Tumor specifikus DNS/gén dózis szerepe a papilláris vesetumor kialakulásában

Átírás

1 Tumor specifikus DNS/gén dózis szerepe a papilláris vesetumor kialakulásában Doktori (PhD) értekezés Szerző: Dr. Sarlós Donát Péter Pécsi Tudományegyetem, Klinikai Központ Urológiai Klinika Pécs, Doktori iskolavezetője: Prof. Dr. Bogár Lajos Programvezető: Prof. Dr.Pajor László Témavezetők: Prof. Dr. Kovács Gyula Dr. Szántó Árpád 1

2 Tartalomjegyzék: Rövidítések jegyzéke: Bevezetés A vese tumorok morfológiai, biológiai és klinikai diverzitása A vese tumorok modern osztályozása: egy paradigmaváltás A papilláris vesetumor A papilláris vesetumor szövettana A papilláris vesetumor kromoszóma és DNS profilja A papilláris vese tumorok kromoszómális klonális fejlődése A papilláris vese tumorok megkülönböztető génexpressziós mintája A papilláris vese tumorok eredetéről tartott eltérő vélemények Célkitűzés Vizsgálati anyagok és módszerek Szövetminták A MET tirozin kináz domén mutáció analízise A 19-es exon mutáció SSCP (Egyszálú DNS Konformációs Polimorfizmus) vizsgálata A mutált és a vad típusú MET RT-PCR analízise Tissue microarray (TMA) készítése Immunhisztokémia Eredmények A papilláris pre-neoplasztikus léziók gyakorisága és szövettana A papilláris vese tumorok szövettani heterogenitása A kromoszóma 7 duplikációja és a MET alterációja familiáris vesetumorban A MET kifejeződése fötális vesében, pre-neoplasztikus lézióban és papilláris vese tumorban A 17-es kromoszóma duplikációjához és amplifikációjához társuló HNF1B kifejeződése fötális vesében, prekurzor lézióban és tumorban A 17-es kromoszóma duplikációjához társuló KRT17 kifejeződése normál vesében, prekurzor lézióban és papilláris vesetumorban Az X és Y kromoszóma elváltozása papilláris vese tumorokban Az Y kromoszóma vesztése familiáris papilláris vesetumorokban A PCDH11XY gén kifejeződése fötális vesében, pre-neoplasztikus léziókban és papilláris vesetumorokban Megbeszélés

3 5.1. Papilláris vesetumor eredete A 7-es kromoszóma duplikációja/amplifikációja valamint a MET gén expressziója a papilláris vesetumor kialakulásában A 17-es kromoszóma duplikációja és a HNF1B (TCF2) transzkripciós faktor a papilláris vese tumorok kialakulásában A 17-es kromoszóma duplikációja és a KRT17 expressziója a pre-neoplasztikus léziókban és papilláris vesetumorokban Az Y kromoszóma hiánya és a PCDH11XY expressziója prekurzor léziókban és papilláris vesetumorban Modell a papilláris vesetumor kialakulására Következtetések Irodalomjegyzék Közlemények Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények Az értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények Köszönetnyilvánítás

4 Rövidítések jegyzéke: BAC-array: bacterial artificial chromosome array, Bakteriális artefíciális kromoszóma array CB: comma shape body CGH: comparative genomic hybridisation, DNS alapú összehasonlító genomikus hibridizáció CMM: cap metanpphrikus mesenchyma crcc: világossejtes veserák chrcc: kromofób veserák DNS: dezoxiribonukleinsav dntp: dezixiribonuleozid-trifoszfát EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav HE: hematoxylin-eozin HNF1B: hepatocyte nuclear factor 1 homeobox B ISUP: Uropatológusok Nemzetközi Társasága, International Society of Urological Pathology KRT17: keratin 17 LRRK2: leucine-rich repeat kinase 2 MDE: mutation detection enhancement MET: hepatocyte growth factor receptor MEST: mesoderm-specific transcript MTSCC: Mucinous Tubular and Spindle Cell Carcinoma, Mucinózus tubuláris és orsósejtes daganat NCBI: National Center for Biotechnology Information NR: nephrogén rest PCDH: protokadherin PCR: polymerase chain reaction prcc: papilláris veserák PPL: papilláris prekurzor lézió RCC: renal cell carcinoma, vesesejtes rák SSCP: single-strand conformation polymorphism TCF2: transcription factor 2 TFE3: transcription factor E3 TGIF2LY: transforming growth factor-beta-induced factor 2-like, y-linked TMA: tissue micro array WHO: World Health Organisation, Egészségügyi Világszervezet 4

5 1.Bevezetés 1.1. A vese tumorok morfológiai, biológiai és klinikai diverzitása A vesesejtes rákot (RCC) eredetileg Grawitz 1883-ban hypernephromának nevezte el, mert szövettani szerkezete hasonlít a mellékveséhez. Feltételezte, hogy a vesedaganatok mellékvese maradványokból fejlődnek ki, amik néha megtalálhatók a vesetok alatt. Sokáig Grawitz tumornak hívták a vesesejtes rákot, majd átnevezték adenokarcinómának. Erre a tumor típusra azonban a vesesejtes karcinóma elnevezés illik leginkább, mivel a vese a nem-polarizált mezodermális sejtekből fejlődik ki. A vese csatornák sejtjei csak a működésük elvégzésére differenciálódtak polarizált sejtekké és így tekinthetők epithelnek. A klasszifikáció hagyományosan a hematoxilin-eozinnal megfestett szövettani metszetek mikroszkopikus képén alapszik. Sokáig a vesesejtes rák egyetlen patológiai entitásnak számított, amin belül elkülönítettek világos sejtes és granuláris sejtes vese rákokat, a tumorsejtek citoplazmájának tulajdonságai alapján. A granuláris és a világos sejtes típusok gyakori átfedése miatt nem volt mindig egyértelmű a diagnózis, ezért bevezették a kevert, világos és granuláris sejtes vese karcinóma fogalmát. Bannasch és munkatársai kísérletes patkány tumorok elektronmikroszkópos és hisztológiai elemzése során egy új nomenklatúrát vezettek be a patkányok vese tumorainak osztályozására (Bannasch et al., 1980). A tumorokat világossejtes, kromofil, kromofób és orsó sejtes típusokra, továbbá benignus oncocytómára különítette el. Ezt az experimentális tumor klasszifikációt ültette át a humán vese tumorokra Thoeness 1986-ban (Thoeness et al., 5

6 1986 a,b). Az ő érdeme a kromofób veserák felismerése és morfológiai leírása a humán vese tumorok közt. Azonban a világossejtes, kromofil (ezen belül a bazofil és eozinofil) és kromofób klasszifikáció ugyanolyan nehézséghez vezetett, mint a korábbi világossejtes és granulársejtes felosztás: a világossejtes tumorok egy része kromofil volt, és a kromofób tumorok közt is gyakran előfordult kromofil tumor. Ezeket az átfedő szövettani megjelenést a vese tumorok különböző eredete, biológiája és ennek következtében nagyfokú sejt-, és növekedési formáinak a heterogenitása okozza A vese tumorok modern osztályozása: egy paradigmaváltás Az évtizedekig tartó, hagyományos szövettani megjelenésen, azaz a sejtek citológiai variabilitásán és növekedési formáján alapuló osztályozások után a 80-as évek végén és 90-es évek elején egy paradigmaváltás történt: az osztályozást a tumorokban előforduló specifikus kromoszóma eltérésekre alapozták (Kovacs, 1993 a,b). A Heidelbergi klasszifikáció a tumor-specifikus genetikai eltérésekre alapul, amik biztonsággal azonosítják a különböző vese tumorokat, még akkor is, ha szövettanilag nem egyértelműen kórismézhetők (Kovacs et al., 1997). Ezt a robosztus klasszifikációt később a WHO és ISUP egy az egyben átvette és a vese tumorok néhány százalékát kitevő ritka tumorok katalógusával egészítette ki (Eble et al., 2004; Moch et al., 2016; Samaratunga et al. 2014). Az új klasszifikáció specifikus kromoszóma elváltozások alapján a vese tumorokat négy fő típusra osztotta, amik a vesedaganatok több, mint 95%-át kiteszik. Ezek genetikai eltérések a kulcsai a differenciál diagnosztikának, ugyanis a különböző tumorok mikroszkopikus morfológiájuk alapján sokszor alig, vagy egyáltalán nem különíthetők 6

7 el. A pontos diagnosztika viszont nélkülözhetetlen az eltérő viselkedésű és prognózisú tumorok megfelelő kezeléséhez. A vesedaganatok genotípusa a karcinogenezis során olyan változásokon mehet át, amik maradandónak tekinthetők. Példaként egy kromoszóma vagy akár csak egy gén lókusz elvesztése után az adott DNS részletet a daganat már nem tudja visszanyerni. A sejtek festődési tulajdonságai, méretük, elrendeződésük, mint fenotípusbeli elváltozások azonban a tumor progressziója során változhatnak. A genetikai elváltozásokra alapuló klasszifikáció ( Heidelbergi Klasszifikáció ) szerinti beosztás mindig egyértelmű diagnózishoz vezet (Kovács et al. 1997). Egyes, jelentősen elburjánzott, nehezen azonosítható szövettani képet mutató, szarkomatózus vesedaganatok az új klasszifikáció alapján nem képviselnek külön entitást, mert az alapvető vese tumorok mindegyik típusából származhatnak, az eredet genetikai vizsgálattal egyértelműen meghatározható. A vesedaganatok fő típusainak jellemző kromoszómális elváltozásait az 1. táblázatban foglaltuk össze. Tumor Jellemző kromoszómális változások Génmutáció VHL, Konvencionális veserák -3p, +5q -8p, -9p,-14q PBRM1 Papilláris veserák -Y, +7, +17, +8, +12, +16,+20,+1q MET Kromofób veserák -1, -2, -6, -10, -13, -17, -21, p53 Szarkomatózus veserák mint crcc, prcc, chrcc Kivezető csatorna karcinóma nem ismert nem ismert Vese oncocytoma -1, -14, t(11q13;?), random nem ismert MTSCC - 1, -4, -6, -9, -13, -14, -15, -18, -22 nem ismert Metanephrogen adenoma nincs nem ismert 1. Táblázat. A leggyakoribb vese tumorok genetikai jellemzői. Rövidítések: crcc: világossejtes veserák, prcc: papilláris veserák, chrcc: kromofób veserák. MTSCC: Mucinózus tubuláris és orsósejtes daganat 7

8 1.3. A papilláris vesetumor Elsőként az 1970-es években radiológusok, angiográfiás vizsgálatok alkalmával észlelték, hogy egyes vesedaganatokban gyér érhálózat rajzolódik, ezek a tumorok avaszkulárisnak mutatkoznak (Blath et al., 1976). A vizsgálatban 72 daganatos mintából 19-ben észleltek ilyen elváltozást, amik szövettani vizsgálata során döntően papilláris növekedésü adenocarcinomát írtak le. Később, nagyobb elemszámú minta elemzésénél 224 vesetumorból 34 papilláris daganatot találtak (Mancilla-Jimenez et al., 1976). Ezek sokkal kedvezőbb prognózisúak és általában kisebb méretűek voltak, ritkábban metasztatizáltak, vagy mutattak agresszív növekedést a vénák, vagy a vese környezetének irányába. A tumoros vesék daganattól távoli részein leírták a disztális nephron epitheliumának hyperplasztikus elváltozását és azt valószínűsítették, hogy azokból a sejtekből származhatnak a papilláris vesedaganatok. Ezek a tubuláris proliferációk más vesetumor környezetében is megtalálhatók, amiket a tumorok által produkált növekedési faktorok hatásának tulajdonítanak. A vesesejtes daganatok a frissen felismert húgyúti daganatos betegségek körülbelül 5%- át teszik ki, ez a harmadik leggyakoribb uro-onkológiai betegség (Siegel et al., 2018.). Világszerte a vesesejtes rák a kilencedik leggyakoribb tumoros megbetegedés, Európában 2012-ben új esetet fedeztek fel, a prevalencia a fejlett országokban a legmagasabb (Jonasch et al., 2014.). Magyarországon 2015-ben 2504 új vesedaganatos megbetegedést regisztráltak (Nemzeti rákregiszter, 2019). A papilláris vesetumor (beleértve az adenomát és karcinómát) az összes vesetumor 8-10%-át teszi ki. Átlag populációban a férfi: női incidencia arány 6:1-8:1 (Kovacs, 1993 a). Leggyakrabban (99%-ban) sporadikus, de kevesebb, mint 1%-ban családi előfordulású öröklődő esetek 8

9 is ismertek (Schmidt et al ). Habár klinikailag a papilláris veserákok a vese tumorok csupán 10%-át teszik ki, a boncolási anyagban ez a leggyakrabban előforduló tumor típus, illetve a papilláris veserákokhoz társuló mikroszkopikus papilláris léziók száma is jóval meghaladja ezt az arányt (Kovacs és Kovacs, 1993). Az 5 éves tumormentes túlélést 85-90%-ra becsülik (Amin et al. 1997, 2002). Megközelítőleg az esetek 7%-ában alakul ki nyirokcsomó metasztázis és 3-5%-ra tehető az igen malignus szarkomatózus és orsósejtes elváltozások aránya. (Amin et al. 2002, Cheville et al. 2003) A papilláris vesetumor szövettana A papilláris vesetumor papilláris, tubuláris, tubulo-papilláris de különösen kisebb tumorok esetén szolid növekedési formát mutat. A kis sejteknek halvány, szegényes citoplazmájuk van, a sejtmagok többnyire kerekek tömött kromatin szerkezettel (1. ábra A). Azonban más tumorokban a citoplazma szélesebb és eozinofil, a sejtmagok hasonlóak a kis sejtes változathoz (1. ábra B). Emellett előfordulnak jóval nagyobb kifejezetten eozinofil sejtekből felépült formák, amelyekben a sejtmagok változó nagyságúak és feltűnően nagy nukleolust mutatnak (1. ábra C). Természetesen, ez egy önkényesen vett meghatározás, mert a gyakorlatban a kis sejttől a nagy eozinofil sejtig az átmenet fokozatos. A különböző sejtformák sokszor ugyanabban a tumorban is előfordulnak (1. ábra D,E,F). A sejtek citoplazmája esetenként a világos sejtes (clear cell) konvencionális veserákra hasonlíthatnak (1. ábra G, H). 9

10 1. Ábra: A papilláris vesetumor változatos szövettani megjelenése. Különböző papilláris vese tumorok kis, közepes és nagysejtes megjelenéssel (A,B,C), kis világossejtes és közepes nagyságú bazofil sejtes papilláris vesetumor (D), kevert formájú kis-közepes (E) valamint közepes és nagy eozinofil sejtekből álló papilláris vesetumor (F), esetenként tisztén világos sejtes formák (G, H) is megfigyelhetők (Balint et al. 2009) 10

