nem klasszikus (Non-Classic) ORCC: Outward Rectifying Chloride Channel 6

8 PCR: RV: SNP: SV: SW: TLC: VC: polimeráz-láncreakció (Polimerase Chain Reaction) reziduális térfogat (Residual Volume) egypontos nukleotid polimorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism) szimpla virilizáció (Simple Virilizing) sóveszto (Salt-Wasting) totálkapacitás (Total Lung Capacity) vitálkapacitás (Vital Capacity) 7

9 FOGALMI MEGHATÁROZÁSOK Aktivátor: Cisz-hatás: többnyire fehérjetermészetu faktor, amely a promóteren vagy annak közelében kapcsolódva serkenti az átírást. ugyanazon a DNS molekulán (kromoszómán) található szekvenciák (pl. promóterek) által kiváltott transzkripciót befolyásoló hatás. Downstream (szekvencia): gén leolvasási irányában a kezdopont (origo) alatti ( folyásirányban lévo, völgymeneti ). Enhancer (serkento) szekvencia: eukarióta DNS-en található szekvenciák, amelyek felpörgethetik (gyorsíthatják, upregulate) a szomszédos, illetoleg a mindkét irányban távolabb fekvo gének átírását. Exon: eukarióta DNS-szakasz, melybol végül funkcionális mrns keletkezik. Folyásirányban lévo: lásd downstreem Hegymeneti (upstream): gén leolvasásának kezdopontja (origo, nulla pont) felett, folyásiránnyal szemben elhelyezkedo, negatív számokkal jelzett nukleotid szekvencia. Hegymeneti elemek: promóter-mag felett található szekvenciák, melyek specifikus fehérjék megkötése révén modulálják a transzkripciót. Intron: eukarióta génnek azok a szakaszai, amelyek a keletkezett RNS-bol az átírás után kivágódnak, nem jutnak ki a sejtmagból. Konszenzus-szekvencia: számos gén összehasonlító vizsgálata alapján kialakított egyezményes (konszenzusos) nukleotid-szekvencia, melyben az adott helyen leggyakrabban talált nukeotid jele szerepel. 8

10 Negatív szabályozás: transzkripció gátlása represszorok révén. Plazmid: kettos szálu, többnyire körkörös és viszonylag kicsi DNS molekula, amely a baktérium-kromoszómát (genofor) kiegészíto géneket hordoz. A plazmidokat a molekuláris genetikában általánosan használják gének klónozására. Pozitív szabályozás: amikor egy gén átírási üteme megno egy aktivátor (többnyire fehérje molekula) hatására. Promóter: transzkripció kezdete szempontjából kulcsfontosságú DNS szakasz, amely hegymenetben többnyire közvetlenül a gén origo pontja felett található. Represszor: gén átírását megakadályozó, a promóter (operátor) szakaszához kapcsolódó fehérjefaktor. Transz-hatás: olyan faktorok hatása, amelyek nem az adott génrol származnak. A transzkripciós faktorok pl. transz-hatású faktorok. Transzkripciós faktorok: általában fehérje-jellegu molekulák, amelyekre a transzkripció megkezdéséhez van szükség és amelyek nem integráns részei az RNSpol molekulának, de befolyásolják annak muködését. 9

11 EGY BETUS ÉS HÁROM BETUS AMINOSAV-SZIMBÓLUMOK A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W X Ala - alanin Cys - cisztein Asp - aszparginsav Glu - glutaminsav Phe - fenilalanin Gly - glicin His - hisztidin Ile - izoleucin Lys - lizin Leu - leucin Met - metionin Asn - aszparagin Pro - prolin Gln - glutamin Arg - arginin Ser - szerin Thr - treonin Val - valin Trp - triptofán xxx - ismeretlen, egyéb (stop kodon is) 10

12 BEVEZETÉS A Human Genom Project (HGP, Emberi Genom Kutatási Program) a természettudomány eddigi legnagyobb vállalkozása ben kezdodött, és 2001 februárjában jelentették be elso szakaszának befejezését (Nature, 409(6822): , 2001; Science, 291(5507): , 2001). Sokak szerint ez az emberi megismerés egyik legnagyobb vívmánya, aminek bejelentése egyedülálló szakaszhatár a tudomány történetében. A program végso célja, hogy az emberi kromoszómákon levo kb ezer gén (a korábban jósolt kb helyett [157, 245]) pontos helyzetét meghatározzák - és esetleg a teljes emberi DNS génszekvenciát is meghatározzák, amely kb. 3x10 9 bázispárból (bp) áll. Korábban az emberi géneknek kb. két százalékát lokalizálták és viszonylag kisszámú - kb genetikai betegséget tudtak visszavezetni hibás génekre. A Human Genom Project keretében létrejött egy olyan térkép, amely a fobb (gén-) határjelek helyzetét ábrázolja (draft sequence). További cél feltárni az egyes génekhez tartozó bázisszekvenciákat. Esetleg a kromoszómák teljes DNS-szekvenciája is meghatározható lesz, beleértve azt a 90 százalékot is, amely nem vesz részt gének alkotásában. Mivel a fenti kutatás eredménye szabadon hozzá férheto és közvetlenül (on-line) elérheto központi adatbázisokból ( ezért ma már számos, ismert genetikai eltérés talaján kialakult betegség esetében lehetoség van a betegségért felelos génszakasz szekvenálására, ismert, ill. új mutációk azonosítása céljából. Jelenleg még nem állnak rendelkezésünkre olyan bioinformatikai módszerek, amelyek lehetové tennék a gének közötti kapcsolatok, a génexpresszió programjának predikcióját pusztán a genomszekvencia számítógépes elemzése alapján. Ma már nagy teljesítoképességu módszerek (pl. DNS-chip technikák) segítségével követni lehet, hogy egy élettani állapotváltozás hogyan hat az egyes gének kifejezodésére, az egyes gének kifejezodésének változása milyen program szerint történik. Ezekkel a módszerekkel fontos információt nyerhetünk arra vonatkozóan, hogy 11

