A sejt-közvetítette immunitás vizsgálata migráeiógátlási technikával, patkány experimentális trichinellosisában

Átírás

1 A sejt-közvetítette immunitás vizsgálata migráeiógátlási technikával, patkány experimentális trichinellosisában Dr. BÁKI György Dr. ALÖLDY Pál Országos Közegészségügyi Intézet, Budapest Országos Hematológiai és Vértranszfúziós Intézet, Budapest "Investigation of the cell mediated immunity by the migration inhibition test in experimental trichinellosis of the rat, " - Bánki, Gy., Alföldy, P. - Parasit. Hung., ABSTRACT. An examination of the cellular hypersensitivity by using metabolic larval antigen (MLA) in the spleen fragment technique of the migration inhibition assay revealed no production of the migration inhibition factor during the intestinal phase of the infection. In contrast, marked inhibition could be demonstrated in the muscular phase (days 28 to 38 and on day 80) by both the direct and indirect migration inhibition tests. In studies with the capillary technique MLA was found to stimulate the in vitro migration of spleen cells of non infected rats. In antigen-free culture medium spleen ceus from infected animals showed significantly enhanced migration in comparison to that of cells from non infected rats. Patkány trichinella-lárvákkal történő' fertőzése után a kifejlődő férgek a napon - a vékonybél anaphylaxiás gyulladása kíséretében - kilökődnek. Ez a féregexpulzió jelensége, amellyel az intestinalis szak végetér. Ezzel ölelkezően, már a fertőzés 4-5. napján kezdődik a lárvamigráció, amit a lárváknak a harántcsíkolt vázizomzatban való megtelepedése követ. Az intracellularis lárvák a fertőzés 2-5. hetétől betekerednek, betokolódnak és nyugvó állapotba jutnak. Ennek az un. preadult stádiumnak a kialakulása fontos határkő: a lárva ekkor nyeri el feftőzőképességét a stichosoma kifejlődése, savállóvá válás és egyéb érési folyamatok révén. A bélfázis immunbiológiailag legérdekesebb jelensége a kilökődés, melynek lezajlása után az állat közel abszolút immunitással rendelkezik az újrafertőzéssel szemben. Ennek kiváltásában a parazita metabolikus preadult-lárva antigénje (MLA) valószinüleg lényeges szerepet játszik (17). A MLA feltehetően stichosoma secretum (7). A féregexpulzió összetett, többlépcsős folyamat, amelynek a pontos mechanizmusa még felderítetlen. ippostrongylus brasiliensisszel fertőzött patkányon szerzett tapasztalatok szerint azonban úgy látszik, hogy létrejöttében mind a humoralis tényezők: homocytotrop ellenanyagok (10), ill, a férgeket szenzibilizáló immunglobulinok (12), mind a sejt-közvetítette immunválasz (CMI) tényezői szerepelnek (11). Korábbi, nem közölt vizsgálatainkban X az OVARY (18) szerint végzett aktív és passzív kután anaphylaxiás próbával (ACA, ill. PCA) kb, a 10. naptól kezdve tudtunk homocytotrop ellenanyagokat kimutatni. Az immunsavóval végzett passzív védési kísérletek azonban eredménytelenek voltak. Bizonyos, bár nem következetes féregszám csökkenést eredményezett a peritonealis exsudatum-sejtek, ill, lépsejtek adaptiv átvitele. olyamatos hydrocortison kezeléssel viszont teljesen, újszülöttkori thymusirtással pedig részlegesen gátolni lehetett a féregkilökődést. Ezek a tapasztalatok a CMI alapvető szerepére utalnak a védettség kialakításában. Jelen munkánkban a CMI in vitro kimutatására alkalmas sejtmigrációs módszerekkel megkíséreltük újabb adatokat nyerni a trichinellosist kísérő immunjelenségek természetéről. X Előadás az Országos Közegészségügyi Intézet tudományos ülésén, Budapesten, november 10-én.