11 A papilláris vesetumor kromoszóma és DNS profilja A papilláris veserák jellemző kromoszómális és gén elváltozásokat mutat (2. ábra). A 7- es és a 17-es kromoszóma tri-, illetve tetraszómiája a tumor keletkezése során egy korai elváltozásnak tekinthető, ugyanis ezek az eltérések már igen kis, 2 mm átmérőjű papilláris léziókban is megjelennek. Azok a tumorok amelyek kariotípusában a 7-es és 17-es kromoszómák triszómiája az egyetlen kromoszóma-rendellenesség, a papilláris adenomának tarthatók. (Kovacs 1989; Kovacs et al. 1991; Kovacs 1993a, Fisher et al. 1998). Egyéb elváltozások társulása, mint például a 3q, 8-as, 12-es, 16-as és a 20-as kromoszóma triszómiája a karcinómába való progressziót jelezheti. (Kovacs 1993a, Szponar et al. 2009). A kromoszóma vizsgálatokkal a papilláris vesetumorokban többnyire csak egész kromoszómák vagy nagyobb, több kromoszómális sávot magába foglaló régiók duplikációját, hiányát, valamint kromoszómális átrendeződéseket lehetett felismerni. 11

12 2. Ábra: Reprezentatív kariogram egy papilláris vesetumor sejtből, amin a 7-es kromoszóma tetraszómiája, a 17-es kromoszóma triszómiája és az Y kromoszóma elvesztése látható. (Kovacs, 1989) A különböző DNS technikák kifejlesztése, mint a kromoszómális CGH (comparative genomic hybridisation) valamint a full tiling BAC array lehetővé tették az egész genom elváltozások egyszeri hibridizációval történő megállapítását (3. ábra). 3. Ábra: Egy papilláris veserák BAC-array vizsgálata. Ez a férfiből származó tumor a papilláris veserákra jellemző összes genomikus eltérést mutatja. A DNS mennyiségének megváltozása a 3-as, 7-es, 12-es, 16-os, 17-es valamint 20-as kromoszómák duplikációját jelzi. Az Y kromoszóma hiányzik a tumor genomból, az X kromoszómán pedig látható egy körülirt regio deléciója (csillag). (0.0 a normalis diploid DNS tartalomnak felel meg, míg a log2 ráció 0.3 a genomikus régiok duplikációját és a log2 ració -0.3 monoszómiának megfelelő DNS vesztést jelent). (Szponar et al., 2011.) 12

13 A kapott eredmények kromoszómára való lebontása lehetővé tett egy magas feloldású genom vizsgálatot. Ennek eredményeként pontosan meg lehetett határozni az egyes kromoszómális régiók részletes mennyiségi elváltozását, mint például DNS duplikációkat, vesztéseket és amplifikációkat. Egy példa a 4. ábrán látható. 4. Ábra: Magas feloldású BAC-array. A. A 7-es kromoszóma komplex genetikai eltérése különböző kromoszómális régiók duplikációjával valamint a hosszú karon látható körülírt DNA amplifikációjával. Ebben a két régióban kizárólag a MET tirozin kináz és a MEST gén lokalizált (az utóbbinak nincs szerepe a papilláris vesetumor kialakulásában). B. A 17-es kromoszóma hosszú karjának a tetraszómiának megfelelő DNS elváltozása valamint egy rövid DNS szakasz amplifikációja, amelyen kizárólag a HNF1B gén helyezkedik el. C. Az X kromoszóma q21.3 sávban egy rövid DNS szegment vesztése figyelhető meg, ahol a PCDH11 és a PABPC5 gének helyezkednek el. (Szponar et al., 2011.) Ezek a genomikus elváltozások a papilláris vesetumor kialakulásával összefüggő gének felismeréséhez vezettek, bár familiáris papilláris vesetumorhoz társuló MET gént még a hagyományos kromoszóma eltérések alapján azonosították. Itt két körülmény játszott közre. Egy familiáris előfordulású papilláris vesetumorban leírták a 7-es kromoszóma hosszú karjának részleges triszómiáját. Mivel abban az időben a humán genom szekvenálása gyermekcipőben járt, ebben a régióban csak néhány gén, közöttük a MET 13

14 gén volt ismert. Ezek szekvenálása a MET tirozin kináz domén mutációját mutatták és a mutáció szegregálódását a tumorok familiáris megjelenésével (Schmidt et al., 1997). Később számos vizsgálat megerősítette a MET mutáció és a papilláris veserák familiáris megjelenése közötti összefüggést (Fischer et al., 1998, Zhuang et al., 1998; Lubensky et al., 1999). Bár a mutáns MET allél duplikációját közel az összes öröklődő papilláris vesetumorban kimutatták, a sporadikus esetek mindössze 5-8%-ában találták meg a MET tirozin-kináz domén mutációját. (Schmidt et al., 1997; Fischer et al., 1998; Zhuang et al., 1998; Lubensky et al., 1999). Ez arra utalt, hogy a MET mutációja mellett a sporadikus papilláris vese tumorok legnagyobb részében csak kromoszóma/gén duplikáció (néhány esetben amplifikáció fordul elő) és így ennek lehet szerepe a sporadikus papilláris vese tumorok kialakulásában és progressziójában. Korábbi eredmények alapján a triszómiák jelentősége abban rejlik, hogy 7-es és 17-es kromoszómákon lévő mutáns vagy vad típusú (akkor még ismeretlen) gén(ek) megnövekedett kópiaszáma, az ehhez kapcsoló fokozott transzkripciója, valamint a kódolt fehérjék stabilitása játszik szerepet a papilláris vese tumorok kifejlődésében. (Kovacs, 1993 a,b). Az Y kromoszóma az egyetlen kromoszóma, amelynek nem a duplikációja hanem elvesztése jellemző a papilláris vesedaganatokra, (Kovacs et al., 1994). A magas feloldású array-cgh segítségével sikerült a feltételezett gén lókuszt az XY homológ régióhoz lokalizálni. Az Yp11.2-Xq21.31 homológ régióban a protokadherin PCDH11 és a homeobox gén TGIF2LY találhatok, amelyek közül elsősorban a PCDH11, egy adhéziós fehérjét kódoló gén jelentős a karcinogenezis szempontájból. A PCDH11 génnek két különböző, homológ formája (PCDH11X és PCDH11Y) ismert az X- és az 14

15 Y kromoszómának megfelelően (Yoshida et al., 1999). A PCDH11 által kódolt fehérjék a jelátviteli folyamatokban fontos szerepet játszanak, illetve a központi idegrendszer fejlődésében bizonyították jelentőségüket (Kim et al., 2011). Korábban in vitro körülmények között, apoptózis-rezisztens prosztatarák sejtvonalakban figyelték meg a PCDH11 gén fokozott expresszióját (Terry et al., 2006.). A további triszómiák közül eddig csak a 12-es kromoszóma eltérése mögött meghúzódó génelváltozás ismert, amelyet a tumorokban előforduló, körülírt génamplifikáció alapján azonosítottak (Looyenga et al., 2011). Az LRRK2 gén amplifikációját és fokozatos kifejeződését a MET tirozin kinázzal együtt a papilláris vese tumorok 67%-ában figyelték meg. A további kromoszómális triszómiákhoz társuló gének, amelyeknek szerepe lehet a papilláris vese tumorok progressziójában jelenleg még nem ismertek. Ritkán előforduló papilláris daganatokban, elsősorban azokban az esetekben, amikor fiatal betegben alakul ki a tumor, az Xp11.2 régió (TFE3 gén) érintettségével, állandó törésponttal az X kromoszóma egy részének transzlokációját figyelték meg az 1-es, a 10-es, vagy a 17-es kromoszómára. Az 1q21-es lókuszon a PRCC génhez való transzlokáció a leggyakoribb, de más génnel történő fúziót is leírtak már (Sidhar et al., 1996; Clark et al., 1997) A papilláris vese tumorok kromoszómális klonális fejlődése A daganatok klonális fejlődéséről szóló elméletet Peter Nowell fejtette ki 1976-ban (Nowell, 1976). E szerint minden tumor egyetlen sejtből indul ki, ami előnyös hatású szomatikus kromoszóma vagy gén mutáció következtében gyorsabban proliferál és képes a környezetében lokálisan meglévő immunreakció gátló hatását közömbösíteni. További DNS/gén változás egy része nem előnyös a tumor sejtek növekedésére, így 15

16 ezekből a sejtekből nem alakul ki tumor, tehát ezeket a genomikus variációkat nem tudjuk megfigyelni és megismerni. Amennyiben daganatos sejtpopuláció további proliferációjára előnyös eltérések azaz szubklónok jelennek meg a kezdeti tumor egyre gyorsabb osztódásra, egyre invazívabb növekedésre és végül metasztatikus hajlamra tesz szert. A papilláris vese tumorok genetikai klonális fejlődésére és az ehhez társuló átfedő szövettani változókra korábban tett megfigyelést Szponar és munkatársai ben az alábbi táblázat szerint foglalták össze (2. táblázat): 16

17 2. Táblázat. A papilláris vese tumorok a közös kromoszóma eltérések alapján három csoportra oszthatók. Az első csoportban a 7-es és 17-es kromoszómák duplikációja a tumorok 100%-ában megfigyelhető. Ezek a tumorok 100%-ban alacsony grádusú, G1 tumorok és csaknem kizárólag kis kék sejtekből épülnek fel. A második csoportba azok a tumorok tartoznak, amelyek további kromoszóma eltéréseket (+3, +8, +12, +16, +20) tartalmaztak. Ezek kis vagy közepes nagyságú, G1 és G2 grádusú tumorok. A harmadik csoportot azok a tumorok képezik, amelyekben az első két csoportban megtalálható kromoszóma eltérésekhez az 1-es kromoszóma hosszú karjának a duplikációja valamint a 6q, 9p és 14q kromoszómális régiók deléciója társul. Ezek a tumorok G2 vagy G3 grádust mutattak. A klinikai érdekessége ennek a megfigyelésnek, hogy az első csoportból egyetlen tumor sem progrediált és a második csoportból is csak egyetlen tumor, míg a harmadik csoporthoz tartozó tumorok közül 8 vezetett a betegek halálához. (Szponar et al., 2009). 17

18 Ennek a megfigyelésnek különös jelentősége van a mai WHO osztályozás tükrében, ahol a papilláris adenomát és karcinómát a tumorok mérete alapján különítik el, azaz papilláris tumorok 15mm alatt adenomának fölötte karcinómának kórisméznek. A 2. táblázatban megfigyelhető, hogy a három csoportba tartozó tumorok mérete között jelentős átfedés van: pl. egy 25 mm átmérőjű G1-es tumor az első és második csoportba is előfordulhat és egy 25 mm átmérőjű G2-es tumor a második és harmadik csoportban is. Ez a megfigyelés arra utal, hogy nem a tumor nagysága, hanem elsősorban a tumor genom és génexpresszió eltérései határozzák meg a papilláris vese tumorok biológiai viselkedését A papilláris vese tumorok megkülönböztető génexpressziós mintája A jellemző kromoszómális/dns elváltozások alapján egyértelműen ki lehet jelenteni, hogy a papilláris vesetumor egy önálló entitást képvisel. Nemcsak a DNS elváltozások kombinációja, de a kifejezett gének eloszlása is alátámasztja a papilláris vesetumor egyediségét. Egy Affymetrix GenChip vizsgálattal elvégzett globális gén expressziós analízis, amelynek alapját kromoszóma vizsgálattal egyértelműen diagnosztizált tumorokból izolált RNS képezte, a papilláris vesetumorokra (adenomák és karcinómák) jellemző, megkülönböztető génexpressziós mintát mutatott (5. Ábra). Az ilyen nagyszámú gén közül meglehetősen nehéz lenne a tumor kiindulásához kötött gének kiválasztása, de ez a vizsgálat is egyértelműen mutatja a papilláris vese tumorok egyediségét és különbözőségét más tumorokkal, mint a konvencionális és kromofób veserák és vese oncocytoma. 18

19 5. Ábra Vesedaganatok génexpresszós profilja microarray vizsgálattal. Az egymáshoz hasonló expressziós mintázattal rendelkező minták rövid szárakkal kapcsolódnak egymáshoz, a különbség növekedésével a szárak hossza is növekszik. Rövidítések: chrcc, kromofób veserák; RO, vese oncocytoma; crcc, konvencionális veserák; prcc, papilláris veserák; WT, Wilms' tumor; CCSK, világossejtes vese szarkóma; EK, embrionális vese; AK, felnőtt vese. (Kovacs G, személyes közlés) A papilláris vese tumorok eredetéről tartott eltérő vélemények A specifikus kromoszóma/dns/gén elváltozások alapján a papilláris vesetumor minden kétséget kizárólag egy önálló tumor entitás. A papilláris vesetumor eredetéről kétféle elképzelés van. A WHO és ISUP (International Society of Urological Pathologists) szerint a papilláris veserák, a konvencionális veserákhoz hasonlóan, a felnőttkori vese differenciálódott 19

20 tubulusainak hámsejtjeiből alakul ki és papilláris vese adenomát a tumor mérete alapján határolják el a papilláris karcinómától (Moch et al., 2016). A papilláris vese tumorok kapcsolatát a pre-neoplasztikus léziókkal, amely szerint a papilláris vesetumor a Wilmstumorhoz hasonlóan differenciálatlan, embrionális maradványokból indul ki, nem említik és elutasítják. A másik elképzelés szerint a papilláris vesetumor hisztológiailag pre-neoplasztikus lézió-adenóma-karcinóma szekvenciát mutat (Kovacs, 1993 a,b), ahol azonban az éles határ az adenoma és karcinóma között nem húzható meg, így a malignitás meghatározása differenciáldiagnosztikai nehézséget jelent (lásd 2. táblázat). A specifikus citogenetikai/dns elváltozások kimutatásán kívül nincs más olyan eszköz a kezünkben, amellyel az adenomát és karcinómát meg tudjuk különböztetni. Korábbi eredmények alapján a papilláris vesetumorokhoz társuló specifikus genomikus eltéréseknek, mint a kombinált 7-es és 17-es triszómiának és az Y kromoszóma vesztésének és az ehhez kapcsolódó gének expressziójának jelentős szerepe van a preneoplasztikus léziók és igy a papilláris vesetumor kialakulásában. A csírasejtes MET mutációhoz valamint a sporadikus papilláris tumorokhoz társuló nagyszámú prekurzor léziók is arra utalnak, hogy a papilláris vesetumor nem a differenciálódott tubuláris sejtekből, hanem embrionális maradványokból indul ki (Kovacs és Kovacs, 1993; Ornstein et. al., 2001; Bányai, Sarlós et al., 2018). 20

21 2. Célkitűzés A papilláris vesetumor eredetét a hivatalos osztályozások a felnőttkori vese differenciálódott tubulusainak hámsejtjeiben jelölik meg. Hipotézisünk szerint a papilláris vesetumor nem, vagy csak részben differenciálódott perzisztáló embrionális sejtcsoportokból indul ki, és ennek megfelelően egy preneoplasztikus lézió-adenóma-karcinóma fejlődési szekvenciát mutat. Korábbi eredmények azt mutatják, hogy a papilláris vese tumorok korai fejlődési szakaszában megjelenő, általános genomikus eltéréseknek (triszómia 7 és 17 és az Y kromoszóma vesztése) és a hozzájuk kapcsolódó gének időben és térben megváltozott expressziójának jelentős szerepe van az embrionális sejtek differenciálódási zavarában és így a pre-neoplasztikus léziók majd felnőtt korban a papilláris vesetumor kialakulásában. A csírasejtes MET mutációhoz valamint a sporadikus papilláris tumorokhoz társuló nagyszámú prekurzor léziók is arra utalnak, hogy a papilláris vesetumor nem a differenciálódott tubuláris sejtből, hanem embrionális restből indul ki. A munka célja az, hogy a papilláris veserákra jellemző kezdeti kromoszómális elváltozásokhoz kapcsolódó gének kifejeződését fötális vesékben, a papilláris vese tumorokhoz társuló, többnyire mikroszkópos méretű pre-neoplasztikus léziókban és nagyszámú papilláris vesetumort tartalmazó tissue microarray-n kimutassuk, és így a közös génexpressziók azonosításával alátámasszuk a papilláris vesetumor embrionális eredetét és igazoljuk a papilláris vesetumor megkülönböztető biológiai és klinikai viselkedését. 21