13 melyek azok a gének, amelyek szerephez jutnak egy adott élettani folyamatban. A funkcionális genomika és a bioinformatika egyik legizgalmasabb feladata a gének expresszióját szabályozó régiók szisztematikus azonosítása, muködésük törvényszeruségeinek tisztázása, hogy a jövoben a genomszekvencia számítógépes elemzésével lehessen megjósolni a gének kapcsolathálózatait. A klinikai genetikai tanácsadás szempontjából az egyik legnehezebb problémát az autoszomalis recesszív (AR) öröklodésmenetu betegségek jelentik (a szülok általában egészségesek; a testvérek között a betegek aránya 25%). A klasszikus mendeli öröklodés szabályai szerint autoszomális recesszív génmutációk csak homozigóta egyénekben okoznak tüneteket. Tudjuk ma már, hogy néhány gén recesszív hibája fenotípusbeli eltérést okoz akkor is, ha csak az egyik lókuszon van jelen. A recesszív öröklodésu monogénes betegségeket okozó mutációk heterozigóta formában sem ártalmatlanok, és/vagy fokozott betegséghajlamot jelentenek, vagy olyan jelleget, ami meghaladja a populációs variancia normális határait. Ez egyúttal jelentosen kibovíti azok körét, akik egy gén hibája következtében betegségi tünetet mutatnak. Értekezésemben két monogénes, autoszomalis recesszív (AR) öröklodésmenetu betegség, a rendkívül gyakori (1:2500 újszülött) cisztás fibrózis (CF) és a súlyos fejlodési rendellenességgel járó congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) molekuláris genetikai vizsgálatát mutatom be a korábban is alkalmazott klasszikus (restrikciós fragment analízis, PCR amplifikáció stb.) módszereken túl felhasználva a Human Genom Program eredményein alapuló szekvenálási módszereket is (direkt DNS szekvenálás; bázis eltérésen alapuló összehasonlító DNS elemzés, SNP: single nucleotide polymorphism). Az értekezésben bemutatásra kerülo módszerek mindkét betegségcsoportban lehetové teszik a prenatalis szurés elvégzését. Lehetoséget teremtve a családoknak, hogy az idoben elkezdett terápiával egészséges gyermeket hozzanak a világra. 12

14 Értekezésem további tárgya az ugyancsak kóros sejtmuködéssel járó állapotokban a natriuretikus hormonok (ANP, BNP) szekréció, ill. génexpresszió eltéréseinek elemzése, amelyet endogén és iatrogén cardiomyopathia vonatkozásában vizsgáltunk. Az emberi natriuretikus hormonok termelodését meghatározó patofiziológiai tényezok, ill. a hormonokat kódoló génszakaszok szabályozásának megismerése közvetlen, a betegellátás területén is alkalmazható eredményt hozhat. Ennek jelentoségét az alábbi két szempont figyelembevételével szeretném bemutatni: 1. A cisztás fibrózisos megbetegedések klinikailag súlyosabb formáiban a tüdoben fennálló krónikus gyulladás talaján a kiserek számának csökkenése és periarteriolaris fibrózis alakul ki. Ennek következtében megnövekszik az artéria pulmonálisban uralkodó nyomás, no a jobb szívfél terhelése (megnövekedett afterload). Kompenzatórikusan a jobb szívfél hipertrófiája alakul ki, ami secunder dilatatív cardiomyopathiát is okozhat. A kezdeti élet minoségét befolyásoló tényezon túl, a folyamat elorehaladtával életet veszélyezteto faktorrá is válhat. 2. Az anthracyclinek a gyermekkorban is a leghatásosabb citosztatikus szerek közé tartoznak, amelyeket kiterjedten használnak számos szolid tumor, akut lymphoid és myeloid leukémia kezelésére. A gyógyszer adásának legfontosabb korlátozó tényezoje cardiotoxikus mellékhatása. A cardiotoxicitás korai felismerése, kezelése és megelozése vitális kérdés, hiszen a cardiomyopathia mortalitása magasabb, mint 6% és a növekedésben lévo szervezetben évekkel a terápia befejezése után is manifesztálódhat. Az ANP és BNP számos vazoaktív anyag szekrécióját, effektusát gátolni képes, amelyek az anthracyclin cardiomyopathiában szerepet játszanak. A szérum ANP és BNP változása korai és érzékeny jellemzoje a CF megbetegedésben kialakuló dilatatív-, és az anthracyclin terápia kapcsán kialakuló akut és krónikus toxikus cardiomyopathianak. 13

15 A legmodernebb technika is téves eredményre vezethet, ha pl. nem pontosan összeállított betegcsoportokon kerül alkalmazásra. A Human Genom Project által elérhetové vált információ tömeg, az új genetikai paradigma csak akkor tud majd átüto sikert hozni, ha tudományos igényességgel folytatott tradicionális klinikai tevékenységgel társul. A genomikával felértékelodött a fenotípus hagyományos eszközökkel való vizsgálatának szerepe. A fenotípusra vonatkozó eddigi ismereteinket felül kell vizsgálni, ki kell egészíteni, s a genomot jellemzo pontos és precíz adatok mellé hasonlóan pontos és precíz fenotípusbeli adatokat kell helyeznünk. A genotípus-fenotípus összefüggések segíthetnek a genetikai heterogenitásból adódó számos tisztázatlan, gyakorlati szempontból jelentos kérdés megválaszolásában. Mind az allélikus heterogenitásból (egy génlókusz mutációi eltéro klinikai képet okoznak), mind a lókusz heterogenitásból (egyféle vagy hasonló klinikai kép hátterében különbözo lókuszok mutációi állhatnak) adódó nehézségek csak olyan adatok segítségével oldhatók meg, amelyek tudományos igényességgel folytatott genotípus - és fenotípusbeli elemzésekbol születnek. A cisztás fibrózisos és a congenitalis adrenalis hyperplasiás betegcsoportoknál Magyarországon elsoként országos CF és CAH regiszterek adatbázisát felhasználva genotípus - fenotípus elemzést is végeztünk, többek között azzal a céllal, hogy munkánk felhasználható legyen a kezeloorvosok által is. A cisztás fibrózis betegek eredményes kezelésére egy jól muködo, egységes kezelési szempontokat figyelembe vevo, országos, CF gondozóközpontokból álló hálózat alakult. Ugyanakkor a betegek tüneteit, laboratóriumi vizsgálatainak eredmé nyeit egységes szempontrendszer szerint feldolgozó, és a megbetegedésekért felelos CFTR mutációkat is nyilvántartó országos regiszter nem létezett. Ezért, szorosan együttmuködve a CF gondozóközpontokkal, egy Országos Cisztás Fibrózis Regiszter létrehozását valósítottuk meg. 14