2 1, táblázat em fertőzött patkányok lepsejt migrációja metabolikus trichinella-antigént (MLA) tartalmazó tápfolyadékban (kapilláris módszer) Állat 1 2 * 3 Medium K MLA K MLA K MLA 1: 100 1:200 1 :400 1: 100 1:200 1 :400 1: 100 1: 200 1:400 Planimeter index Átlag MI % t 1,4690 1, , ,4954 4,9275 0,6848 1,9516 3,6748 3,6963 P >10% >10% >10% >10%<0,01% >10% <10% <5% <5% tápfolya 2. táblázat Trichinella-fertŐzött patkányok lepsejt migrációja antigén-mentes dékban (kapilláris módszer) Állat l 2 l Planimeter index Átlag: MI % 369=100% t 3,4863 3,6640 2,0735 7,1133 P <1% <1% <10% <0,01%

3 Anyag és módszer Vizsgálatainkat CY patkányokon végeztük. Az állatok fertó'zése egérben fenntartott Trichinella spiralis törzs pepsin-sósav oldattal décapsulait, mosott preadult lárváival történt, gyomorszondán át. A fertőző dózis 10 lárva/testsúly g volt. A direkt migrációs vizsgálatokban lépsejteket, ill. esetenként steril parafinolajjal provokált peritoneális exsudatum-sejteket, vagy az állatok lépéből kivágott 1 mm élhosszúságú darabkákat alkalmaztunk. A direkt migrációt részint kapilláris technikával, GEORGE és VAUGHA eredeti módszerének (9) DAVID és DAVID által leírt változata szerint (6), részint lépfragment technikával, SVEJCAR és munkatársai szerint (22) vizsgáltuk. A migráció gátló faktor (MI) eló'állitása és indirekt tesztelése BLOOM és BEETT szerint történt (2). Utóbbi eljáráshoz a lymphocytákat a mesenterialis nyirokcsomókból nyertük, és a felülúszókat normál patkány lépfragmentjein teszteltük. Tápfolyadékként Eagle's Minimal Essential Médiumot (MEM) használtunk, a kapilláris módszerben 10%, a fragment módszerben 20% a lymphocyta kultúrák esetében pedig 5% fetalis borjúszérum (CS) kiegészítéssel. A sejtek életképességét trypankék exkluzióval vizsgáltuk. Az elpusztult sejtek aránya általában nem haladta meg a 10-15%-ot. Lépsejtszuszpenzió készítésekor a vörösvértesteket 0,83%-os ammóniumkloriddal hemolizáltuk nem fajlagos gátlás elkerülése végett. Egy-egy állatból legalább 4-6 parallelmintát készítettünk és az antigént tartalmazó kamrákban észlelt migrációs zónák planimetriás értékeit saját antigénmentes kontrolijukkal hasonlítottuk össze a migrációs index (MI) kiszámításakor (2). M j a migráció planimetriás értéke antigén jelenlétében a migráció planimetriás értéke a kontroll médiumban A lépfragmenttel végzett vizsgálatokban a kiültetett lépdarabkát és a belőle kirajzó sejtek által létrehozott migrációs mező határvonalát körnek tekintve a körgyűrű alakú migrációs zóna sugarát a következő képlettel számítottuk ki (22): R (a körgyűrű sugara) = 0, 564 (W 2 "]^V* ahol T^ = a migrációs terület planimetriás értéke, T = a lépfragment planimetriás értéke. A lépfragment módszerben a Ml-et a planimetriás értékek hányadosa helyett a megfelelő R értékek hányadosa adja. A migrációs tesztekben metabolikus lárvaantigént (MLA) használtunk. Ennek előállítására az izolált, mosott, felületi fertőtlenítésen átesett preadult lárvákat 48 óra hosszat inkubáltuk Hanks' BSS-ben vagy MEM-ben. A 10,000 lárvaekvivalens/ml-re beállított MLA fehérjekoncentrációja átlagosan 5,000,ug/ml volt. A fehérjetartalom meghatározása 280 nm-es ultraibolya huuámhosszon UICAM spektrofotométerrel történt. Eredmények Az antigén esetleges sejt-toxikusságának megállapítására végzett előzetes vizsgálatok során a 2, 000 lárvaekvivalens/ml koncentráció bizonyult a legnagyobb nem toxikus töménységnek. Ezért az első kísérletsorozatban ilyen antigén-koncentrációt létesítettünk a migrációs kamrákban. Első kisérletünkben a patkány trichinella-fertőzések dinamikáját kívántuk vizsgálni. lefolyása során a migrációgátlás A fertőzés egymást követő szakaszaiban lépsejtek, ill. peritoneális exsudatum-sejtek felhasználásával a kapilláris technikát, valamint a lépfragment módszert egyaránt alkalmaztuk. Az 1. ábra a 3 módszerrel nyert eredményeket együttesen szemlélteti. A kontroll, egészséges állatokon nyert értékek szórásának megfelelően csak a 85% MI alatti sávot értékeltük gátlásként.