22 3. Vizsgálati anyagok és módszerek 3.1. Szövetminták Az RNS alapú vizsgálatokra a friss fötális veséket a Pécsi Tudományegyetem Nőgyógyászati Klinikáján gyűjtöttük, ezeket a feldolgozásig TRIzol-ban 80 C-on tároltuk. Hasonlóan a MET mutációhoz kötődő örökletes normál vese és vese tumor prekurzor lézió mintákat (HD1651) TRIzol-ban fagyasztva tároltuk. Az örökletes esetből származó tumor mintákat az RNS vizsgálatokhoz biztosított anyag biztosítása után 4%-os formaldehidben fixáltuk és rutin szövettani feldolgozásnak vetettük alá. A prekurzor léziók és papilláris vesetumor közötti összefüggés vizsgálatára 15 papilláris vesetumor valamint 15 konvencionális veserák miatt eltávolított vesét a tumor diagnózis biztosítása után teljes mértékben, több száz paraffin blokkban feldolgoztunk. Minden blokkból több hematoxilin eozin (HE) festett metszet készült, amelyekben mikroszkóp alatt prekurzor léziókat kerestünk. A papilláris vese tumorok vizsgálatára a Pécsi Egyetem Urológiai Klinikán 2000 január és 2014 december között radikális vagy parciális nephrectómián átesett betegek tumorai közül válogattuk ki a papilláris vesetumornak kórismézett eseteket. A paraffin blokkokat, és HE festett metszeteket a Pécsi Egyetem Patológiai Intézete bocsájtotta rendelkezésünkre. A szövetminták gyűjtését és feldolgozását a PTE ÁOK Etikai Bizottság engedélyének birtokában végeztük (Etikai engedély száma: 5343/2014). A szövettani diagnózis minden esetben uropatológus (K.Gy.) által felülvizsgálatra került a heidelbergi klasszifikációs rendszernek megfelelően (Kovacs et al., 1997). 22

23 3.2. A MET tirozin kináz domén mutáció analízise A MET tirozin kináz domén 16, 17, 18, és 19 exonját a korábban leírt módon amplifikáltuk (Fischer et al., 1998). A PCR termékeket IR800 és IR700 jelölt primerrel szekvenáltuk Thermosequenase Cycle Sequencing kit segítségével (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) a gyártó utasításai szerint. A jelölt PCR terméket mindkét irányból kettős lézer detektoros LICOR Long ReadIr 4200 szekvenáló géppel (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) a BaseImageIR software csomag segítségével vizsgáltuk A mutációk kimutatására összehasonlítottuk az így kapott szekvenciákat a vad típusú szekvenciával (J02958) A 19-es exon mutáció SSCP (Egyszálú DNS Konformációs Polimorfizmus) vizsgálata A genomikus AC MET szekvencia felhasználásával az exon 19 melletti régióhoz kapcsolódó primerokat készítettünk, amelynek segítségével egy olyan 198bp fragmentumot tudtunk amplifikálni, melynek középső része tartalmazta az A3954C mutációt. Kombináltuk a K2d (nt: ) cca cgg gta ata att ttg tcc intron primert a K1r (nt: ) cca cat ctg act tgg tgg tgg primerrel, ami az exon 19 3 végén található. A 20 µl PCR-reakció 100 ng DNS-t, 200 µm dntp-t, 1,5 mm MgCl 2 -t, mindegyik primerből 2 pmol-t (a K2d radioaktívan jelölt) és 0,5 ng Taqpolimerázt tartalmazott. 2 percig tartó kezdeti denaturálást hajtottunk végre 94 C-on, ezt 27 ciklus követte (30sec 94C-on, 30sec 55C-on és 40sec 72C-on). A végső fázis 5 percig tartott 72 C-on. Minden PCR-reakcióhoz 20 µl futtatópuffert, 2 µl 1M NaOH-t 23

24 és 2 µl 20 mm EDTA-t adtunk. A mintákat 2 percig 94 C-on denaturáltuk, majd 3 µl t 10%-os glicerolos MDE gélre töltöttük. Az elektroforézist 6 W-on állandó hőmérsékleten, éjszakán keresztül végeztük. Ezt követően a gélt megszárítottuk és egy éjszakán át röntgenfilmre exponáltuk A mutált és a vad típusú MET RT-PCR analízise Gyorsfagyasztott szövetmintákból, vagy sejtkultúrákból TRIzol (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) segítségével RNS-t izoláltunk a gyártó utasítása szerint. A cdns első szálának szintézisét 2µg teljes RNA mintából, Superscript II reverz transzkriptáz (Invitrogen) felhasználásával a gyártó protokollja alapján végeztük el. A valós idejű PCR reakciót a DNA Engine Opticon rendszerrel (MJ Research Inc., Watertown, USA), Platinum SYBRGreen qpcr SuperMix-UDG (Invitrogen) végeztük el, kontrolként ß aktint használtunk. Az összes reakciót kétszeresen hajtottuk végre, a végeredményeket a két reakció eredményeiből átlagolva kaptuk. A pontban felsorolt vizsgálatok a Heidelbergi Ruprecht-Karls Egyetem Molekuláris Onkológiai Laboratóriumában történtek tudományos együttműködés keretében Tissue microarray (TMA) készítése A TMA készítéséhez paraffinba ágyazott szövetmintákat használtunk fel. HE metszetek részletes kiértékelésével választottunk ki megfelelő mintavételi helyeket. A blokkokból Manual Tissue Arrayer (MTA1, Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, USA) eszközzel 24

25 0,6 mm átmérőjű szövethengereket vettünk ki. Papilláris vesetumorokat, és a festés ellenőrzéséhez fötális veseszövetet és felnőtt normál veseszövetet is felhasználtunk a tissue microarray (TMA) készítéséhez. Eltérő morfológiájú és grádusú részeket tartalmazó tumorokból több mintát vettünk. Az így kiválasztott mintákat egy kombinált paraffin blokkba helyeztük, így akár 150 különböző minta is vizsgálható egy mikroszkópos metszeten (6. ábra). 6. Ábra. Egy TMA ábrázolása, 150 tumor mintával Immunhisztokémia Az immunhisztológiai vizsgálatokra fötális és felnőttkori veséket, pre-neoplasztikus léziókat tartalmazó szövetmintákat és papilláris vesetumorokat tartalmazó TMA-t használtunk fel. A sorozatmetszetekben készült 4 µm vastagságú lemezeket alacsony forráspontú paraffinba mártottuk az epitóp megőrzésére. 25

26 A paraffinba mártott metszeteket xilollal deparaffináltuk, és leszálló etil-alkohol sorozatban rehidráltuk. Az antigén feltárást 10 mm nátrium-citrát pufferben (ph 6,0) történő forralással értük el, a 2100-Retriever (Pick-Cell Laboratories, Amszterdam, Hollandia) készülék segítségével. A nem specifikus kötőhelyek és az endogén peroxidáz aktivitás blokkolása normál ló szérummal kevert (1%) hidrogén peroxidban (0,3%) történt szobahőmérsékleten 10 percig. Ezután a metszeteket a primer antitesttel fedtük le, és nedves kamrában inkubáltuk egy éjszakán keresztül 4 C-on. A felhasznált antitestek jegyzékét a 3. táblázat tartalmazza. Harminc percig történő HRP konjugált anti-egér és anti nyúl másodlagos antitest (DAKO) alkalmazását követően az előhívás AEC (3-amino-9-etilkarbazol) szubsztrát segítségével történt, majd a metszeteket Mayer hematoxilinnel festettük. A kiértékelést Leica LaborluxS mikroszkóppal végeztük a fotókat Leitz DMRBE mikroszkópra helyezett ProgRes C14 kamerával készítettük. Antitest Eredet Termékkód Puffer ph Hígítás anti-hnf1b nyúl HPA citrát ph 6.0 1:200 anti-met nyúl SC-12 citrát ph 6.0 1:100 anti-krt17 nyúl PA citrát ph 6.0 1:200 anti-pcdh11y nyúl PA citrát ph 6.0 1:50 3. Táblázat. Immunhisztokémiai vizsgálatok során használt antitestek 26

27 4. Eredmények 4.1. A papilláris pre-neoplasztikus léziók gyakorisága és szövettana A különböző típusú veserákot tartalmazó vesék teljes feldolgozása során több száz metszetet néztünk át a feltételezett pre-neoplasztikus léziók felismerésére. Amint az előzetes megfigyelésekből várható volt, a papilláris vese tumort hordozó vesékben találtuk meg a legtöbb mikroszkópos méretű, néha 1-2 mm átmérőjű tubulo-papilláris léziókat. 15 papilláris vesetumort hordozó vesében átlagosan 42 léziót figyeltünk meg. Ezekben a kis kék sejtektől a magasabb hámmal borított papilláris struktúrákig minden átmenet megtalálható volt (7. ábra). Ez a fokozatos átmenet a kis sejttől a nagy sejtig utánozza az embrionális vesefejlődés differenciálódási fázisait, azaz tubuláris epithel kialakulását metanephrogén blasztémából. Egyes szubkapszuláris léziók regresszív változáson mentek keresztül, ami a stroma fibrózisát, az epitheliális sejtek regresszióját és elmeszedését jelentheti (7. ábra, F; 8. ábra, B). A konvencionális veserákot tartalmazó vesékben csak átlagosan 0.4 léziót figyeltünk meg, míg a vese onkocytómával átlagban 0.8 lézió társult. A kromofób veserák mellett egyetlen esetben sem találtunk tubulo-papilláris prekurzor léziót (4. táblázat). Tumor típusa PNL/vese Konvencionális veserák 0.4 Kromofób veserák 0.0 Vese onkocytóma 0.8 Sporadikus papilláris veserák Táblázat. Mikroszkopikus prekurzor léziók (PNL) száma tumoros vesében (*Ornstein et al. 2000) 27

28 7. Ábra. Különböző pre-neoplasztikus léziók szövettani képe. A: szubkapszuláris ciszta gyulladásos környezetben, a cisztát papillárisan növekvő kis sejtes proliferáló szövet tölti ki. B: Szintén szubkapszuláris lézió, papilláris szerkezettel és a papillák felszínét közepes magasságú világos eozinofil hámsejtek borítják. C: Kis éretlen hámsejtekkel borított papilláris PNL. D: Közepes magasságú részben világossejtes papilláris prekurzor lézió. E: Magas, több magsoros hámmal borított papilláris struktúra. F: A tubulárisan növekvő prekurzor lézió stromájában psammoma testecskék láthatók. 28

29 . 8. Ábra. A: Egy glomerulusnál alig nagyobb kis kék sejtes papilláris prekurzor lézió, amely intralobulárisan helyezkedik el. B: A vese tokja alatt elhelyezkedő, ék alakú, részben regresszív elváltozáson átment papilláris prekurzor lézió psammoma testekkel A papilláris vese tumorok szövettani heterogenitása A papilláris vese tumorok szövettani képe nagyfokú heterogenitást mutatott. A papilláris tumorok sok esetben hasonló szövettani képet mutattak (9. ábra A) mint az azonos vesében talált pre neoplasztikus léziók legnagyobb része (7. ábra C). Sok esetben azonban egyetlen tumoron belül is megfigyelhető volt a tumor sejtek növekedési formájának a heterogenitása. A jól differenciált, tisztán papilláris növekedésű tumor szabálytalan stromán ülő közepes grádusú sejteket mutatott, másik területen világossejtes papilláris növekedés valamint kromofób veserákra emlékeztető szerkezetek voltak felismerhetők (10. ábra). Időnként szabálytalan papilláris stromán ülő, magas eozinofil sejtekből álló tumort figyeltünk meg, amelyek sejtmagja a sejtek felszínén helyezkedett el. Ugyanez a tumor más területeken többmagsoros hámmal borított papillákat és cisztikus struktúrákat mutatott (11. ábra). Egy esetben a 29

30 többmagsoros magas, bazofil sejtes primer tumor nyirokcsomó áttétében kissejtes forma fordult elő (12. ábra). A papilláris vese tumor, amennyiben jól differenciált kis sejtekből áll, az évek során nagyobb méretet is elérhet és vastag falú cisztaként kórismézhető. Azonban évek után szarkomatózus átalakulás mehet végbe, amely a gyors lefolyású és a beteg halálát okozza (13. ábra). Az ábrákon bemutatott példák diagnózisát minden esetben kromoszóma vizsgálat vagy array-cgh segítségével biztosítottuk. 30

31 9. Ábra. Kromoszóma vizsgálattal igazolt papilláris vesetumor (HA106) változatos szövettani képe. A, a tumor legnagyobb részében kis sejtes tubuláris-papilláris szövettani kép látható. Más területeken a sejtek közepes nagyságúak hasonlo növekedés forma megtartásával. C, ismét més területen kifejezett papilláris növekedés immunsejtekkel infiltrált papilláris stromával és többsoros eosinofil sejttel figyelhető meg. D, teljesen szokatlan szövettani kép, amelyben a tumor strómája mucinózus átalakulást mutat. 31

32 10. Ábra. Genetikai vizsgálattal egyértelműen diagnosztizált papilláris vesetumor (HA516) szövettani képe. A, typusos papilláris növekedés közepes nagyságú eosinofil sejtekke. B, papilláris stróma többmagsoros tumorsejtekkel borított, amelyek közepes foku sejtmag polymorfiát mutatnak. C, kis sejtes papilláris tumorra emlékeztet felépítésű tumor részlet clear cell, azaz világos citoplazmájú sejtekkel. D, Az alig felismerhető papilláris struktúra mellet feltűnően nagy retikuláris citoplazmájú, kromofób sejtekre emlékeztető sejtek. 32

33 11. Ábra. Kromoszóma vizsgálattal igazolt papilláris veserák (HD 503). A, a primér tumor alig felismerhető papilláris struktúrát mutat széles citoplazmájú nagy tumorsejtekkel és közepes fokú sejtmagpolymorfiával. B, a tumor retroperitonialis nyirokcsomó áttéte többmagsoros epitéllel borított papilláris strómával. 12. Ábra. Genetikai vizsgálattal igazolt metasztatikus papilláris veserák (HA394). A primer tumor papilláris szerkezetű, a fibrotikus papillákat többmagsoros közepes nagyságú tumorsejtek borítják. B, a tumor nyirokcsomó áttétében kissejtes papilláris tumor ismerhető fel. 33