16 CÉLKITUZÉSEK Az értekezésben négy gén szekvencia, a cisztás fibrózis (CF) kialakulásáért felelos CFTR gén, a congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) kialakulásáért felelos 21- (szteroid)-hidroxiláz defektust (21-OHD) okozó CYP21 gén mutációinak vizsgálatát, valamint a cardiomyopathiákban szerepet játszó emberi natriuretikus hormonok (hanp, hbnp) génjeinek szekvenciáit elemezzük. A CF és CAH betegségek esetében vizsgáltuk a klinikai tünetek és a betegség kialakulásáért felelos genetikai elváltozások közötti lehetséges összefüggéseket is. I. A cisztás fibrózis (CF) megbetegedésnek a klinikai gyakorlatban is hasznosítható, feltételezett klinikai és genetikai összefüggéseinek megismeréséhez célul tuztük ki: 1. A cisztás fibrózisos betegek klinikai tüneteinek és laboratóriumi eltéréseinek egységes szempontrendszer szerinti leírását és új osztályozás bevezetését Magyarországon. 2. Az egységes szempontrendszeren alapuló, Országos Cisztás Fibrózis Regiszter létrehozását. 3. A magyarországi CF Regiszter epidemiológiai adatainak összehasonlítását a környezo és más európai országokéval. 4. A cisztás fibrózis kialakulásáért felelos CFTR gén magyarországi mutációs spektrumának meghatározását. 5. Cisztás fibrózisos betegek genotípus fenotípus összefüggéseinek elemzését. 15

17 II. A congenitalis adrenalis hyperplasiát (CAH) okozó 21-(szteroid)-hidroxiláz enzim defektusnak (21-OHD) a klinikai gyakorlatban is hasznosítható, feltételezett klinikai és genetikai összefüggéseinek megismeréséhez célul tuztük ki: 1. A 21-hidroxiláz enzim defektus kialakulásáért felelos CYP21 gén magyarországi mutációs spektrumának meghatározását. 2. A 21-OHD betegek genotípus fenotípus összefüggéseinek elemzését. III. Cardiomyopathiákban is jelentos, emberi natriuretikus hormonok (hanp, hbnp) génexpresszióját befolyásoló mechanizmusok megértése érdekében célul tuztük ki: In vitro modellkísérletekben (patkány szívizom sejtkultúrákban vizsgálva): 1. A hanp gén szövetspecifikus génexpresszióját meghatározó génszakasz azonosítását. 2. A hbnp gén szövetspecifikus génexpresszióját meghatározó génszakasz azonosítását. 3. Mechanikus stressznek, a hbnp génexpresszióra gyakorolt hatásának vizsgálatát. 4. Anthraciklinnek (doxorubicinnek) a hanp - és hbnp génexpressziókra gyakorolt szelektív hatását. 16

18 In vivo humán kísérletek során vizsgálva: 5. Anthraciklinek által kiváltott cardiomyopathia elorejelzését (prognózisát) a szérum hanp koncentrációjának mérésével. 17

19 IRODALMI HÁTTÉR I. CISZTÁS FIBRÓZIS A cisztás fibrózis jelentosége epidemiológia A cisztás fibrózis (CF; OMIM# ) a leggyakoribb autoszomalis recesszív öröklodésu, halálos kimenetelu genetikai betegség a fehérboru népesség körében [76, 308]. Európában a génhordozók gyakorisága 1:25, így megközelítoleg minden 625. házasságkötés két heterozigóta egyén között történik. Ezekbol a házasságokból 25%-os valószínuséggel születnek homozigóta, beteg utódok, így a betegség újszülöttkori elofordulása átlagosan 1:2500-ra teheto [109]. Ezt a feltunoen magas gyakoriságot egy szelekciós elony jelenlétével magyarázzák, amely szerint a heterozigóta hordozók kevésbé érzékenyek a koleratoxin szekréciófokozó hatására, melyre csökkent Cl -transzporttal, illetve csak mérsékelt szekretoros típusú hasmenéssel válaszolnak [46, 83, 218]. A CF a leggyakoribb etiológiai tényezo a gyermekkori súlyos, idült tüdobetegségben, és jelentos forrása az idült tüdobeteg fiatal felnottek morbiditásának és mortalitásának. A CF felelos számos gyermekkori és kora felnottkori exokrin hasnyálmirigy-elégtelenségért, továbbá számos orrpolyposisért, sinusitisért, rectalis prolapsusért, nonketotikus inzulin-dependens hyperglycaemiáért és biliaris cirrhosisért ezekben a korosztályokban. Mindezen tényezok indokolják, hogy e genetikai defektus vizsgálataira nagy érdeklodés irányul. Bár az elso megfigyelések 1650-ig nyúlnak vissza, a CF kutatása a 20. században kezdodött [75, 276]. A betegség elso pontos klinikai leírása, illetve maga az elnevezés 1938-ból, Dorothy Andersentol származik [5], az öröklodés tisztázása pedig Carter nevéhez fuzodik [16, 32, 33]. Jelentos állomás, amikor 1953-ban di Sant Agnese eloször mutatta ki az emelkedett Na - és Cl -tartalmat a verejtékben [61]. A genetikai ismereteink 1985 óta amikoris a CF-gént a 7. kromoszómára (7q31) lokalizálták [298] folyamatosan bovülnek. A CFTR-gén (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance 18

20 Regulator Gene; OMIM# ) felfedezésére 1989-ben került sor [215, 220], a CFTRfehérjét pedig Kartner és mtsai azonosították [18, 126]. A genetikai heterogenitásból fakadóan a kutatás továbbra sem állt le, és mára már az ismert mutációk száma meghaladtja az 1200-at ( Klinikai tünetek A cisztás fibrózis a diabetes mellitus után a második leggyakoribb anyagcsere-betegség. Az alapdefektus az összes külso elválasztású mirigyben megfigyelheto. Elégtelen a klorid, illetve másodlagosan a nátrium és a víz hámfelületre történo kiválasztása. Míg normális körülmények között a szekretoros csatornákban képzodo elsodleges folyadékból klorid, majd nátrium szívódik vissza, itt ez nem következik be, így a verejtékkel nagy mennyiségu só távozik. A többi exokrin mirigyben is suru, tapadós váladék képzodik, ami obstrukciót okoz. Légzorendszeri elváltozások A betegek mintegy 90%-a mutat légzorendszeri tüneteket. CF-ben a krónikus infekció elsosorban a légzorendszerben jelentkezik. A bejutó baktériumok a suru, mukózus váladék miatt könnyen megtelepednek a bronchiális urben, amelyet késobb bronchiolitis, illetve a nagyhörgok gyulladása követ [153]. A hörgorendszer destrukciója idovel egyre fokozódik. Légúti obstrukció alakul ki, bronchiektázia, szubpleurális bullák jelennek meg, ha rupturálódnak, következményes pneumothorax észlelheto, majd a folyamat végstádiumban fibrózisba megy át. A fokozódó pulmonális ellenállás egyre nagyobb terhet ró a jobb kamrára és cor pulmonale alakul ki. Gasztrointesztinális vonatkozások Az emésztorendszer az esetek kb. 80%-ában érintett. Emésztési zavar a hasnyálmirigy-enzimek 75%-os kiesése esetén lép fel. Az emésztés elégtelensége miatt a felszívódási viszonyok romlanak, a testtömeg gyarapodása elmarad, a boséges táplálkozás ellenére malnutriciós tünetek lépnek fel. Mindez a zsírban oldódó vitaminok hiányára jellemzo tünetegyüttes kialakulásához vezet. 19