4 Az eredményeket a fertőzés szakaszai szerint tekintve: egy-egy esetet kivéve az intestinalis fázisban gátlást nem észleltünk; jelentős fokú migrációgátlás mutatkozott a nap táján, sőt a krónikus szakban vizsgált csoportban is, tehát lényegében a muscularis fázisban (1. ábra). k IEKCIO/10 lárvcvc / 1. ábra Macrophag migratio dinamikája patkány experimentális Trichinella spiralis fertőzése során eltűnő, hogy az intestinalis szakaszban, valamint a kontroll állatokban is, több esetben az antigén stimuláló hatást gyakorolt a migrációra. Ezt a jelenséget külön is vizsgáltuk. em fertőzött patkányok (i_3) lépsejtjeinek migrációjára a MLA 1:100, 1:200 és 1:400 arányú hígításai értékelhető serkentő hatást gyakoroltak az antigénmentes médiumhoz (K) képest (1. táblázat). Egy másik kísérletben normál (^_2Í és fertőzött (j_^) állatok lépéből izolált sejtek migrációját hasonlítottuk össze antigénmentes tápfolyadékban. A fertőzött patkányok lépsejtjei általában szignifikánsan fokozott migrációt mutattak a kontroll állatok sejtjeihez viszonyítva (2. táblázat). A muscularis szakban, a fertőzés napja között észlelt gátlás specifikus voltának igazolására öt esetben végeztünk indirekt tesztet. Ebben a vizsgálatsorozatban a fertőzött, ill. a kontroll állatok mesenteriális nyirokcsomóiból nyert, a macrophagoktól ü- vegfelületen "letapasztással" megtisztított lymphocytákat részint MLA-t, részint élő lárvákat tartalmazó MEM f 5% CS tápoldatban tenyésztettük. A kultúrák supernatansait normál patkány lépfragmenteken tesztelve a lymphocyták MI termelése igazolható volt: a MI értékek 60-75% között mozogtak. Az antigénként élő lárvákat tartalmazó kultúrák erősebb gátlást adtak, mint a MLA-nel tenyésztettek.

5 Megvitatás Vizsgálataink során arra a kérdésre kerestünk választ, hogy van-e szerepe a migrációgátlási technikával kimutatható sejtközvetítette immunitásnak (CMI) a patkány trichinella-fertőzésében, illetőleg, hogy a MLA felelős-e a CMI kialakulásáért. Mint ismeretes, a CMI-ban a thymus-dependens T lymphocyták játszanak alapvető szerepet. E folyamatokban a szenzibilizált T-sejtek valószinűleg többféle sejttel, különböző módon képesek együttműködni, többek között nem ellenanyag természetű humorális mediátorok - lymphokinek - termelése révén (8), Ezek egyike a MI is, amelynek a termelése homológ antigéningerre indul meg a szenzibilizált lymphocytákban, s amely mind a macrophagoknak (2), mind a vér leukocytáinak a spontán migrációját gátolni képes (21). Azt a lehetőséget, hogy a CMI a trichinellosisban is fontos szerepet játszik, LARSH vetette fel elsőként (16) lymphoid sejtekkel végzett eredményes védési kisérletei alapján. Erre utal a bevezetésben említett korábbi vizsgálataink számos adata is, mint pl: a sejtekkel végzett passzív védési kísérletek, a neonatális thymusirtás és részben a hydrocortison kezelés erős immunosuppressiv hatása is. CYPESS és LARSH (4), majd CYPESS