34 13. Ábra. 16 cm átmérőjű több évtizede ismert vese ciszta (HA454). A, Az eltávolított cysta falában kromoszóma vizsgálattal egyértelműen igazolt kis sejtes typikus papilláris vesetumor volt felismerhető. A cystát nekrotikus, részben elfolyósodott anyag töltötte ki. B, más területek a szarkómásan átalakult G3 tumor áttörte a vastag fibrotikus ciszta falát és infiltrálta a környezetét A kromoszóma 7 duplikációja és a MET alterációja familiáris vesetumorban A MET tirozin kináz receptor szerepének igazolására módunkban állt egy csírasejtes MET mutációt hordozó 37 éves férfi multiplex tumorának vizsgálatát elvégezni. A MET szekvenálása során egy kontroll, vad típusú vese mintához (1562n) képest a betegnél mind a normális veseszövetben (1561n) és tumorokban (1561a-i) egy A-C mutációt találtunk (14. ábra A). Mutáció specifikus primerek segítségével kimutattuk, hogy a beteg nem tumoros vesesejtjeiben és a tumorokban a vad típusú és mutációt hordozó allél is kifejeződött. (14. ábra B). SSCP vizsgálat egyértelműen megmutatta, hogy minden egyes tumorban a mutációt hordozó allél duplikálódott (14. ábra, C) 34

35 14. Ábra. MET vizsgálata öröklődő papilláris veserákban. (A) A beteg nem-tumoros vesesejtjeiben (1561n) valamint a tumor sejtekben (1561a) a szekvenálás A-C bázispár változást fedezett fel (csillag), míg a normális kontroll vesében (1562n) a vad típusú génszekvencia fordult elő. (B) A normál kontroll (1562n) csak a vad típusú MET szekvenciát, a beteg vesesejtjei (1561n) és minden egyes tumora (1561a-i) a vad és mutált MET szekvenciát is kifejezte. (C) A mutációt hordozó 19-es exon SSCP vizsgálat a kontroll vesében (1562n) csak a vad típusra jellemző szignált adta, míg a beteg vesében (1651n) és a tumorokban (1561a-i) a vad és mutált allél is megfigyelhető, ahol a mutált allél a duplikációnak megfelelően erősebb szignált adott (Bányai, Sarlós et al. 2018) 4.4. A MET kifejeződése fötális vesében, pre-neoplasztikus lézióban és papilláris vese tumorban Immunhisztokémiai vizsgálattal MET expressziót láttunk a fötális vesében az ureterbimbóban, a cap metanephrikus mesenchymában (CMM), a kialakuló vese vezikulában (comma shape body, CB) valamint az S-forma disztális kompartmentjében (15. ábra A). Ezt a kifejezett expressziót megtartották csírasejtes MET-mutációhoz társuló papilláris prekurzor léziók csak úgy, mint azok, amelyeket sporadikus papilláris veserák kapcsán figyeltünk meg (15. ábra B, C; 16. ábra A, B). Felnőttkori vesében csak a disztális vese csatornákban fordult elő MET immun-reakció. A vizsgálat során 76 papilláris vese tumor közül közepes intenzitású MET expressziót találtunk 43 esetben (56,6%, 16. ábra C,D). 35

36 15. Ábra. MET immunhisztokémia A, Az ureterbimbó (UB), a cap metanefrikus mezenchyma (CMM), comma shape body (CB), és az S forma disztális részének sejtjeinek MET festődése; B és C, sporadikus és herediter esetekből származó prekurzor léziók kifejezett MET jelölődése. (Bányai, Sarlós et al ) 36

37 16. Ábra. A MET pozitivitás pre-neoplasztikus léziókban és papilláris vesetumorban. A és B: Preneoplasztikus léziók, amelyek a széli részeken a normális vese szövetet infiltrálni látszanak. Valójában ezek a léziók a korai embryonális fejlődés során jöttek létre és együtt nőttek a vesével. Ezek nem tarthatók adenomának, mert nincs a veseszövetben a növekedésükre utaló kompresszió. C: egy papilláris vesetumor kifejezett habos sejtes infiltrációval (nyíl). D: Diffuz MET pozitivitást mutató papilláris vese tumor A 17-es kromoszóma duplikációjához és amplifikációjához társuló HNF1B kifejeződése fötális vesében, prekurzor lézióban és tumorban Figyelembe véve a 17-es kromoszóma duplikációját, megvizsgáltuk a HNF1B (TCF2) transzkripciós factor kifejeződését ugyanezen szöveti anyagon. Fötális vesében az ureter bimbó végén valamint a komma- és S-forma disztális kompartmentjében, valamint a 37

38 differenciálódó disztális tubulusokban volt erős immun-reakció, míg a proximális tubulusok és Henle kacs sejtjei csak gyenge sejtmag pozitivitást mutattak (17. ábra A). Mind a MET mutációhoz társuló mind a sporadikus esetekből származó PPL erőteljes sejtmag pozitivitást mutatott a HNF1B antitesttel (17. ábra B, C). A felnőttkori vesében a proximális és disztális tubulusokban figyeltünk meg gyenge sejtmag pozitivitást. A papilláris vese tumorok 75%-a (n=57) mutatott pozitív sejtmag festődést a HNF1B antitesttel. Pozitív reakció volt megfigyelhető mind a szolid és papillárisan növekvő tumorokban is (18. ábra). A pozitivitás sokkal erősebb volt a papilláris vese tumorok perifériás, ú.n. növekedési zónájában, és sok esetben a tumor közepén csak elvétve lehetett egy-egy tumorsejtben magfestést látni (19. ábra B, D). A MET és a HNF1B gén ko-expressziója 76-ból 32 esetben (42,1%) volt megfigyelhető. A MET és HNF1B szerepére a papilláris vese tumorok kialakulásának korai szakaszára utal az a megfigyelés, hogy míg a prekurzor léziókban mindkét gén kifejezett expressziója volt megfigyelhető, addig a tumorok centrális részein az immunpozitivitás általában gyengébb volt, mint a tumor széli részén, az ú.n. proliferációs zónában (19. ábra). 17. Ábra. HNF1B Immunhisztokémia: A, fötális vesében az S forma disztális kompartmentjének (SB), és a disztális tubulusoknak (DT) erős, míg az ureterbimbónak (UB), és a proximális tubulusoknak (PT) gyengébb festődése látható. B, és C, erős magfestődés papilláris prekurzor léziókban, öröklődő (B) és sporadikus (C) esetekben. (Bányai, Sarlós et al., 2018) 38

39 18. Ábra. HNF1B pozitivitás két papilláris vese tumorban. A: a szolid növekedésű kissejtes tumorban a sejtmagoknak a fele mutatott közepes intenzitású immunreakciót. B: papillárisan növő tumor sejtjeinek legnagyobb része mag pozitivitást mutatott, a stromális sejtek negatívok voltak. 19. Ábra. A MET és HNF1B ko-expressziója két papilláris vese tumorban. A: enyhe MET pozitivitás a tumor széli részén erősebb festődéssel a növekedési zónában. B. Hasonló eloszlású HNF1B festődés ugyanabban a tumorban. C: MET pozitivitás egy papilláris tumor szeli részén. D: azonos tumor területeken a sejtek kb. 50%-a mutat HNF1B magfestést. 39

40 4.6. A 17-es kromoszóma duplikációjához társuló KRT17 kifejeződése normál vesében, prekurzor lézióban és papilláris vesetumorban A KRT17 elsőként a fötális vesében az ureterbimbóban és a gyűjtőcsatornában jelenik meg. Az ureterbimbó végénél az S-alakú test disztális részéhez csatlakozva láttunk gyenge festődést, de a jel a medulláris gyűjtőcsatorna mentén a vesepapilla irányába erősödik (20. ábra A). A gyűjtőcsatorna és az ureterbimbó sejtjeinek mindegyike festődik, ami megfelel a fötális sejtek proliferációs állapotának (20. ábra B). A felnőtt vesében, az összekötő csatornában membrán-attenuált és szelektív (a sejtek többsége, de nem minden sejt) festődést mutat (20. ábra C). A medulláris gyűjtőcsatornák sejtjeinek többsége hasonló szelektív festődést mutat (20. ábra D). A KRT17 pozitív sejtek vélhetően a principális sejtek az összekötő csatornákban és gyűjtőcsatornákban. A KRT17 expresszióját papilláris vesetumorokban egy 151 daganatos mintát tartalmazó TMA segítségével vizsgáltuk. Ezen kívül 17 sporadikus papilláris vesetumor mellett jelentkező papilláris prekurzor léziót vizsgáltunk, ezek között 8 olyat, ahol a betegnél ismert volt germ line MET mutáció. A KRT17 mind a 17 vizsgált 1-3mm-es papilláris lézióban kifejeződött (20. ábra E, F). A 151 vizsgált papilláris vesetumor közül 116 esetben diffúz citoplazmatikus festődést észleltünk, ami a membrán alatti részeken kifejezettebb volt (20. ábra G, I). Több daganatban a KRT17 erős kondenzációját figyeltük meg a sejtek apikális felszínén, néhol erős membrán pozitivitással. A papilláris vese tumorok összesen 76,8%-a (n=116) bizonyult pozitívnak KRT17 immunhosztokémia során, függetlenül a sejtek méretétől, amit I-es típusú, II-es típusú és kevert típusúként is klasszifikálnak. 40

41 20. Ábra. Reprezentatív metszetek KRT17 immunhisztokémiával felnőtt vesében, papilláris prekurzor léziókban és papilláris vesetumorban. A, gyenge KRT17 pozitivitás az ureterbimbó hegyén kapcsolódva az S-forma disztális részéhez fötális vesében. B, erős KRT17 jelölődés a fötális vese gyűjtőcsatornájának minden sejtjében. C, KRT17 pozitivitás a felnőtt vese összekötő csatornájának sejtjeinek többségében (principális sejtek). D, principális sejtek festődése a medulláris gyűjtőcsatornában. E, pozitív KRT17 jelölődés papilláris pre-neoplasztikus lézióban. G-I, KRT17 pozitivitás papilláris vesetumorban kis-, közepes-, és nagy sejtes tumorokban. 41

42 4.7. Az X és Y kromoszóma elváltozása papilláris vese tumorokban Az Y kromoszóma vesztése familiáris papilláris vesetumorokban Az Y kromoszóma vesztését papilláris vesetumorokban már korábban kimutatták mind kromoszóma, Southern-blot és BAC-array vizsgálatokkal (Kovacs et al., 1994; Szponar et al., 2011). A fentebb tárgyalt familiáris papilláris tumor miatt vizsgált egyénnél, a multiplex tumorok és pre-neoplasztikus léziók részletes genomikus vizsgálata során mind a kilenc lézióban előfordult a 7-es és 17-es kromoszómák duplikációjára utaló DNS elváltozás (21. ábra). Ezenkívül egy tumorban a 10-es kromoszóma és két további tumorban a 12-es kromoszóma duplikációja fordult elő. Ezek az eredmények egyértelműen igazolják a papilláris vese tumor diagnózisát. A tézisben tárgyalt, a papilláris vesetumorokban először megjelenő, alapvető genetikai elváltozások szempontjából fontos megfigyelni az Y kromoszóma hiányát. Az 1561 jelzésű esetben a magas feloldású oligo-array-cgh az A, B, C, E, F és I tumorokban az Y kromoszóma vesztését dokumentálja. 42

43 21. Ábra. Az array-cgh eredménye a csírasejtes MET mutációt mutató a tumorokban. A 7-es és 17-es valamint 10-es és 12-es kromoszómák eltérése (dupla vonalak) mellett az Y kromoszóma vesztése figyelhető meg (csillag) A PCDH11XY gén kifejeződése fötális vesében, pre-neoplasztikus léziókban és papilláris vesetumorokban Korábban az Yp11.2 régióhoz lokalizált legkisebb genomikus régióban két gén, a PCDH11Y és a homeobox gén TGIF2LY található, amelyek közül karcinogenezis szempontjából elsősorban a PCDH11Y-nak lehet jelentősége. A PCDH11Y az X kromoszómán előforduló homológ PCDH11X génhez képest egy 13 bázis pár (bp) deléciót mutat, ami megváltozott peptid szignált eredményez. Ezt a 13 bp különbséget fel lehet használni az X és Y specifikus PCDH11 szekvenciák kimutatására PCR reakcióval (22. ábra). 43

44 22. Ábra. A familiáris MET mutációhoz kötött papilláris vese tumorok vizsgálata során egyértelműen látható az Y specifikus 134 bp nagyságú PCR produkt hiánya az 1561B, C, E, F, és I tumorokban, míg a normális vese sejtekben (1561N) mind a 147 bp (X kromoszóma) és a 134 bp (Y kromoszóma) is megfigyelhető. Mind a PCDH11Y és PCDH11X génnek számos izoformája ismert. Az Y kromoszóma hiánya mellett az X kromoszómán elhelyezkedő PCDH11X gén 4-es izoforma kifejeződésének hiányát találtuk papilláris vesetumorokban, míg ez az izoforma az egészséges veseszövet mellett a placentában, fötális agyban, és hereszövetben magas fokon kifejeződött (23. ábra). Az 1-es, 2-es és 3-as izoformák a legtöbb papilláris vese tumorban is pozitív reakciót adnak. 23. Ábra. PCDH11X 4-es izoforma kifejeződése PCR vizsgálat során fötális agyban, herében és placentában, valamint ennek a hiánya látható reprezentatív tumoros mintákban (454T, 455T, 456T, 503T). 44

45 Immunhisztokémiai vizsgálattal a fötális vese kéregállományában jelentős PCDH11XY kifejeződést találtunk. A PCDH11XY protein az elágazódó ureterbimbó sejtek felszínén a kéregállomány aktív differenciálódási régiójában figyelhető meg, de a már differenciálódott kivezető csatornák sejtjeiben hiányzik a PCDH11XY protein (24. ábra A). Feltűnő az ureterbimbó körül tömörült blasztémális sejteknek, azaz a CMM sejteknek a citoplazmájában látható PCDH11XY pozitivitása, ami a renális vezikula (az S-forma előalakja) kialakulása, azaz a mesenchyma-epithelium-transzformáció után már nagyrészt a sejtek felszínén jelenik meg. Az S-formában, különösen a disztális kompartmentben a PCDH11XY protein szintén többségében a sejtek felszínén található meg (24. ábra B). A PCDH11XY kifejlődő tubuláris rendszerben elsősorban a lenyúló Henle kacs és disztális tubulus kezdeményekben fejeződik ki, a proximális tubulus kezdemények csak gyenge pozitivitást mutatnak (24. ábra C). A felszálló Henle kacs és a disztális tubulusok pozitív festődése következtében a macula densa sejtjei is pozitív reakciót adnak (24. ábra D). A munkába bevont összes preneoplasztikus lézió és papilláris vesetumor a PCDH11XY immunhisztokémiával negatív reakciót mutatott (25. ábra). 45

46 24. Ábra. PCDH11Y immunhisztokémia. A, az elágazódó ureterbimbó (UB) és a köré csoportosult mesenchymális sejtek (cap metanephrikus mesenchyma, CMM) A kép bal oldalán egy comma shape body (CB), látható míg a jobb oldalán egy nefrogén vezikula (RV). B, hasonló jellegű képletek egy későbbi fejlődési stádiumból, amikor kialakul az S-forma, aminek megnyulásából a proximalis tubulusok, a Henle kacs és a distális tubulusok alakulnak ki. C, az S-formák fokozatosan megnyúlnak, kialakítva a proximális kanyarulatos csatornákat, a Henle-kacsokat és a disztális kanyarulatos csatornákat. D, egy glomerulus képe, amiből a proximális tubulus kiindulása látható (PT) valamint a macula densa/juxtaglomeruláris apparátus (JGA). 46