21 A jelentosebb megjelenési formák és szövodmények közé tartozik az esetek 10-15%- ában eloforduló meconium ileus; a krónikus köhögés, a hasi disztenzió és a tranzitido megnyúlása miatt fellépo gasztrooesophagealis reflux; valamint a vékonybél bakteriális kontaminációja. A májtünetek az elhúzódó icterustól egészen a fibrózisig terjedhetnek [96, 271]. Kialakulhat cirrhosis is portális hipertenzióval, következményes ascitessel, lépduzzanattal, nyelocso-varixokkal és akár fatális kimenetelu vérzéssel is. Nem ritka a rectum-prolapsus, amit a nagytömegu, emésztetlen széklet, a perisztaltika megváltozása, a rectum körüli zsírszövet csökkenése, valamint a köhögés miatti fokozott hasuri nyomás hoz létre. Húgy- és ivarszervek érintettsége 95%-ban jellemzo az aspermia. Lányoknál adoleszcens korban gyakori a szekunder amenorrhoea. Diagnosztikai módszerek Verejtékteszt A verejtékteszt indikációi: újszülött és csecsemokorban meconium ileus, meconium peritonitis, icterus, hypochloraemiás alkalosis és hotúltengés, gyermekkorban gyarapodási zavar, rectum prolapsus, orrpolyposis, sinusok fedettsége/parasinusitis, pancreatitis, epekövek és ismeretlen eredetu cirrhosis, illetve bármely életkorban diagnosztizált azoospermia (a vas deferens kétoldali veleszületett hiánya miatt), visszatéro vagy állandó pneumonia, Staphylococcus pneumonia, mucoid Pseudomonas a légutakban, bronchiectasiák és a pozitív családi anamnézis. A verejtéktermelés serkentésére pilocarpin-iontophoresist alkalmaznak. Három egymás utáni, különbözo idopontban mért pozitív, azaz 60 maeq/l feletti NaCl-értéket tekinti a szakirodalom a CF-re diagnosztikusnak, de maeq/l közötti értéknél sem lehet egyértelmuen elvetni a diagnózist. Az életkor elorehaladtával no a verejték NaCltartalma, így egészséges felnotteknél is elofordulhatnak 60 maeq/l körüli értékek. A hazai gyakorlatban ezért ma már az maeq/l közötti értéket tekintjük átmenetinek, és a 70 maeq/l feletti értéket pozitívnak [17, 89, 152, 262, 300]. 20

22 Az emelkedett verejték Cl - -szint miatt differenciál-diagnosztikai problémát, álpozitivitást okozhatnak az alábbi betegségek: kezeletlen mellékvesekéreg-elégtelenség, ectodermalis dysplasia, öröklött nephrogen diabetes insipidus, glukóz-6-foszfatáz-hiány, hypothyreosis, hypoparathyreoidismus, familiaris cholestasis, pancreatitis, a mucopolysaccharidosisok, fucosidosisok és a malnutritio. Álnegatív eredményt adhat a teszt hypoproteinaemiás, oedemás gyermekben. Légzésfunkció A légzésfunkciómérés általában 5-6 éves kor felett ad megbízható eredményt. A középkilégzési csúcsáramlás csökkenése korai jel, és a kislégutak obstrukciójára utal. Korai tünet még a reziduális térfogat (RV) és a funkcionális reziduális kapacitás (FRC) növekedése. A késobb jelentkezo légzésfunkciós változások már a restriktív elváltozásra utalnak: ilyen a totálkapacitás- (TLC) és a vitálkapacitás-csökkenés (VC), amely értékek a tüdoparenchyma érintettségével és a fibrózis mértékével arányosak [40, 43]. A végállapotú tüdot már a FEV 1 értékének (FEV: forced expiratory volume; FEV 1 : a vizsgált személy 1 mp alatt a vitálkapacitásának maximális erokifejtéssel kilélegezett hányada) 30% alá csökkenése jellemzi, hypoxia és/vagy hypercapnia (P AO2 < 55 Hgmm, P ACO2 > 50 Hgmm, ) kíséretében [153, 323]. Képalkotó eljárások (röntgen, ultrahang, CT) A képalkotó eljárások közül a tüdofolyamatok diagnosztizálásához a mellkasröntgen és a mellkas-ct használatos [60, 128, 217, 230, 323]. A mellkasröntgen csak elorehaladottabb folyamatok detektálására képes, így a legkorábbi jel a tüdofelfújtság, a jelentos hörgofal-megvastagodás, dugaszképzodés, és a bronchiectasiára utaló gyurus árnyékok, melyek eloször a felso lebenyekben (a legkorábbi és legjelentosebb elváltozások többnyire a jobb felso lebenyben) jelennek meg. Késobb már gócos transzparencia-csökkenést, foltos atelectasiákat és egybefolyó infiltrátumokat is láthatunk. Megnagyobbodott hilusi nyirokcsomók is elofordulhatnak. Elorehaladott tüdofolyamat esetén még jelentosebb eltérések ábrázolódnak a röntgenképen: látványos felfújtság, mélyen álló rekeszek, a szívárnyék elkeskenyedik (végállapotú tüdo esetén 21