és munkatársai (5) egérben és tengerimalacban trichinella antigén + komplett reund adjuvánssal végzett immunizálással migrációgátlási teszttel igazolható CMI-t tudtak létrehozni. KOZAR és PIOTROWSKI (14) tengerimalacok trichinellosisát vizsgálva lárvakivonat-antigénnel a fertőzés napja között következetesen macrophag migrációgátlást észlelt. Magunk az immunkilökődés időszakában nem tudtunk migrációgátlást kimutatni a leírt kísérleti feltételek között, pedig patkányban az expulsio lényegesen korábban és következetesebben zajlik le, mint tengerimalacban vagy egérben,és a kialakuló védettség is sokkal erős ebb (3, 15). elmerül a kérdés, hogy a CMI-t talán a szomatikus antigének hozzák létre, míg a MLA elsősorban az ellenanyagtermelés, s ezen belül a korai típusú hiperszenzitivitás kiváltásában játszik szerepet, hiszen az utóbbi kimutatására alkalmazott ACA, ill. PCA vizsgálatokban a MLA igen hatásosnak bizonyult. Ez a feltevés még igazolásra szorul, annál is inkább, mert a MLA-nel az intestinalis fázisban késői típusú bőrreakciót lehetett kiváltani, a fertőzés későbbi szakaszában pedig migrációgátlást. A MLA nagyobb hígításban - 50, sőt 25 lárvaekvivalens/ml koncentrációban is - stimuláló hatást gyakorolt nem szenzibilizált sejtek migrációjára, a fertőzött állatokból izolált sejtek pedig még erőteljesebb migráció fokozódást mutattak. Ezt az eredményt úgy értelmezhetjük, hogy a MLA mind in vitro, mind in vivo aspecifikus (és esetleg erőteljesebb specifikus) kemotaktikus hatással rendelkezik, ami elősegíti bizonyos sejttípusok akkumulációját az antigénfókusz környezetében. Lehetséges, hogy ez a jelenség összefügg a CMI-sal és a MI specifikus eredetű kétfázisú in vivo hatásával magyarázható (1): az antigénfókusztól távolodva a MI koncentrációja rohamosan csökken, ebben a zónában migráció-serkentő hatás érvényesül; az antigénfókuszhoz közeledve viszont a migrációt gátló nagyobb MI koncentráció sejt-akkumuláló hatása dominál, A fertőzés napja körül észlelt direkt és indirekt migrációgátlás időben egybeesik a késői típusú bőrreakció második hullámával. Ez az időszak a muscularis preadult időszak kialakulásának, a lárvák betokozódásának és az ezt kisérő jellegzetes, helyi celluláris reakciónak felel meg. em tisztázott, hogy a tok kialakulásában a gazda-parazita kölcsönhatás milyen tényezői szerepelnek (13, 19, 20). Valószínű azonban, hogy a betokozódás teszi lehetővé a preadult lárvák tartós túlélését egy immunbiológiailag ellenséges környezetben. Eredményeink a tokképződés és a CMI esetleges kapcsolatára utalnak. Összefoglalás A celluláris típusú túlérzékenység lépfragment módszerrel és metabolikus lárvaantigénnel (MLA) végzett vizsgálata során a fertőzöttség intestinalis szakaszában MI termelést nem lehetett kimutatni. Kifejezett gátlást lehetett viszont észlelni mind direkt, mind indirekt migrációgátlási vizsgálatokkal a muscularis szakban, a 28-38, ill. a 80.