47 25. Ábra. PCDH11XY immunhisztokémia. Mind a kis sejtes korai stádiumban lévő papilláris vesetumorban (A) mind a többmagsoros hámmal borított papilláris veserákban (B) negatív eredményt kaptunk. 5. Megbeszélés 5.1. Papilláris vesetumor eredete Mintegy 25 évvel ezelőtt javaslat született a papilláris vese tumorok embrionális maradványokból való kiindulására (Kovacs és Kovacs, 1993; Kovacs 1993a,b). Korábban közölték, hogy a csírasejtes MET mutációhoz társuló familiáris papilláris veserákhoz akár több ezer mikroszkópos méretű papilláris prekurzor lézió társul (Ornstein et al., 2000). Mi kimutattuk, hogy a sporadikus papilláris vese tumorok mellett is vesénként átlagban 42 hasonló prekurzor lézió fordul elő (Bányai, Sarlós et al., 2018). Ennek a jelentőségét alátámasztja az a tény, hogy a konvencionális veserákot tartalmazó vesékben átlagosan csak 0.4 hasonló jellegű PNL fordul elő (Bányai, Sarlós et al., 2018). A differenciálatlan epitheliális sejtekből álló prekurzor léziók morfológiája sok esetben hasonlít a Wilms tumorhoz társuló nephrogén maradványok (NR) 47

48 szövettani képére. A papilláris vese tumorhoz társuló léziók eloszlása hasonló a perilobuláris NR-hez. A papilláris veserákot tartalmazó vesékben elsősorban a perilobuláris léziók dominálnak. Ezzel kapcsolatban érdemes megemlíteni, hogy mind a szövettani megfigyelések, gén expressziós és genetikai vizsgálatok alapján a Wilms tumorhoz társuló perilobuláris NR és interlobuláris NR szöveti formája meghatározza a belőlük kiinduló WT morfológiáját (Beckwith et al., 1990; Fukuzawa et al., 2008). Eredményeink alapján úgy véljük, hogy bizonyítottnak tekinthető a papilláris vese tumorok keletkezése és az embrionális szöveti differenciálódásának zavara közti összefüggés. Korábbi eredmények alapján már az 1-2 mm nagyságú papilláris preneoplasztikus léziókban minden esetben megtalálható 7-es és 17-es együttes triszómiája (Kovacs, 1989). A túlnyomóan férfiakban kiinduló papilláris vese tumorok 85%-ában a 7-es és 17-es kromoszómák triszómiájához az Y kromoszóma vesztése járul (Kovacs et al., 1994). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a két kromoszómának és a rajtuk elhelyezkedő gének elváltozásainak valamint az Y kromoszóma vesztésének a tumor kialakulásának korai fázisában van szerepe. A részletes szövettani vizsgálatok eredménye, és a papilláris vesetumorokhoz társuló pre-neoplasztikus léziók magas száma a két elváltozás közötti szoros összefüggésre utal. Továbbá nem hanyagolható el a pre-neoplasztikus léziók és a klinikailag észlelt tumorok hasonló citológiai megjelenése. A vizsgálatok során tett fontos megfigyelés volt, hogy a tumorokhoz társuló pre-neoplasztikus léziók minden esetben a tumorral azonos immunreakciót mutattak. A MET, HNF1B és KRT17 immunhisztológia mind a papilláris vesetumorban és a hozzá kapcsolódó pre-neoplasztikus lézióban pozitív volt. 48

49 Az irodalomban korábban leirt ú.n. kortikális adenomák tulajdonképpen a prekurzor léziók már makroszkóposan is észlelhető formájának felel meg. Keyes (1890) több, mint 100 éve utalt ezen léziók gyakoriságára we do not regard it as extremely rare, since, owing the small size and inoffensive character of the growths, they are liable to be passed over without notice. Cristol és mtsai (1946) 22 veserák miatt eltávolított vese részletes vizsgálatával 37 papilláris szerkezetű adenomát figyeltek meg. Apitz (1944) több mint 4000 boncolásból 725 makroszkóposan észlelhető adenomát irt le. Mivel a papilláris veserák előfordulása férfiakban 5-10-szer gyakoribb, mint nőkben, és a férfiak és nők aránya Cristol és Apitz vizsgálatában 10:1 illetve 4.2:1 volt, feltételezhetjük, hogy mindkét szériában az adenomák papilláris vesetumorhoz társultak. Ezek az adatok megerősítik a prekurzor léziók és tumorok közti kapcsolatot, azt a feltevésünket, hogy a papilláris vesetumor embrionális eredetű prekurzor léziókból indul ki. Mindezek ellenére, a nemzetközi irodalomban a papilláris vese tumorok és társuló pre-neoplasztikus léziók szoros kapcsolatát figyelmen kívül hagyják és a papilláris vesetumor eredetét a vese differenciált tubulus sejtjeiben jelölik meg (Moch et al., 2016). 49

50 5.2. A 7-es kromoszóma duplikációja/amplifikációja valamint a MET gén expressziója a papilláris vesetumor kialakulásában A MET proto-onkogén a 7q31.2 lókuszon helyezkedik el. Terméke (cmet, hepatocyte growth factor receptor, HGFR), egy transzmembrán fehérje, ami növekedési faktor receptorként működik és tirozin kináz aktivitással rendelkezik. Ligandja a HGF (hepatocyte growth factor). Főbb hatását a Ras, PI3K és a STAT jelátviteli utak segítségével fejti ki. A MET szekvenálása vezetett a csirasejtes mutáció és a familiáris papilláris vese tumor közötti összefüggés felismerésére (Bentz et al. 1996; Schmidt et al., 1997). Mind a familiáris mind a sporadikus papilláris vesetumorokban alapvető elváltozás a MET gén kópia számának változása és fokozott kifejeződése. A MET csírasejtes mutációja prekurzor léziók ezreinek, és papilláris vesetumoroknak a keletkezésével jár, amely fiatal korban, éves hordozókban jelentkezik (Ornstein et al., 2000, Schmidt et al., 1997, Fischer et al. 1998). A vizsgálatainkba bevont csírasejtes MET mutációt hordozó egyén 37 éves korában került mütétre multiplex kétoldali vese folyamat miatt. A klinikailag észlelt tumorok mellett számos mikroszkópos nagyságú papilláris léziókat találtunk. A papilláris vese tumorokat hordozó vesék részletes szövettani vizsgálatával átlagosan 42 prekurzor léziót azonosítottunk, míg a konvencionális veserák mellett vesénként átlagban 0.4 hasonló elváltozás fordult elő. HGF/MET szignál átvitel a különböző sejtekre különböző biológiai hatással rendelkezik. A legtöbb sejtre motogén, mitogén és morfogén hatással van, így szerepe van a vese tubulusok kialakulásában és elágazódásában, más szervekben a mirigystruktúrák kifejlődésében, egyes szervek, mint a máj, vese, és a tüdő regenerációjában. Jelentős szerepe van a blasztémális sejtek mesenchymális epitheliális tranzíciójában valamint más szervekben az epitheliális- 50

51 mesenchymális kapcsolatok kialakulásában és a citoszkeleton reorganizációjában (Montesano et al., 1991). Jelentős feladata van az embriogenezis szabályozásában, ugyanis indukálja a blastémális sejtszaporulatot az ureter bimbók felett. Hatására lefűződnek a vesiculák, melyekből később a tubulusok alakulnak ki. A MET a disztális, illetve mediális (összekötő szakasz a disztális és proximális csatornák között) részben, továbba a gyűjtőcsatornákban fejeződik ki. A normál felnőtt vese disztális kanyarulatos csatornáiban, a gyűjtőcsatornákban és a Henle-kacs vastag felszálló szegmentumában is mutat némi pozitivitást. A HGF-nak az angiogenezis és a metasztázis képződés folyamatában van szerepe. A két gén meghatározott időben és térben való kifejeződése, a fehérje molekulák szöveti gradiense fontos feltétele a normál vesefejlődésnek Amennyiben ebben bármilyen eltérés következik be, lehetőség lesz a vese fejlődésének zavarára, és precancerosus elváltozások megejelnésére. A fenti adatok arra utalnak, hogy a 7-es kromoszómán lokalizált MET lókusz duplikációjához, amplifikációjához társuló fokozott gén expressziónak valószínűleg fontos szerepe van az embrionális vese differenciálódási zavarában és a papilláris prekurzor léziók kialakulásában. A papilláris vesetumorokhoz hasonlóan a MET működésének zavarát a Wilms tumor kialakulásával is összefüggésbe hozták. A nephrogén restek 22%-ában és a belőlük kialakuló Wilms tumorok 54%-ában a MET expresszió növekedését észlelték (Vuononvirta et al., 2009). A HGF génje szintén a 7. kromoszómán található (7q21.11). Eddig nem mutatták ki HGF lokusz amplifikációját, így valószínűleg a papilláris vesetumorban, a 7. kromoszóma számbeli növekedésével csak egy extra HGF gén kópia fordul elő. Viszont a MET vad typusú allél amplifikációja sporádikus tumorokban felveti annak a lehetőségét, hogy a nagy sejtfelszíni denzitása miatt a MET receptor kináz a HGF interakciója nélkül is autofoszforilálódik és aktíválódik (Fischer et al., 1998; Zhuang et al., 1998; Glukhova et al., 2000). Immunhisztokémiával MET pozitivitás igazolódott a 51

52 prekurzor léziókban és a tumorokban egyaránt (16. ábra). Kifejezett expresszió mutatkozott a periférián, a tubuláris-papilláris struktúrák és a normál vesesejtek határán A 17-es kromoszóma duplikációja és a HNF1B (TCF2) transzkripciós faktor a papilláris vese tumorok kialakulásában A HNF1B (TCF2) gén a 17-es kromoszóma hosszú karján a q12 regióban egy bázispárnak megfelelő DNS szegmentben helyezkedik el. Ennek a körülírt DNS régiónak a papilláris vesetumorban felfedezett amplifikációja vezetett a gén felismeréséhez (Szponar et al., 2011). A rövid DNS szakasz amplifikációján kívül korábban a 17-es kromoszóma hosszú karjának körülírt duplikációját is leírták (Bentz et al., 1996; Glukhova et al., 1998). Ezek az adatok a 17-es kromoszóma körülírt régiójának és az itt elhelyezkedő HNF1B expressziójának a papilláris vesetumor kialakulásában játszott szerepére utalnak. A HNF1B vese fejlődése során az ureterbimbó elágazódásában, a nephronok kialakulásának iniciálásában fontos szerepet játszik (Massa et al., 2013). A HNF1B felnőttekben kizárólag a polarizált epitheliális sejtekben fejeződik ki (Fisher és Pontoglio, 2008). A vese tubuláris rendszer, a nefron a mesodermális blasztémából fejlődik ki és az ureter bimbó hatására alakul ki a tubuláris sejtek polarizációja. A HNF1B inaktiválása vagy a HNF1B domináns negatív formájának fokozott kifejeződése a vese tubulusok cisztikus kialakulásához vezet (Gresh et al., 2004; Hiesberger et al., 2004). A HNF1B funkciójának kiesése a vese és a húgyútrendszer komoly kongenitális fejlődési rendellenességet okozhatja (Nakayama et al., 2010). A HNF1B megváltozott expressziója vagy mutációja a korai vesefejlődés során csökkent tubulogenesishez vezethet, de amennyiben ez a vese tubulusok kialakulása után következik be, akkor a vese cisztikus elváltozását okozhatja (Fisher és 52

53 Pontoglio, 2008; Dudzial et al., 2008; Ma et al., 2007). Vizsgálataink szerint a HNF1B először az epitelizáció során a renális vezikulában és az S forma disztális kompartmentjében valamint a disztális tubulusokban mutat erőteljes kifejeződést, míg az urterbimbó és a proximális tubulusok csak enyhe reakciót adnak a HNF1B antitesttel. A Wilms tumorhoz társuló nefrogén maradványok részben blasztémális sejtekből, részben primitív epitheliális sejtekből épülnek fel. A HNF1B kizárólag az epitheliális sejtekben mutatott pozitív reakciót, amely ismételten alátámasztja a HNF1B szerepét a blasztémális sejtek epithelizációjában (Szponar et al., 2011). A prekurzor léziók a mesenchyma epitheliális tranzíción átment polarizált embrionális képletekből indulnak ki. Vizsgálataink során a csirasejtes MET mutációhoz valamint a sporadikus papilláris vesetumorokhoz társult epitheliális prekurzor léziókban kifejezett HNF1B pozitivitást találtunk. A HNF1B szerepét a vese tubulusok normális kifejlődésében alátámasztja az a megfigyelés is, hogy a mucinózus, tubuláris, orsósejtes karcinómához társult tubulo-papilláris prekurzor léziók, hasonlóan a papilláris vesetumorhoz kapcsolódó léziókkal, kifejezett HNF1B pozitivitást mutattak (Szponar et al., 2011) A 17-es kromoszóma duplikációja és a KRT17 expressziója a preneoplasztikus léziókban és papilláris vesetumorokban A keratinok intermedier filamentumok, amik a sejt integritásában és stabilitásában kulcsfontosságú szerepet játszanak. A keratinok expressziója szövet típustól és differenciációtól függően eltérő lehet (Moll et al., 2008). Különböző típusú keratinok fejeződnek ki más-más epitheliumokon és ezek a mintázatok a karcinogenezis során is többnyire megmaradnak. A KRT 17 egy kda súlyú I-es típusú keratin, ami fontos 53

54 szerepet játszik a fötális epidermális fejlődésben és a sebgyógyulásban. A KRT17-et basaliomák vizsgálata kapcsán azonosították, és az összetett epitheliumokban specifikum basalis sejtes, illetve myoepithelialis markerként ismerik el (Moll et al., 1982). A KRT17 egy basalis/myoepithelialis sejt keratin, aminek a kifejeződése erősen függ a sejt helyzetétől a komplex emberi epitheliumban (Troyanowsky et al., 1989). A KRT17 expresszióját leírták hólyagdaganatban, keratoacanthomában és laphámrákban, orális laphámcarcinomában, valamint premalignus és malignus cervix carcinomában (He et al., 2009; Leblebici et al., 2017; Kitamura et al., 2012). Az utóbbi években meglepő módon több, nem komplex epithelialis eredetű daganatban kimutatták jelenlétét, úgy, hogy a kiindulási szervben a KRT17 fiziológiásan nem található meg. A KRT17 expresszióját kimutatták gyomor adenocarcinomában, petefészek- és emlő carcinomában, papilláris pajzsmirigy rákban, de e szervek ép szöveti körülményei között a KRT17 nem fejeződik ki. Ezek alapján a daganatokban a KRT17 neoexpressziójától beszélhetünk. A KRT17 kifejeződése egyes daganatok progressziójával és metasztázis hajlamával hozható összefüggésbe. A KRT17 kifejeződése a daganat progressziójával és metasztatizáló hajlamával korrelál. (van de Rijn et al., 1996; Ide et al., 2012; Escobar-Hoyos et al., 2014; Mockler et al., 2011; Wang et al., 2011; Kim et al., 2015; Hu et al., 2018). Kimutattuk, hogy a KRT17 megtalálható az ureterbimbóban és a fötális vese gyűjtőcsatornájában és a felnőtt vese összekötő csatornájában. Első alkalommal került leírásra egyszerű (egy sejtsoros) epitheliumban a KRT17 jelenléte. A papilláris tumorok 77%-ban megtalálható volt a KRT17, sejt morfológiától függetlenül. Figyelembe véve, hogy a papilláris vese tumorok döntő többségében megtalálható a KRT17, és, hogy ezen daganatok mindösszesen 6%-es mutatott metasztázis hajlamot 5 éves utánkövetési idő során, a KRT17 papilláris vese tumorok progressziójában játszott szerepe kétséges. A 54