23 azonban a cor pulmonale következtében újra kiszélesedik), a sternum ívben elorehajlik. Gyakran láthatók még ciszták, kiterjedt hörgtágulat, tágult pulmonalis artériás rajzolat és szegmentális vagy lobaris atelectasia. A CF mellkasröntgen-jeleinek értékelésére nemzetközi pontrendszerek vannak használatban [217, 230]. A CT jóval kifinomultabb eljárás, így a hazai CF-diagnosztikában is kezdi átvenni az AP-mellkasröntgen szerepét. Segítségével már a korai folyamat így a kezdeti hörgofalmegvastagodás és a bronchiectasia is detektálható. A hasi ultrahang CF-es betegek esetében elsosorban a hasnyálmirigy és a máj érintettségének meghatározására szolgál, az arcüreg CT-vel pedig a cisztás fibrózist gyakran kíséro parasinusitis és orrpolyp diagnosztikájához nyújt segítséget. Pancreasfunkció A pancreasfunkció mérésére több vizsgálat is rendelkezésre áll, így például a háromnapos székletgyujtést követo széklet-zsírtartalom vizsgálata, duodenumszondázás és pancreozymin-secretin stimulálás révén az enzimszekréció és aktivitás meghatározása, a székletminta tripsin- és chymotripsin-tartalmának vizsgálata [22, 28, 147, 238, 241, 299]. Használható még az immunreaktív tripsinogen szerumszintjének mérése (csak 7 éves kor felett), a glikolizált hemoglobinszint ellenorzése (10 éves kor felett végezheto, és elsosorban utánkövetésre alkalmas érzékeny módszer, de még nem általánosan elterjedt), és a szérum karotin-koncentrációjának mérése. A rendelkezésre álló vizsgálati módszerek azonban a mindennapi gyakorlatban kevésbé használatosak. Sokkal inkább az a módszer terjedt el, hogy emésztési panaszok és haspuffadás esetén rögtön enzim-szubsztitúció bevezetésére kerül sor, amelynek a dózisbeállítása a gyermek panaszainak függvényében elsosorban a szülo feladata, természetesen a konzultációk alapján [25, 59]. 22

24 Mikrobiológia A mikrobiológiai tenyésztés torokváladékból és alsó légúti váladékból (általában köpetbol) történik. A Staphylococcus aureus, a Haemophylus influenzae és a Pseudomonas aeruginosa jellemzo, a Pseudomonas mucoid formái pedig szinte specifikusak a cisztás fibrózisra [181, 228, 236]. A H. influenzae 2-5 éves korban a leggyakoribb, prevalenciája ekkor eléri a 20-25%-ot. A S. aureus prevalenciája 6 és 17 éves kor között éri el csúcsértékét (kb. 50%), a P. aeruginosa pedig elsosorban a serdülokortól mutatható ki, és 18 éves korra eléri a 80%-os gyakoriságot [181, 228]. Nasalis/bronchialis transepithelialis potenciálkülönbség mérése Rendkívül érzékeny módszer a CF-re jellemzo transepitheliális potenciálkülönbség mérése a légutakban. Kiküszöbölni látszik a verejtéktesztbol fakadó pontatlanságot, és csökkenti az álnegatív esetek számát. Magyarországon még nem terjedt el [259]. Genetikai vizsgálat és prenatalis diagnosztika A genetikai vizsgálat leírása a módszertan fejezetben található. A prenatalis diagnosztika történhet a II. trimeszterben a magzatvízbol, a mikrovilláris membránenzimek aktivitásának mérésével [ ], és a chorionboholyból vett minta DNS-analízisével is (a terhesség hete között), ha a szüloi mutációk ismertek [ , 194]. Napjainkban már természetesen a DNS mintavételbol történo módszer használatos [10, 194, 214]. 23

25 CF diagnózisának feltételei A cisztás fibrózis betegség diagnózisához legalább egy-egy feltételnek teljesülni kell az alábbi két csoportban felsoroltak közül [45, 221]: A. csoport:? típusos légzoszervi manifesztációk? típusos emésztoszervi megjelenés? pozitív családi anamnézis (valamelyik testvér vagy szülo betegsége ismert) B. csoport:? a verejték Cl - -koncentrációja > 60 (vagy 70)maeq/l? két CFTR-mutáció kimutatása A nemzetközi irodalomban egyre inkább körvonalazódik az igény a cisztás fibrózis definíciójának szukítésére [23, 97, 166, 221]. Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy olyan, a CFTR-mutációk fokozott gyakoriságával járó, a CF-re atipikus betegségek válnak ismertté, amelyek általában csak egy-egy szervrendszeren mutatnak a CF-re jellemzo tüneteket, nem okoznak megemelkedett verejték Cl - -szintet, és nem szükségszeruen járnak mindkét allélen mutációval. Cisztás fibrózis diagnózison ezért csak a több szervre kiterjedo betegséget értik, amely elsosorban a tüdo és a hasnyálmirigy valamilyen fokú érintettségével jár. Mivel az így definiált betegségben általában a verejtékmirigyek kivezetocsövének abszorpciós muködése is károsodott, ezért a CF-betegek túlnyomó része a verejtékteszt segítségével kiszurhetonek tunik. Az ezeknek a feltételeknek nem megfelelo betegségeket pedig az atipikus CF (CFTRasszociált betegség) elnevezéssel illetik. Mivel azonban a szétválasztás, illetve a genetikai háttér sem teljesen egyértelmu, jelen értekezésemben nem alkalmazom ezt a felosztást. 24

26 CFTR-gén A CFTR-t kódoló gén kb. 250 kilobázis hosszúságú, és 27 exont tartalmaz, amelyeket nem kódoló intronok választanak el egymástól [129, 215, 220, 325] óta ismert, hogy a 7. kromoszóma hosszú karjának 31.2-es lókuszán helyezkedik el (National Center for Biotechnology Information: [215, 220]. A leggyakoribb,?f508-as mutáció kimutatását követoen (1989), 1992-ben kb. 80, 1996-ban pedig már megközelítoleg 400 további mutáció volt ismert. Mai tudásunk szerint a CFTR-gén több mint 1300-féle mutációt hordozhat (Cystic Fibrosis Mutation Data Base: bár a kutatások még nem zárultak le, tehát lehet a továbbiakban is újabb mutációk felfedezésére számítani. Ezek azonban minden valószínuség szerint már csak egy-egy családra korlátozódnak, így kijelenthetjük, hogy mára a gyakoribb mutációk túlnyomó részét ismerjük. A mutációtípusok választéka igen széles, és missense-, nonsense-, splice-site-, frameshift-mutációk, illetve aminosav-deléciót okozó génmutációk és -variációk egyaránt elofordulhatnak. A missense-mutáció során egy aminosavat kódoló bázishármas valamelyik tagja kicserélodik, és az így megváltozott kodon más aminosavat határoz meg. A nonsense-mutációban szintén kicserélodés történik a bázishármas valamelyik tagján, ami egy terminációs kodon megjelenését eredményezi. A splice site-mutáció, amely az intronok kivágási helyénél okoz hibát. A frameshift-mutáció során valamely bázishármason belül egy deléció (egy nukleotid kiesése) vagy inserció (egy nukleotid beépülése) történik, melynek következtében a kodonhatárok eltolódnak. Ismerünk ezeken kívül még több mint 200 féle benignus szekvencia-módosulatot is, melyek nem patológiásak, legalábbis erre utal az a tény, hogy ismert mutációkkal kombinálódva sem okoznak klinikai tüneteket [93, 296]. A mutációk megoszlása a gén különbözo részein nem véletlenszeru, hanem léteznek ún. forrópontok (hotspot), amelyek területén a mutációsuruség nagyobb; ilyen forrópont pl. a 4., 7. és a 17b. exon, melyek egyenként 30-féle mutációt hordozhatnak, vagy a 11. exon, melynek területén 5 kodonnyi távolságon belül 11 különbözo mutáció található [161]. 25