6 napon vizsgált állatokban. Kapilláris technikával végzett vizsgálatok során a MLA fokozta a nem fertőzött állatok lépsejtjeinek in vitro vándorlását. Antigén-mentes tápfolyadékban a fertőzött állatokból izolált lépsejtek migrációja szignifikánsan élénkebb volt a nem fertőzött állatokéhoz viszonyítva. 1. BEDIXE, G. : Személyes közlés. Irodalom 2. BLOOM, B. R. - BEETT, B. (1971): The assay of inhibition of macrophage migration and the production of migration inhibitory factor (MI) and skin reactive factor (SR) in the guinea pig. In: In vitro methods in cell-mediated immunity. Ed. B. R. Bloom and Ph, R. Glade. Academic Press, ew York and London, CATTY, D. (1969): The immunology of nematode infections. Trichinosis in guinea pigs as a model. Monographs in Allergy CYPESS, R. - LARSH Jr. J.E. (1970): The macrophage inhibition assay (MIA) as an in vitro correlate of delayed hypersensitivity (DH) in mice sensitized to Trichinella spiralis antigens (s). J. Parasit. 56. (Sect. II. Part 1) CYPESS, R. - LARSH Jr. J. E. - PEGRAM, Ch. (1971): Macrophage inhibition produced by guinea pigs after sensization with a larval antigen of Trichinella spiralis. J. Parasit. _57, DAVID, J. R. - DAVID, R. (1971): Assay for inhibition of macrophage migration. In: In vitro methods in cell-mediated immunity. Ed. B. R. Bloom and Ph. R. Glade. Academic Press, ew York and London, DESPOMMIER, D.D. - MÜLLER, M. (1970): The stichosome of Trichinella spiralis: its structure and function. J.Parasit. 56. (Sect. II. Part 1) DUMODE, D. C. - WOLSTECROT, R. A. - PAAYI, G. S. - MATTHEW, M. - MORLEY, J. - HOWSO, W. T. (1969): "Lymphokines": non-antibody mediators of ceuular immunity generated by lymphocyte activation. ature (London), GEORGE, M. - VAUGHA, J. H. (1962): In vitro cell migration as a model for delayed hypersensitivity. Proc. Soc. Exp. Biol. (. Y. ) JARRETT, W..H. (1970): Mechanisms of immunological expulsion of intestinal helmints. J.Parasit. 56. (Sect. II. Part Tf KELLY, J. D. (1974): Expulsion of ippostrtmgylus brasiliensis from the small intestine of the rat: the role of cellular*components in the immune response. Proc, 3 r d Int. Congr. Parasit. (München) 'S. H KELLY, J. D. - OGILVIE, B. M. (1972):* Intestinal mast ceu and eosinophil numbers during worm expulsion in nulliparous and lactating rats infected with ippostrongylus brasiliensis. Int. Ar*ch. Allergy KOZAR, Z. (1971): Some current immunologic aspects of trichinellosis. Wiad, Parazyt KOZAR, Z. - PIOTROWSKI, R. (1971): Peritoneal macrophage inhibition test in guinea pigs infected with Trichinella spiralis. Wiad. Parazyt LARSH Jr. J.E. (1963): Experimental Trichinosis. Advances in Parasitology, LARSH Jr. J.E. (1967): The present understanding of the mechanism of immunity to Trichinella spiralis. Amer. J. Trop. Med. Hyg. _ MILLS, C.K. - KET,. H. (1965): Excretions and secretions of Trichinella spiralis and their role in immunity. Exp. Parasit. 1_

7 18. OVARY, Z. (1964): Passive Cutaneous Anaphylaxis. In: Immunological Methods. Ed. J.. Ackroyd. Blackwell Scientific Publications, Oxford PEREVERZEVA, E.V. (1969): K voproszu o formirovanii szojegyinyityelnotkannoj kapszuli vokrug licsinok Trichinell. Wiad. Parazyt POPOW, J. - KUMOR-RABA, L. (1966): Zachowanie sie otoczki wlosnia przy stosowanin ACTH. Wiad. Parazyt. 12, SOBORG, M. (1968): In vitro migration of peripheral human leukocytes in cellular hypersensitivity. Acta Med. Scand SVEJCAR, J. - JOHAOVSKY, J. (1961): Demonstration of delayed (tuberculin) type hypersensitivity in vitro. I. Selection of methods. Z. Immun, forsch Érkezett: Dr. BAKI, Gy. Budapest ővárosi KÖJÁL 1138 Budapest, Váci ut 174. Dr. ALÖLDY, P. Országos Hematológiai és Vértranszfúziós Intézet 1113 Budapest, Daróczi ut 24.