55 folyamatos kifejeződés a fötális vesében, prekurzor léziókban és papilláris tumorban azonban felveti a lehetőségét, hogy a KRT17-nek szerepe lehet a daganat képződésben. A mechanikai szerepen kívül a keratinok egyéb funkciókkal is rendelkeznek. Kimutatták, hogy a KRT17-nek szerepe van a sejtek viselkedésének megváltoztatásában sebgyógyulás esetén. Hatását jelátviteli utakon keresztül fehérjeszintézis megváltoztatásával és antiapoptotikus hatások által éri el (Kim et al., 2006; Tong és Coulombe, 2006). A KRT17 indukálható a bőr sérülésekor és aktív migrációt vagy regenerációt végző epidermális keratinocytákban a sebgyógyulás során. KRT17 KO egér embrió késleltetett gyógyulást mutat ektodermális sebek esetén (Mazzalupo et al., 2002). Úgy tartották korábban, hogy az embrionális ektoderma KRT17 expressziója epithelialis sejtvonalak irányába történő elköteleződést jelent (McGowan és Coulombe, 1998). Feng és mtsai. (2009) újfent kimutatták, hogy a CD44+/KRT17+ sejtek őssejtszerű tulajdonságokkal rendelkeznek, mint az osztódási képesség, kemo-rezisztencia, és in vivo körülmények között mutatott tumorigenitás. Adataink legalább két szempontból lehetnek érdekesek. A KRT17-nek, mint a basalis epithelialis és myoepithelialis sejtek specifikus markerének kifejeződése egy egyszerű, egy rétegű epitheliumban a fötális és felnőtt vesében, önmagában érdekes felfedezés. Ez mellett a KRT17 folyamatos kifejeződése a fejlődő vesében, a prekurzor léziókban és a papilláris vese tumorok közel 80%-ában arra enged következtetni, hogy a KRT17 a papilláris vesedaganatok karcinogenezisében is szerepet játszhat. Ezen eredményeink korábbi kísérleteinkkel (Bányai, Sarlós et al., 2018) összevetve azt valószínűsítik, hogy a papilláris vese tumorok megjelenése összefüggésben van a vese szöveti fejlődésének zavaraival. A papilláris vese tumorok kialakulása egészen más úton történik, mint a konvencionális, vagy kromofób vese tumorok esetében, ahol a proximális tubulusok vagy gyűjtőcsatornák differenciált sejtjeiből alakul ki a daganat. 55

56 5.5. Az Y kromoszóma hiánya és a PCDH11XY expressziója prekurzor léziókban és papilláris vesetumorban Az Y kromoszóma férfi specifikus régiójában az Yp11.2-nél egy 3.38 megabázis nagyságú DNS szegment található, amely mintegy 3-4 millió évvel ezelőtt az X kromoszómáról transzponálódott az Y kromoszómára (Blanco et al., 2000). Ez a homológ régió az X kromoszómán egy 3.91 megabázis nagyságú DNS szegmentnek felel meg. Az Yp11.2 homológ szekvencia 98%-ban azonos az X kromoszómán az Xq21.3 kromoszómális sávban található homológ régióval (Blanco et al., 2000). Az Yp11.2 régióban csak két gén lokalizált, a protokadherin PCDH11Y és a homeobox gén TGIF2LY. A PCDH11Y csakúgy, mint az Xq21.3 régióban lokalizált PCDH11X gén a protokadherin gének családjába tartozik, amelyeknek fontos szerepe van a sejtsejt kapcsolatban és az agy szegmentális kifejlődésében és funkciójában (Hirano et al., 1999; Blanco et al., 2000). A kódolt gén 7 extracelluláris cadherin motívumból, egy rövid transzmembrán motívumból és egy citoplazmatikus régióból áll, amely utóbbi különbözik a klasszikus cadherinekre jellemző citoplazmatikus régióktól. A PCDH11Y a már fentebb említett 13 bázispár deléció mellett egy 111 kilobázis nagyságú genomikus deléciót mutat, amely a homológ forma 7-es és 8-as exonjának a vesztésével jár. Mind a PCDH11Y és PCDH11X génre számos alternatív exont írtak le (Blanco- Arias et al. 2004). Az NCBI adatbázis 3 PCDH11Y transzkriptot és 8 PCDH11X specifikus transzkriptot említ meg. Ezek az adatok, valamint az Y kromoszóma nagyságának és szerkezetének a variabilitása arra utalnak, hogy az Y kromoszóma még ma is dinamikus változások megy keresztül ben Apitz közölt egy érdekes tanulmányt több mint 4000 boncolás során tett megfigyelésről (Apitz, 1944). A tanulmányban a már szabad szemmel is felismerhető 56

57 szubkapszuláris vese adenomák életkorhoz és nemhez kötött előfordulását írta le. Apitz számszerű adatait egy grafikonon ábrázoltuk (26. ábra). Ezen érdekes megfigyelni, hogy férfiak esetében a pubertás utántól a éves korig az adenomák száma jelentősen emelkedett, utána gyakorlatilag stagnált. Nők esetében a kortikális adenomák száma a menopauza után mutatott jelentős növekedést. Ezek az adatok a papilláris prekurzor léziók és adenomák hormonfüggő kifejlődésére utalnak. It kell megjegyezni, hogy a PCDH11Y specifikus transzkript a prosztatarák, egy hormondependens tumor biológiájában is szerepet játszhat. In vitro körülmények között prosztata tumoros sejtvonalban (LNCaP) a PCDH11Y upregulációja volt megfigyelhető forbol-észter, vagy szérum-éheztetés indulkálta apoptózisra rezisztens sejtekben. Az apoptózis rezisztens sejteknél a PCDH11Y ß-kateninnel kapcsolódott (Chen et al., 2002). A PCDH11Y cdns-sel transzfektált sejteknél egy másik kísérletben Wnt jelátviteli utak aktivitását fokozva indukálódtak antiapoptotikus folyamatok (Yang et al., 2005). 26. Ábra. Vese adenomák előfordulási gyakorisága (y tengely, %) férfiakban és nőkben boncolási leletekben az életkor (x tengely, év) függvényében. (Apitz, 1944) 57

58 Immunhisztológiai vizsgálatunk arra utal, hogy a PCDH11Y génnek jelentős szerepe van a vese fejlődés korai szakaszában. A már kondenzálódott blasztémális sejtekben jelenik meg először és a mesenchyma epitheliális tranzíciója során egyre fokozott kifejeződését figyeltük meg. Ez arra utal, hogy a protocadherin PCDH11Y expressziója fontos a blasztémális sejtek epitelizációjához, a disztális tubuláris rendszer normális kifejlődéséhez. Feltételezésünk szerint a PCDH11Y hiánya a mesenchyma epitheliális tranzíciójának kezdeti szakaszán átment sejtek további differenciálódási zavarához és így a prekurzor léziók kialakulásához vezet Modell a papilláris vesetumor kialakulására A papilláris vese tumor embrionális eredete, a normális vesefejlődés során lokálisan kialakult differenciálódási zavar, a prekurzor léziók perzisztálása az élet folyamán és jóindulatú és azon túlmenően rosszindulatú tumor kialakulásához vezető későbbi proliferációja alapján javasoljuk a differenciálódási zavar - prekurzor lézió - adenómakarcinóma szekvenciát a papilláris vese tumorok kialakulására (Kovacs, 1993; Bányai et al., 2017). Ezeket a morfológiai/biológiai megjelenési formákat a papilláris léziókban kialakuló genetikai elváltozásokkal tudjuk alátámasztani. Az ú.n. klonális tumor fejlődés szerint nagyobb proliferációs képességgel rendelkező klónok túlnövik a többi sejtek és a későbbiekben meghatározzák az egész tumor genetikai karakterét és biológiai viselkedését. Molekuláris patológiai szemlélet alapján helytelen, hogy a jelenleg érvényes tumor klasszifikáció szerint a jóindulatú adenomát és a rosszindulatú daganatot csupán mérete különbözteti meg egymástól (Moch et al., 2016). Ha következetesen a papilláris 58

59 vesedaganat kifejezést használjuk, az mind az adenomát, mind a karcinómát magába foglalja. Korábban a genetikai vizsgálatokra alapozva papilláris vese tumorok osztályozására adenóma-karcinóma szekvencia volt javasolva (Szponar et al., 2009). Ez szerint az adenoma a 7-es és 17-es kromoszómák triszómiájával társul, míg karcinómában 8-as, 16-os és 20-as kromoszómák triszómiája, majd további aberrációk jelennek meg. A HNF1B és MET expressziója embrionális vesében, prekurzor lézióban és papilláris vesetumorban, ennek összefüggése a 7-es és 17-es kromoszómák triszómiájával, és a csírasejtes MET mutációs kromoszóma duplikációjával arra utal, hogy összefüggés van a megnövekedett gén-dózis és a génexpresszió közt. Ennek figylembe vételével egy genomikus elváltozáson és génexpresszión alapuló modellt állítottunk fel a papilláris veserák kialakulására (27. ábra). 27. Ábra. A papilláris vesetumor kialakulásának modellje. A mitotikus non-diszjunkció nyomán a 7. kromoszóma, rajta a (herediter esetekben mutálódott) MET génnel duplikálódik. A megnövekedett kópiaszám (kromoszóma duplikációs, gén amlpifikáció) a MET over-expressziójához, majd differenciálódási zavarhoz vezet. A következő lépésben további kromoszómák vagy gének (pl. HNF1B) számának növekedése 59

60 eredményez over-expressziót, ami a prekurzor lézióból papilláris adenoma, majd karcinóma kialakulásához vezet. (Bányai, Sarlós et al., 2018). 60

61 6. Következtetések A WHO és ISUP klasszifikációja szerint a papilláris vese karcinóma a az epitheliális vese tubulusokból indul ki és az adenóma és karcinóma között csak a tumor mérete dönt: Papillary adenomas are uncapsulated tumours with papillary or tubular architecture of low grade (ISUP) and a diameter <15 mm (WHO, 2016). Papillary renal cell carcinoma is a malignant tumour derived from renal tubular epithelium. It has papillary or tubulopapillary architecture. (WHO, 2016) A vizsgálataink célja volt a papilláris vese tumorok eredetének tisztázása. Figyelembe véve a legkorábbi genetikai eltéréseket, azaz a 7-es és 17-es kromoszómák duplikációját és amplifikációját és a változásokba bevont gének, mint a MET, HNF1B, KRT17 folyamatos kifejeződését fötális vesékben, prekurzor léziókban és papilláris vesetumorokban, bizonyítottnak tekintjük a papilláris vese tumorok embrionális differenciálódási zavaron alapuló eredetét. Elméletünket támogatja a PCDH11XY gén fokozott, időben és térben meghatározott kifejeződése az embryinális vesefejlődés során, amely a differenciálódott nefronban és papilláris vesetumorban már nem mutatható ki. Összefoglalva, véleményünk szerint a papilláris vesetumor specifikus genomikus és génexpressziós elváltozásokon alapuló embrionális differenciálódási zavar, prekurzor lézió, adenoma és karcinóma fejlődési szekvenciát mutat. 61

62 7. Irodalomjegyzék Amin MB, Corless CL, Renshaw AA et al. Papillary (chromophil) renal cell carcinoma: histomorphologic characteristics and evaluation of conventional pathologic prognostic parameters in 62 cases. Am J Surg Pathol 21: , Amin MB, Amin MB, Tamboli P et al. Prognostic impact of histologic subtyping of adult renal epithelial neoplasms: an experience of 405 cases. Am J Surg Pathol 26:281-91, Apitz K. Die Geschwülste und Gewebsmissbildungen der Nierenrinde. Die Adenoma. Virchows Arch 1944; 311: Balint I, Fischer J, Ljungberg B et al. Mapping the papillary renal cell carcinoma gene between loci D17S787 and D17S1799 on chromosome 17q Lab Invest 79: , Balint I, Szponar A, Jauch A et al. Trisomy 7 and 17 mark papillary renal cell tumours irrespectively of variation of the phenotype. J Clin Pathol 62: , Bannasch P, Krech R, Zerban H. Morphogenesis and micromorphology of epithelial tumors induced in the rat kidney by nitrosomorpholine. J Cancer Res Clin Oncol 98(3):243-65, Banyai D, Sarlos DP, Nagy A et al. Recalling Cohnheim's theory: Papillary renal cell tumor as a model of tumorigenesis from impaired embryonal differentiation to malignant tumors in adults. Int J Biol Sci 14: , Banyai D, Vastag F, Yusenko M et al. Embryonal origin of MTSCC of kidney may explain its morphological heterogeneity: Diagnostic impact of genetic analysis. Anticancer Res 37: , Barata PC, Rini BI. Treatment of renal cell carcinoma: current tatus and future directions. CA Cancer J Clin 67: , Beckwith JB, Kiviat NB, Bonadio JF. Nephrogenic rests, nephroblastomatosis and the pathogenesis of Wilms tumor. Pediatr Pathol 10:1-36, Bentz M, Bergerheim USR, Li C et al. Chromosome imbalances in papillary renal cell carcinoma and first cytogenetic data of familial cases analyzed by comparative genomic hybridization. Cytogenet Cell Genet 75:17-21, Berndorff D, Gessner R, Kreft B et al. Liver-intestine cadherin: molecular cloning and characterisation of a novel Ca(2+)-dependent cell adhesion molecule expressed in liver and intestine. J Cell Biol 125: , Blanco P, Sargent CA, Boucher CA et al. Conservation of PCDHX in mammals; expression of X/Y genes predominantly in brain. Mammalian Genome 11: , Blanco-Arias P, Sargent CA, Affara NA. Protocadherin X ( PCDHX) and Y ( PCDHY) genes; multiple mrna isoforms encoding variant signal peptides and cytoplasmic domains. Mamm Genome 15(1):41-52, Blath RA, Mancilla-Jimenez R, Stanley RJ. Clinical comparison between vascular and avascular renal cell carcinoma. J Urol 115:514-9, Chen MW, Vacherot F, de la Taille A et al. The emergence of protocadherin-pc expression during the acquisition of apoptosis-resistance by prostate cancer cells. Oncogene 21: ,