27 CFTR felépítése és szerepe egészséges szervezetben A Cystic Fibrosis Transmembran Regulator az ABC-transzporterek (ATP Binding Cassette) szupercsaládjába [136] tartozó 1480 aminosavból felépülo N-glikolizált fehérjelánc [215]. Az érett, glikolizált forma molekulatömege 180 kd. A CFTR-fehérje két hidrofób membránköto domént (MSD) tartalmaz, amelyek egyenként hat transzmembrán szegmensbol épülnek fel, két nukleotidköto domént (NBD), amely ATPkötésre képes, és egy szabályozó funkciójú, nagy töltéssel bíró domént (R-domén), amely több foszforilációs hellyel is rendelkezik a protein kináz A és C számára. A CFTRfehérje felépítése megegyezik az ATP-dependens transzportfehérjék felépítésével, ezért sorolható az ABC-transzporterek családjába. Ennek ellenére funkciója szerint nem ATPdependens transzporter, hanem camp-aktivált Cl csatorna [127, 155]. A CFTR-fehérje tehát elsodleges szerepe szerint camp-függo Cl - -csatorna, de a CF patomechanizmusának vizsgálata révén fény derült arra, hogy más plazmamembráncsatornák muködését is befolyásolja (így az epithelium apicalis membránjában gátolja a Na + -csatornákat, illetve az alternatív Cl - -csatornákat, mint amilyen az ORCC, azaz az outward rectifying chloride channel), és valószínusítheto az endo- és exocitosis szabályozása is [112]. A CFTR-t kódoló RNS elsosorban a CF által klasszikusan érintett epithelialis szövetekben expresszálódik, úgymint a tüdoben, hasnyálmirigyben, májban és verejtékmirigyekben, de megtalálható a vastagbélben, herében és vesében is. Az epithelialis sejtek többsége az apicalis membránjában hordozza, de elofordulhat intracellularisan, a sejtorganellumok (pl. endoplazmatikus retikulum, Golgi-membrán, endoszómák) membránjában is. A CFTR a légutakban a ciliaris epitheliumon apicalisan, a submucosus mirigyekben intracytoplasmaticusan fordul elo. A hasnyálmirigyen belül a ductalis epithelium apicalis membránja tartalmazza. Apicalisan fordul még elo a máj epeútjainak epiheliumában, a belek kriptáinak bazális sejtjeiben, a vese gyüjtotubulusaiban, és a verejtékmirigy kivezeto csöveinek epitheliumában. Ez utóbbi sejtekben a basolateralis membránban is megtalálható. Kimutatták, hogy légutak epithelialis felszínén csak kis mennyiségben detektálható, ezzel szemben jóval nagyobb mennyiségben expresszálódik a hasnyálmirigyben, belekben és a légutak submucosus 26

28 mirigyeiben. Közepes mennyiségben van még jelen a nyál- és verejtékmirigyekben, továbbá a reproduktív traktusban [39, 184, 185, 223]. A CFTR aktiválása feltehetoen két lépésben történik. Az egyik lépés az R-domén foszforilálása, ami az intracellularis camp-szint növekedése miatt aktiválódott campdependens protein-kináz A- és protein-kináz C-hez kötheto. A második lépés az ATP hidrolízise a nukleotidköto helyeken (elsosorban az NBD1-en), amely megváltoztatja a CFTR-fehérje szerkezetét, lehetové téve a Cl - -áteresztést [207, 239]. CFTR gén mutációinak osztályozása A mutációk felosztása több szempont szerint is lehetséges, így a klinikai tünetek súlyossága vagy a molekuláris következmények szerint. Ez utóbbi funkcionális felosztás öt osztályt különböztet meg [307]: I. A fehérjetermelés hibái: Ebbe a csoportba tartoznak azok a mutációk, amelyek korai transzkripciós stopkodont tartalmaznak, illetve azok, amelyek csonka vagy instabil CFTR-fehérjét eredményeznek. Közös jellegzetességük, hogy a transzláció károsodásával nem szintetizálódik teljes hosszúságú fehérje, így ezen fehérjék vagy gyorsabban bomlanak le, vagy már eleve csökkent a funkciójuk, és esetenként el is veszítik azt. A gyakoribb ide tartozó mutációk: G542X [130], 621+1G? T [324], 3905insT [104], CFTRdele2,3 [66]. II. A poszttranszlációs módosulások és az apicalis membránhoz való szállítás hibáit okozó mutációk: A mutáció éretlen, kevéssé glikolizált, feltehetoen hibás konformációjú fehérjét eredményez, mely még mielott elérne a cellularis membránhoz, lebomlik, így a sejtfelszínen nem mutatható ki CFTR-fehérje. A leggyakoribb,?f508-on [129] kívül ide sorolható gyakoribb mutációk még az N1303K [200], a?i507 [130] és a S549R [130, 229]. 27