63 Cheville JC, Lohse CM, Zincke H et al. Comparisons of outcome and prognostic features among histologic subtypes of renal cell carcinoma. Am J Surg Pathol 27:612-24, Choi JS, Kim M, Seo JW et al. MET expression in sporadic renal cell carcinomas. J Korean Med Sci 21: , Choueiri TK, Fay AP, Gray KP et al. PD-L1 expresion in nonclear-cell renal cell carcinoma. Ann Oncol 25: , Ciccodicola A., D'Esposito M, Esposito T et al. Differentially regulated and evolved genes in the fully sequenced Xq/Yq pseudoautosomal region. Hum Molec Genet 9: , Clark J, Lu YJ, Sidhar SK et al. Fusion of splicing factor genes PSF and NonO (p54nrb) to the TFE3 gene in papillary renal cell carcinoma. Oncogene 15: , Cohnheim J. Vorlesungen über allgemeine Pathologie. Berlin August Hirschwald p.737. Cristol DS, McDonald FR, Immel FL. Renal adenomas in hypernephromatous kidneys: a study of their incidence, nature and relationship. J Urol 55: , Delahunt B, Eble JN. Papillary renal cell carcinoma: a clinicopathologic and immunohistochemical study of 105 tumors. Mod Pathol 10:537-44, Dudziak K, Mottalebi N, Senkel S et al. Transcription factor HNF1B and novel partners affect nephrogenesis. Kidney International 74: , Eble JN, Sauter G, Epstein JI et al. World Health Organisation classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the urinary system and male genital organs. Lyon, IARC Press, El-Dahr SS, Aboudehen K, Saifudeen Z. Transcriptional control of terminal nephron differentiation. Am J Physiol Renal Physiol 294: , Escobar-Hoyos LF, Yang J, Zhu J et al. Keratin 17 in premalignant and malignant squamous lesions of the cervix: proteomic discovery and immunohistochemical validation as a diagnostic and prognostic biomarker. Mod Pathol 27: , Feng D, Peng C, Li C et al. Identification and characterization of cancer stem-like cells from primary carcinoma of the cervix uteri. Oncol Rep 22: , Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Fischer J, Palmedo G, von Knobloch R et al. Duplication and overexpression of the mutated allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours. Oncogene 17: , Fisher E, Pontoglio M. HNF1B and defective nephrogenesis: a role for interacting partners. Kidney International 74: , Fukuzawa R, Anaka MR, Heathcott RW et al. Wilms tumour histology is determined by distinct types of precursor lesions and not epigenetic changes. J Pathol 215:377-87, Glukhova L, Goguel AF, Chudoba I et al. Overrepresentation of 7q31 and 17q in renal cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer 22: , Glukhova L, Lavialle C, Fauvet D et al. Mapping of the 7q31 subregion common to the small chromosome 7 derivatives from two sporadic papillary renal cell carcinomas: increased copy number and overexpression of the MET protooncogene. Oncogene 19: ,

64 Graveel CR, DeGroot JD, Su Y et al. Met induces diverse mammary carcinomas in mice and is associated with human basal breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 106: , Gresh L, Fischer E, Reimann A et al. A transcriptional network in polycystic kidney disease. EMBO J 7;23: , He X, Marchionni L, Hansel DE et al. Differentiation of a highly tumorigenic basal cell compartment in urothelial carcinoma. Stem Cells 27: , Heliot C, Desgrange A, Buisson I et al. HNF1B controls proximal-intermediate nephron segment identity in vertebrates by regulating Notch signaling components and Irx1/2. Development 140: , Hirano S, Yan Q, Suzuki ST. Expression of a novel protocadherin, OL-protocadherin, in a subset of functional systems of the developing mouse brain. J Neurosci 19(3): , Hiesberger T, Bai Y, Shao X et al. Mutation of hepatocyte nuclear factor-1 beta inhibits Pkhd1 gene expression and produces renal cysts in mice. J Clin Invest 113: , Horikawa Y, Iwasaki N, Hara M et al. Mutation in hepatocyte nuclear factor-1 beta gene (TCF2) associated with MODY. Nat Genet 17: , Hu H, Xu D, Huang X et al. Keratin 17 promotes tumor growth and is associated with poor prognosis in gastric cancer. J Cancer 9: , Hughson MD, McManus JFA, Hennigar GR. Studies on end-stage kidneys. II. Embryonal hyperplasia of Bowman s capsular epithelium. Am J Pathol 91:71-80, Ide M, Kato T, Ogata K et al. Keratin 17 expression correlates with tumor progression and poor prognosis in gastric adenocarcinoma. Ann Surg Oncol 19: , Jobling MA, Lo ICC, Turner DJ et al. Structural variation on the short arm of the human Y chromosome: recurrent multigene deletions encompassing Amelogenin Y. Hum Molec Genet 16: , Jonasch E, Gao J, Rathmell WK. Renal cell carcinoma. BMJ 10;349:g4797, Keshani de Silva V, Tobias V, Kainer G et al. Metanephric adenoma with embryonal hyperplasia of Bowman's capsular epithelium: previously unreported association. Pediatr Dev Pathol 3: , Keyes EL. Adenoma of the kidney. Succesful nephrectomy. Am J Med Sci 100: , Kim HS, Lee JJ, Do SI et al. Overexpression of cytokeratin 17 is associated with the development of papillary thyroid carcinoma and the presence of lymph node metastasis. Int J Clin Exp Pathol 8: , Kim S, Wong P, Coulombe PA. A keratin cytoskeletal protein regulates protein synthesis and epithelial cell growth. Nature 441: , Kim SY, Yasuda S, Tanaka H et al. Non-clustered protocadherin. Cell Adh Migr 5:97-105, Kinney SN, Eble JN, Hes O et al. Metanephric adenoma: the utility of immunohistochemical and cytogenetic analysis in differential diagnosis, including solid variant papillary renal cell carcinoma and epithelial-predominant nephroblastoma. Mod Pathol 28: , Kitamura R, Toyoshima T, Tanaka H et al. Association of cytokeratin 17 expression with differentiation in oral squamous cell carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 138: ,

65 Kovacs G. Papillary renal cell carcinoma: A morphologic and cytogenetic study of 11 cases. Am J Pathol 134:27-34, Kovacs G. Molecular cytogenetics of renal cell tumors. Adv Cancer Res 62:89-124, Kovacs G, Akhtar M, Beckwith BJ et al. The Heidelberg classification of renal cell tumours. J Pathol 183: , Kovacs G, Brusa P. Clonal chromosomal aberrations in normal kidney tissue from patients with renal cell carcinoma. Cancer Genet Cytogenet. 37: , Kovacs G, Fuzesi L, Emanuel A et al. Cytogenetics of papillary renal cell tumors. Genes Chromosomes Cancer 3: , Kovacs G, Kovacs A. Parenchymal abnormalities associated with papillary renal cell tumours: a morphologic study. J Urol Pathol 1: , Kovacs G, Tory K, Kovacs A. Development of papillary renal cell tumours is associated with loss of Y-chromosome specific DNA sequences. J Pathol 173:39-44, Kovacs G. Molecular cytogenetics of renal cell tumors. Adv Cancer Res 62:89-124, Kovacs G. Molecular differential pathology of renal cell tumours. A review. Histopathology 22:1-8, Leblebici C, Pasaoglu E, Kelten C et al. Cytokeratin 17 and Ki-67: Immunohistochemical markers for the differential diagnosis of keratoacanthoma and squamous cell carcinoma. Oncology Lett 13: , Li CM, Guo M, Borczuk A et al. Gene expression in Wilms tumor mimics the earliest committed stage in the metanephric mesenchymal-epithelial transition. Am J Pathol 160: , Looyenga BD, Furge KA, Dykema KJ et al. Chromosomal amplification of leucine-rich repeat kinase-2 (LRRK2) is required for oncogenic MET signaling in papillary renal and thyroid carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 108: , Lubensky IA, Schmidt L, Zhuang Z et al. Hereditary and sporadic papillary renal carcinomas with c-met mutations share a distinct morphological phenotype. Am J Pathol 155: , Ma Z, Gong Y, Patel V et al. Mutations of HNF1B inhibit epithelial morphogenesis through dysregulation of SOCS-3. Proc Natl Acad Sci USA 104: , Mancilla-Jimenez R, Stanley RJ, Blath RA. Papillary renal cell carcinoma: a clinical, radiologic, and pathologic study of 34 cases. Cancer 38: , Mantoan Padilha M, Billis A, Alende D et al. Metanephric adenoma and solid variant of papillary renal cell carcinoma: common and distinctive features. Histopathology 62: , Massa F, Garbay S, Bouvier R et al. Hepatocyte nuclear factor 1 beta controls nephron tubular development. Development 140: , Mazzalupo S, Wawersik MJ, Coulombe PA. An ex vivo assay to assess the potential of skin keratinocytes for wound epithelialization. J Invest Dermatol 118: , McGowan KM, Coulombe PA. Onset of keratin 17 expression coincides with definition of major epithelial lineages during skin development. J Cell Biol 143: , Mendez FL, Poznik GD, Castellano S et al. The divergence of Neandertal and modern human Y chromosomes. Am J Hum Genet 98: ,

66 Moch H, Cubilla AL, Humphrey PA et al. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs-Part A: Renal, Penile, and Testicular Tumours. Eur Urol 70:93-105, Mockler D, Escobar-Hoyos LF, Akalin A et al. Keratin 17 is a prognostic biomarker in endocervical glandular neoplasia. Am J Clin Pathol 148: , Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol 129: , Moll R, Moll I, Wiest W. Changes in the pattern of cytokeratin polypeptides in epidermis and hair follicles during skin development in human fetuses. Differentiation 23: , Montesano R, Matslimoto K, Nakamura T et al. Identification of a fibroblast-derived morphogen as hepatocyte growth factor. Cell 67: , Montesano R, Soriano JV, Malinda KM et al. Differential effects of hepatocyte growth factor isoforms on epithelial and endothelial tubulogenesis. Cell Growth Differ 9:355-65, Muir TE, Cheville JC, Lager DJ. Metanephric adenoma, nephrogenic rests, and Wilms tumour: a histologic and immunophenotypic comparison. Am J Surg Pathol 25: , Mumm S, Molini B, Terrell J et al. Evolutionary features of the 4-Mb Xq21.3 XY homology region revealed by a map at 60-kb resolution. Genome Res 7: , Murphy WM, Beckwith JB, Farrow GM. Tumors of the kidney, bladder, and related urinary structures. Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC, USA, Nakayama M, Nozu K, Goto Y et al. HNF1B alterations associated with congenital anomalies of the kidney and urinary tract. Pediatr Nephrol 25: , Natrajan R, Williams RD, Hing SN et al. Array CGH profiling of favourable histology Wilms tumours reveals novel gains and losses associated with relapse. J Pathol 210:49-58, Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194:23-28, Ornstein DK, Lubensky IA, Venzon D et al. Prevalence of microscopic tumors in normal appearing renal parenchyma of patients with hereditary papillary renal cancer. J Urol 163: , Ponzo MG, Lesurf R, Petkiewitz S et al. Met induces mammary tumors with multiple pathologies and is associated with both poor outcome and basal-type breast cancers. Proc Natl Acad Sci USA 106: , Reuter VE, Argani P, Zhou M et al. Best practices recommendations in the application of immunohistochemistry in the kidney tumors. Report from the International Society of Urologic Pathology Consensus Conference. Am J Surg Pathol 38:e35-e49, Rivera MN, Haber DA. Wilms tumor: connecting tumorigenesis and organ development in the kidney. Nat Rev Cancer 5: , Samaratunga H, Gianduzzo T, Delahunt B. The ISUP system of staging, grading and classification of renal cell neoplasia. J Kidney Cancer VHL 1(3):26 39, Schmidt L, Duh FM, Chen F et al. Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nature Genet 16:68-73,

67 Schwartz A, Chan DC, Brown LG et al. Reconstructing hominid Y evolution: X- homologous block, created by X-Y transposition, was disrupted by Yp inversion through LINE-LINE recombination. Hum Molec Genet 7:1-11, Sidhar SK, Clark J, Gill S et al. The t(x;1)(p11.2;q21.2) translocation in papillary renal cell carcinoma fuses a novel gene PRCC to the TFE3 transcription factor gene. Hum Mol Genet 5: , Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics CA Cancer J Clin 68:7-30, Szponar A, Yusenko MV, Kuiper R et al. Genomic profiling of papillary renal cell tumours identifies small regions of DNA amplifications: a possible role of HNF1B in tumour development. Histopathology 58: , Szponar A, Zubakov D, Pawlak J et al. Three genetic developmental stages of papillary renal cell tumours: Duplication of chromosome 1q marks fatal progression. Int J Cancer 124: , Takemoto M, He L, Norlin J et al. Large-scale identification of genes implicated in kidney glomerulus development and function. EMBO J 25: , Terry S, Queires L, Gil-Diez-de-Medina S et al. Protocadherin-PC promotes androgenindependent prostate cancer cell growth. Prostate 66(10): , Thoenes W, Störkel S, Rumpelt HJ et al. Renal cell carcinoma - a classification based on cytomorphological criteria. Zentralbl Allg Pathol 132:503-13, Thoenes W, Störkel S, Rumpelt HJ et al. Histopathology and classification of renal cell tumors (adenomas, oncocytomas and carcinomas). The basic cytological and histopathological elements and their use for diagnostics. Pathol Res Pract 181:125-43, Tilford CA, Kuroda-Kawaguchi T, Skaletsky H et al. A physical map of the human Y chromosome. Nature 409: , Tong X, Coulombe PA. Keratin 17 modulates hair follicle cycling in a TNFalphadependent fashion. Genes Dev 20: , Troyanovsky SM, Guelstein VI, Tchipysheva TA et al. Patterns of expression of keratin 17 in human pithelia: dependency on cell position. J Cell Sci 93: , van de Rijn M, Perou CM, Tibshirani R et al. Expression of cytokeratins 17 and 5 identifies a group of breast carcinomas with poor clinical outcome. Am J Pathol 161: , Vounonvirta R, Sebire NJ, Messahl B et al. Expression of hepatocyte growth factor and its receptor Met in Wilms tumors and nephrogenic rests reflects their roles in kidney development. Clin Cancer Res 15: , Vounonvirta R, Sebire NJ, Messahl B et al. Expression of hepatocyte growth factor and its receptor Met in Wilms tumors and nephrogenic rests reflects their roles in kidney development. Clin Cancer Res 15: , Wild W, Pogge von Strandmann E, Nastos A et al. The mutated human gene encoding hepatocyte nuclear factor 1beta inhibits kidney formation in developing Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci USA 97: , Yang X, Chen MW, Terry S et al. A human- and male-specific protocadherin that acts through the Wnt signaling pathway to induce neuroendocrine transdifferentiation of prostate cancer cells. Cancer Res 65: , Yoshida K, Sugano S. Identification of a novel protocadherin gene (PCDH11) on the human XY homology region in Xq21.3. Genomics 62: ,

68 Zhuang Z, Park WS, Pack S et al. Trisomy 7-harbouring non-random duplication of the mutant MET allele in hereditary papillary renal carcinomas. Nat Genet 20:66-69,