29 III. A szabályozás hibáit eredményezo mutációk: A mutáns fehérjék elérik az apicalis membránt, de csökkent vagy megszunt az érzékenységük az ATP szabályozó funkciójával szemben. A mutációk többsége a két nukleotidköto domén egyikében található. Viszonylag gyakori képviselojük a G551D [47] mutáció. IV. Hibás Cl - -áteresztéshez vezeto mutációk: Amelyek esetén a protein-kináz A és az ATP megtartott szabályozó funkciója ellenére csökkent a Cl - -áteresztés. Mind a Cl - -áram mértéke, mind a Cl - -csatorna nyitva tartásának ideje érintett lehet. A gyakoribb mutációk: R117H [58], R334W [85], R347P [58]. V. Az RNS vagy a fehérje csökkent szintjét eredményezo mutációk: Ezen mutációk esetén nem történik megfeleloen az mrns-prekurzorokon a splicing, mely egyrészt valamelyik többlet exon(ok) jelenlétével, másrészt az mrns és/vagy a fehérje érintettségével magyarázható. Gyakoribb képviseloik a kbC? T [106], az 5T [55, 160], a kbA? G [37] és az A455E [130] mutációk. Az egyes mutációk osztályokba sorolása azonban nem mindig egyértelmu, elofordulhatnak átfedések, mint pl. a?f508 esetén, amelyben a poszttranszlációs módosulás, illetve az apicalis membránhoz való szállítás hibáit okozó mutáció az elsodleges abnormalitás, de a funkció hibás szabályozása is közrejátszik. Genetikai és klinikai heterogenitás a rendszerezés és prognózis megalkotásának szükségessége A CFTR-gén nagyszámú mutációi miatt szembe kellett nézni azzal, hogy a klinikai kép sem egységes, sot addig teljesen különállónak vélt betegségek is, mint például a CBAVD, ezen gén mutációival magyarázható [110, 119, 125, 264]. A kutatókat azonban már az elso mutációk azonosításától foglalkoztatja a genotípus és fenotípus kapcsolata, összefüggései, amelynek ismerete megkönnyítené a klinikai tünetek közötti eligazodást, a prognózis megalkotását, és így a megfelelo terápia 28

30 kialakítását, amelyre nemcsak a klinikai orvosnak, hanem a CF-es betegeknek kiknek a terápiás lehetoségek fejlodésével ma már esélyük van a felnottkorba lépésre és gyakran a heterozigóta, gyermeket váró szüloknek is szükségük van. A geno- fenotípus kutatásnak kiterjedt irodalma van, amelyben megpróbálják a CFTRgénmutáció típusaira, illetve osztályaira lebontva felvázolni a felismert összefüggéseket, bár a nagyszámú mutációk egymással való kombinálódásából fakadóan, továbbá a környezeti tényezok jelentosége miatt csak néhány egyértelmu összefüggést sikerült felismerni. Jelen értekezésben a magyar betegek adatai alapján összeállított Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszter feldolgozása révén mutatom be a genotípus és fenotípus közötti bizonyítható összefüggéseket. 29

31 II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS OKOZTA CONGENITALIS ADRENALIS HYPERPLASIA Congenitalis adrenalis hyperlasia jelentosége - epidemiológia A congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH), más néven adrenogenitális szindróma (AGS) autoszomális recesszív módon öröklodo betegség, amely a koleszterinbol induló kortizol és aldoszteron bioszintézis öt enzimatikus lépése közül valamelyik zavarának a következménye [56, 195, 266, 310, 311]. A congenitalis adrenalis hyperplasia oka az esetek 95%-ában a 21-hidroxiláz enzim defektusa, ami az enzim által katalizált progeszteron 11-dezoxikortikoszteron ill. a 17- OH-progeszteron 11-dezoxikortizol átalakulás zavarát eredményezi (mind az aldoszteron, mind a kortizol keletkezése elégtelenné válik) (1. ábra) [196]. progeszteron 17-OH-progeszteron 21-hidroxiláz 11-dezoxikortikoszteron 11-dezoxikortizol aldoszteron (zona glomerulosa) kortizol (zona fasciculata) 1. ábra: A szteroid-21-hidroxiláz enzim szerepe az aldoszteron és a kortizol bioszintézisében 30

32 A hibát a 6-os kromoszóma rövid karján található CYP21 gén mutációi okozzák, amelyek az enzimaktivitás részleges, közel teljes, illetve teljes mértéku kieséséhez vezetnek [150, 266]. Ennek tükrében a betegségnek három különbözo súlyosságú klinikai formáját különböztetjük meg, a legsúlyosabb sóveszto (salt wasting, SW), a közepesen súlyos szimpla virilizáló (simple virilizing, SV), és a legenyhébb nemklasszikus (non-classic, NC) (korábbi nevén: késon manifesztálódó, late-onset, LO) formát. A klasszikus formák gyakorisága Magyarországon 1:15000 az újszülöttek között. Az enzimet kódoló gén szerkezetében bekövetkezo különféle mutációk tarka klinikai tüneteket hoznak létre [8]. A betegség klinikai megjelenési formái jellegzetesen széles spektrummal rendelkeznek, ahova a késoi életkorban jelentkezo, sokszor alig diagnosztizált eltérésektol kezdve a sokkal súlyosabb, akár életet veszélyezteto állapotok is tartoznak. A 21-hidroxiláz defektus klinikai megjelenési formái a genotípus eltéréseinek mértékétol, helyétol függnek. A különbözo deléciók, splice mutációk, nonsense és frameshift mutációk jelentos zavart okozhatnak a gén szerkezetében, ezáltal pedig a gén által kódolt enzimfehérje szerkezetében. Vannak genotípus eltérések, amelyek egyáltalán nem, vagy csak enyhe problémát okoznak, alig csökkentve az enzim aktivitását [113, 178]. A 21-hidroxiláz enzim defektus okozta congenitalis adrenogenitalis szindróma olyan betegség, amely kezelés nélkül a beteg komoly szomatikus, szexuális és pszichés fejlodési zavaraihoz vezet [101, 107, 141, 163, 208, 210, 227, 256]. Ma azonban már lehetoség van a hiányzó hormonok pótlására a szubsztitúciós hormonterápiával. Jól beállított glükokortikoid vérszint mellett a túlzott ACTH termelés is megszunik, így a rendellenesen fokozott androgén termelés is visszaáll a normál szintre. A hormon szubsztitúciós terápia eredménye azonban annál kedvezobb, minél korábban ismerik fel a betegséget [142, 180, 258]. A veleszületett genitális torzulások pedig plasztikai sebészeti beavatkozással helyrehozhatóak [1, 4, 102, 197], így megfelelo orvosi és lelki segítséget kapva ezek a gyermekek is teljes értéku életet élhetnek [62, 63, 88]. 31

33 CAH regiszter Magyarországon 1978-ban Sólyom János és munkatársai (SOTE II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika, szteroidhormonanalitikai, gyermekendokrin konzultációs központ) széles köru programot indítottak el a 21-hidroxiláz enzim defektus országos szintu célzott szurésére. A vérminták gyors analízisét, az eredmények feldolgozását, a magyarországi CAH betegek regisztrálását végzik, valamint a beküldo kezelo orvossal konzultálnak a gyermek kezelésérol. Megállapították a különbözo korcsoportokra jellemzo vérfolt 17-OH-progeszteron szint normál értékét, és felállítottak egy biztonságos "riasztási" értéket, amely felett a gyermek a betegségre gyanús, így további kontrollokra van szükség. Téves pozitív és negatív esetek kiküszöbölésére az összes beteg kórlefolyását nyomon követik. Ez az országos szintu, célzott szurés 1978 óta folyamatosan muködik [72, 87, 140, , 252, 253, 285, 286]. Az így létrehozott országos CAH regiszterre támaszkodva kezdodött meg a klinika molekuláris genetikai laboratóriumában a CAH génbank felállítása. Prenatalis vizsgálatok Prenatális vizsgálatokat olyan családokban végzünk, ahol valamelyik gyermek ebben a betegségben szenved [65, 171, 175, 198, 216, 257]. Ilyen esetekben az újabb terhesség megállapítása után azonnal elkezdik az anya dexamethason kezelését. A terápia célja, hogy megakadályozza a magzat külso nemi szerveinek magas androgénszint miatt bekövetkezo torzulását. A prenatalis terápiát azonban minél elobb el kell kezdeni, lehetoleg az utolsó menstruációt követo 7. hétig (5 héttel a fogamzás után). Ez ugyanis az az idoszak, amikor a külso nemi szervek masculinisatiója kezelés nélkül elkezdodik [30, 198]. Bár a dexamethason kezelés segít megakadályozni a gyermek virilizációját, tartós adása mellékhatásokkal járhat az anyára nézve [204, 234]. Hogy ezeket a fiatal noket ne kelljen feleslegesen ennek a terhelésnek kitenni, szükség van a magzat érintettségének mielobbi tisztázására. A korán elkezdett prenatalis terápia ugyanis valójában egy vak terápia; a korábban született beteg testvér alapján feltételezzük csupán, hogy a magzat beteg. Kezdetben az elso próbálkozás a magzatvíz 17-OH-progeszteron szintjének mérése volt, amelyre azonban csak a terhesség 32

34 második trimesterében nyílt lehetoség [79, 120, 255, 318]. Késobb felfedezték a 21- hidroxilázt kódoló gén és a HLA markerek kapcsolatát. A kapcsolt gének vizsgálata azonban sokszor nem volt elég megbízható [182, 265]. A chorionboholy biopszia bevezetése újabb lehetoséget jelentett a betegség minél korábbi diagnózisára [65, 225, 255, 279]. A mintából kivont DNS HLA genotipizálása mellett ma már lehetoség van a mutáció pontos helyének meghatározására is. A chorionboholy mintavétellel a terhesség hetében megállapítható a magzat neme és érintettsége [78]. Ha a gyermek nem érintett, a terápia is elhagyható. Ugyanígy abbahagyható a dexamethason szedése, ha a magzat érintett, de fiú. Náluk ugyanis a magzati élet ideje alatt nincs terápiát igénylo kóros elváltozás a külso nemi szerveken, elegendo a kezelés indítása a születés után. Hazai gyakorlatban, érintett lánymagzat esetén prenatalis terápia végzendo. Ilyenkor fontos, hogy az anya megszakítás nélkül, az egész terhesség alatt hormonterápiában részesüljön (2. ábra). CAH-magzat elso magyarországi sikeres kezelésérol Niederland és mtsai [198] számoltak be. Hetek vagy Teszt hcg CVS vagy amniocentézis Dexamethason Kariotípus Leány Fiú DNS-analízis STOP 2. ábra: A szteroid 21-hidroxiláz enzim defektus okozta congenitalis adrenalis hyperplasiás magzatok prenatális diagnózisának stratégiája 33

35 Ugyanakkor meg kell említeni, hogy egyes (elsosorban amerikai) iskolák tekintettel a dexamethason szedés során fellépo esetleges mellékhatásokra (anya cushingoidizálódása, magzat hossz- és súlygyarapodásbeli elmaradása, újszülött megnövekedett kockázata cardio-vasculáris megbetegedések kialakulására), továbbra is kísérleti terápiának sorolják be a prenatalisan alkalmazott glükokortikoid terápiát [204, 234]. A 21-hidroxiláz defektusos beteg genotípusának megállapítására új lehetoséget hozott a polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazása [201, 202]. A 21-hidroxiláz defektust okozó leggyakoribb mutációk pontos helye és szerkezete ismert, így használható vizsgálatára a PCR. A. Wedell, stockholmi kutató és mtsai kidolgozták az allélspecifikus amplifikáció módszerét a 21-hidroxiláz defektus vizsgálatára [303]. E módszer magyarországi bevezetésével, valamint továbbfejlesztésével foglalkoztak Sasvári Mária és mtsai (Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet) [15, 279], velük együttmuködve vezettük be a diagnosztikai módszer klinikai alkalmazását (közlemények: III. és IV.). 21-hidroxiláz locus A 21-hidroxiláz génje a 6-os kromoszóma rövid karján a HLA III-as komplexen belül helyezkedik el (3. ábra) [31, 115, 266, 309]. Itt található meg a tumor nekrózis faktor (TNF) génje, egy hosokk fehérje génje (HSP-70), a komplement 2-es komponensének génje (C2), a properdin B faktor génje /Bf/. Közvetlen szomszédja a komplement 4-es komponense (C4), amelynek génje csakúgy, mint a 21-hidroxiláz génje (CYP21) nem egy, hanem több példányban van jelen a kromoszómán, és a C4- CYP21 párok tandem ismétlodo egységekként helyezkednek el. A két-két másolat azonban nem teljesen azonos, ennek alapján megkülönböztetheto C4A és C4B gén, a 21-hidroxiláz esetében pedig CYP21 és CYP21P, azaz pszeudogén. A CYP21 gén 10 exonból és 9 intronból áll és megközelítoleg 3kB hosszúságú. A 21-hidroxiláz aktív génje és pszeudogénje 98%-ban azonos. A leglényegesebb különbség közöttük az, hogy a pszeudogén 3. exonjában jelen van egy 8 bázispárnyi deléció, ami az enzimaktivitást teljesen megszünteti, ezért a pszeudogénrol aktív enzim nem 34