69 8. Közlemények 8.1. Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények Sarlós DP, Bányai D, Péterfi L, Szántó Á, Kovacs G. Embryonal origin of metanephric IF 1,86 adenoma and its differential diagnosis. Anticancer Res 38: , Sarlós DP, Péterfi L, Szántó Á, Kovacs G. Shift of keratin expression profile in end-stage kidney increases the risk of tumor development. Anticancer Res 38(9): , IF 1,86 Bányai D, Sarlós DP, Nagy A, Kovacs G. Recalling Cohnheim's theory: Papillary renal cell tumor as a model of tumorigenesis from impaired embryonal development to malignant tumors in adults. Int J Biol Sci 14: , IF 3,84 Cumulativ impact factor: Az értekezés témájához nem kapcsolódó közlemények Sarlós DP, Czétány P. Új laparoszkópos vesetumor-reszekció gyakorló modell kifejlesztése. Magyar Urológia 30:8-11, Pusztai Cs, Bányai D, Jávorházy A, Kenyeres B, Sarlós P, Szántó Á. Laparoszkópos parciális nephrectomia a technikailag komplex vesetumorok sebészi ellátásában. Magyar Urológia 27: ,

70 Tamás A, Jávorházy A, Reglődi D, Sarlós DP, Bányai D, Semjén D, Németh J, Lelesz B, Fülöp DB, Szántó Z. Examination of PACAP-like immunoreactivity in urogenital tumor samples. J Mol Neurosci 59: , IF 2,229 Pusztai Cs, Bányai D, Sarlós DP, Farkas L, Szántó Á, Semjén D. Laparoszkópia szerepe a vese angiomyolipomák sebészi kezelésében Magyar Urológia 27:2-6, Farkas N, Szabó A, Lóránd V, Sarlós DP, Minier T, Prohászka Z, Czirják L, Varjú C. Clinical usefulness of measuring red blood cell distribution width in patients with systemic sclerosis. Rheumatology (Oxford) 53: , IF Sarlós DP, Kispál ZF, Bíró E, Tornóczky T, Környey J, Sánta I, Pintér A, Vástyán A. Lézerbesugárzás hatása patkány gyomornyálkahártyára: szövettani és funkcionális vizsgálatok előzetes közlemény. Magyar Urológia 23(2):34-38, Impakt faktor: Első szerzős: 3,72 Kumulatív: 14,224 70

71 9. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőimnek, Prof. Dr. Kovács Gyulának, hogy a lehetőséget adott a vesedaganatok molekuláris onkológiájával foglalkozó kutatócsoporthoz való csatlakozásra, és kutatási tevékenységemet segítőkészen irányította, és Dr. Szántó Árpádnak, hogy a kutatási tevékenységemet mindvégig támogatta. Köszönet illeti a Heidelbergi Egyetem Molekuláris Onkológiai Labor munkatársait kutatásunk több, fontos vizsgálatának elvégzéséért. Köszönöm a PTE KK Pathologiai Intézet munkatársainak (Dr. Tornóczki Tamás, Dr. Kálmán Endre, Dr. Semjén Dávid, Dr. Pap Anita, Dr. Fincsur András, Dr. Gyömörei Csaba, Halas Zsuzsanna, Szilágyi Imréné Judit) kutatásunkhoz nyújtott önzetlen segítségét. Köszönöm korábbi témavezetőimnek, Prof. Dr. Czirják Lászlónak, Prof. Dr. Balogh Péternek, Dr. Vástyán Attilának hogy munkájukkal nagyban hozzájárultak tudományos fejlődésemhez. Köszönöm a PTE KK Urológiai Klinika minden munkatársának a kutatásban, és a betegellátásban nyújtott segítségüket. Köszönöm családtagjaimnak, hogy mellettem álltak és szeretetükkel támogattak. 71

72 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) doi: /anticanres Shift of Keratin Expression Profile in End-stage Kidney Increases the Risk of Tumor Development DONAT PETER SARLOS 1, LEHEL PETERFI 1, ARPAD SZANTO 1 and GYULA KOVACS 1,2 1 Department of Urology, Medical School, University of Pecs, Pecs, Hungary; 2 Medical Faculty, Ruprecht-Karls-University, Heidelberg, Germany Abstract. Background/Aim: Pre-neoplastic lesions and renal cell tumors of distinct pheno- and genotypes occur frequently in end-stage kidneys. The aim of this study was to investigate the role of KRT7 and KRT19 in this process, the expression of which was previously detected by Affymetrix GeneChip analysis. Patients and Methods: Twelve end-stage kidneys were analyzed to find pre-neoplastic lesions and tumors and expression of KRT7 and KRT19 was examined by immunohistochemistry. Results: A total of 17 tumors, 149 preneoplastic lesions, 179 simple or proliferative cysts >2 mm were identified. Diffuse expression of KRT7 and KRT19 was seen in all end-stage kidneys as well as in the vast majority of cysts, pre-neoplastic lesions and tumors. Conclusion: Our data indicates that de novo expression of KRT7 and KRT19 resulting in altered plasticity and stem cell characteristics of epithelial cells might be a crucial factor in increasing the risk of tumor development in end-stage kidneys. Chronic renal disease (CRD) is characterized by a decrease in kidney function to a degree requiring renal replacement therapy (RRT). The long survival of patients with nonfunctioning kidneys results in remodeling of kidney structure, so-called end-stage renal disease (ESRD). In spite of atrophic structures, ESRD kidney shows a remarkable proliferative activity (1). In sclerotic end-stage kidneys diffuse cystic changes may develop, especially after long intermittent maintenance haemodialysis, and this condition is defined as acquired cystic renal disease (ACRD) (2). Remodelling of kidneys in ESRD/ACRD is frequently accompanied by preneoplastic lesions and renal cell tumors (RCT) of distinct pheno- and genotype (3-8). Clinically recognized renal cell Correspondence to: Gyula Kovacs, Department of Urology, Medical School, University of Pecs, Munkacsy M. u. 2, H-7621 Pecs, Hungary. Tel: , Fax: , G.Kovacs@gmx.de, gyula.kovacs@urz.uni-heidelberg.de Key Words: End-stage renal disease, KRT7, KRT19, immuno - histochemistry, tumor development. carcinoma (RCC) has been found in 3.8% of native end-stage kidneys which contrasts with a detection rate of 0.04% to 0.3% lifetime risk of developing RCC in the general population (9, 10). Malignancy is currently reported as a cause of death in 3 to 4% of ESRD/ACRD patients, largely as the result of an increasing incidence of RCC (11). The underlying molecular mechanism of structural remodeling of ESRD/ACRD kidneys, as well as of development of tumors is not yet known. RCTs arising in the general population are characterized by specific genomic alterations. It has been proposed that in ESDR/ACRD the microenvironment may trigger the development of tumors of unusual pheno- and genotype (12). Expression of growth factors and hypoxemia have been suggested to be responsible for cystic changes and tumors (13-15). Global gene expression analysis disclosed a Bunique gene expression signature including a group of cytokines indicating an inflammatory microenvironment in ESRD/ACRD kidneys (14). Another well-defined group of functionally related genes expressed in ESRD/ACRD kidneys encodes intermediate filament proteins including the keratins KRT7 and KRT19 (14). It was demonstrated that KRT7 and KRT19 are up-regulated during renal epithelial injury (16). KRT19 has also been described as a putative marker of epidermal stem cells and its overexpression was associated with metastatic capacity of tumours (17-19). The aim of this study was to analyse the morphological changes and KRT7 and KRT19 expression in ESRD/ACRD kidneys, pre-neoplastic lesions and associated tumours by immunohistochemistry. A diffuse KRT7 and KRT19 expression was found in ESRD/ACRD kidneys and associated tumors indicating their role in structural remodelling and tumorigenesis. Materials and Methods Tissue samples. From 11 ESRD/ACRD cases 12 entire kidneys were available and processed in several hundreds of paraffin blocks for histological analysis. ACRD was diagnosed when the secondary cystic changes replaced at least 40% of the kidney parenchyma. The 5217

73 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) hematoxylin and eosin (H&E) stained slides were scored for cysts, small precursor lesions and tumors. The diagnosis of tumors was established according to the Heidelberg Classification (20) and Tickoo et al. (5). Tissue multi array (TMA) was constructed from paraffin embedded ESRD/ACRD associated tumors after marking the areas of interest on H&E-stained slides by one of the authors (GK). Core biopsies of 0.6 mm in diameter were placed within a recipient block by Manual Tissue Arrayer (MTA1, Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, WI, USA). The collection and use of tissue samples for this study was approved by the Ethics Committees of the University of Heidelberg, Germany and University of Pecs, Hungary. Immunohistochemistry. Paraffin blocks of normal and ESRD/ARCD kidneys as well as a TMA containing ESRD/ARCD associated tumours were used for immunohistochemistry. Serial sections of ESRD/ACRD kidneys were used to compare the results obtained by different antibodies. After dewaxing and rehydration of the slides, antigen de-masking was performed in 10 mm sodium citrate buffer, ph 6,0 or TE buffer, ph 9,0 in 2100-Retriever (Pick-Cell Laboratories, Amsterdam, The Netherlands). Endogenous peroxidase activity and unspecific binding sites were blocked with 0.3% hydrogen peroxide containing 1% normal horse serum for 10 min at room temperature. Slides were incubated overnight with KRT7 (mouse monoclonal antibody, ab9021, Abcam, Cambridge, UK) in 1:300 dilution, KRT19 (rabbit polyclonal antibody, ab , Abcam,) in 1:100 dilution, TMEM27 (rabbit polyclonal antibody, ab200664, Abcam,) in 1:1,000 dilution and AQP2 (rabbit polyclonal antibody, PA , Thermo Fisher, Budapest, Hungary) in 1:200 dilution. HRP conjugated secondary antibody (MACH4 Universal HRP-Polymer, Biocare Medical, Concord, CA, USA) was applied for 30 min. The signal was visualized with AEC (Amino-ethylcarbazol) and DAB (3,3 -Diaminobenzidin). Tissue sections were counterstained with Mayer's haematoxylin. In negative control the primary antibody was omitted. Results Cysts, precursor lesions and tumours in ESRD/ACRD. Analysis of 393 paraffin blocks obtained from 12 entire kidneys of 11 patients with ESRD/ACRD revealed 17 tumors with a size of 2-41 mm in diameter (Table I). The size of main tumours varied between 8 and 41 mm. Five tumours were diagnosed as papillary renal cell tumor (prct) and another 6 as conventional renal cell carcinoma (crcc), all showing similar histology to those occurring in the general population. One oncocytoma, two ACRD-associated eosinophil-vacuolated tumors, two chromophobe-like tumors, and one clear cell papillary RCC were also found (Table I). By detailed microscopic analysis of the 393 slides we detected 143 small cysts, 26 proliferative cysts with solidpapillary growth of cells within the cysts. Ten of the proliferative cysts displayed solid growth of large eosinophil cells with cytoplasmic vacuoles. Overall, 65 small papillary precursor lesions of small or medium sized cells revealed similar growth pattern, which was earlier described in kidneys with papillary RCC in the general population (21). The overwhelming majority of the 42 pre-neoplastic lesions with chromophobe RCC-like pattern occurred in the two kidneys of one patient (173R and 173L). Nearly all of the 24 small solid lesions with large eosinophil vacuolated cells were located in one kidney (209). The number of cysts and distinct types of pre-neoplastic lesions are shown in Table II. A good correlation was found between the phenotype of preneoplastic lesions and tumors, the majority of pre-neoplastic lesions displayed a similar morphology to the tumor observed in the same kidney (Figure 1). Expression of KRT7 and KRT 19 in ESRD/ACRD kidneys, pre-neoplastic lesions and tumours. In normal kidney KRT7 and KRT19 proteins were expressed in principal cells of the collecting duct. However, in ESRD/ACRD kidneys a diffuse KRT7 and KRT19 staining was seen in small atrophic as well as in dilated tubules lined with flat or cuboidal epithelial cells (Figure 2A and B). To clear the origin of cells stained positively with both KRT7 and KRT19, we have analysed ESRD/ACRD kidneys for expression of structural proteins of proximal tubules (TMEM27) and principal cells of the collecting duct (AQP2). No expression of TMEM27 and AQP2 or expression only in single tubules were observed (Figure 2C and D). There was a strong immunostaining in dilated tubules showing papillary growth within the lumen (Figure 2E). All papillary RCTs developed in ESRD/ACRD kidneys showed diffuse positivity with KRT7 antibody (Figure 2F). A membrane attenuated positive staining was seen in each small chromophobe-like pre-neoplastic lesion in kidneys 173R and 173L as well as in the chromophobe-like cancer (Figure 2G and H). ACRD associated eosinophil vacuolated tumors displayed only scattered positivity with KRT7. Conventional and clear cell papillary RCC were consequently negative for KRT7. All cells of tubular-papillary growing tumours including those with broad papillary stalk displaying strong inflammation exhibited a strong KRT19 positive immunostaining (Figure 2I and J). Proliferative cystic pre-neoplastic lesions for ACRDassociated eosinophilic-vacuolated tumor and also the tumor itself displayed focal cytoplasmic staining for KRT19 (Figure 2K). The chromophobe-like precursor lesions and tumours also showed a strong KRT19 immunoreaction. Of interest, 4 of the 6 conventional RCCs showed scattered positivity for KRT19 (Figure 2L), whereas the clear cell papillary RCC was negative. Discussion In chronic renal disease nephrons gradually lose their function and undergo an extreme structural remodeling. There is a long-debated question on the origin of atrophic 5218

74 Sarlos et al: End-stage Kidney and Cancer Table I. Pertinent clinical and histological data of ESRD/ACRD tumours. Tumour samples Patient age/gender Renal disease Size of kidney (cm) Size of tumor (cm) Histological diagnosis 94A 76/M ESRD/NS crcc 94B 0.2 prct 94C 0.3 prct /F ACRD/? RO 123A 77/M ACRD/GN ACRD-T 123B 2.6 crcc 123C 2.2 ccprcc /M ESRD/NS crcc 173 L 68/M ESRD/GN chrcc-like 173 R chrcc-like /M ACRD/NS crcc /M ACRD/? 9 5x4 3.0 crcc 203 A 54/M ESRD/? prct 203 E 0.3 prct /M ACRD/GN ACRD-T /M ESRD/? crcc /M ACRD/? prct NS: Nephrosclerosis;?: unknown; GN: glomerulonephritis; crcc: conventional RCC; prct: papillary RCT; RO: renal oncocytoma; ACRD-T: ACRD associated large eosinophilic cells with cytoplasmic vacuoles; ccprcc: clear cell papillary RCC; chrcc-like: similar morphology to chrcc. Table II. Type and number of precuros lesions in ESRD/ACRD. Kidney samples Nr. of blocks Cyst p-cyst Conv Pap ch-like l-eos ccpap * R L * p-cyst: Proliferative cyst; conv: conventional-like lesion; pap: papillary lesion; ch-like: chromophobe-like lesion; l-eos: large eosinophilic cells with vacuoles; ccpap: clear cell papillary lesion; *proliferative cyst with large vacuolated cells. The dominant type of precursor lesion is marked in bold. and proliferating cells in ESRD/ACRD kidneys (1, 14). KRT7 and KRT19 are expressed only in principal cells of the collecting duct and ascending loop of Henle. We found a diffuse positivity for KRT7 and KRT19 in atrophic tubules and single epithelial cells embedded in fibrous stroma as well as in dilated and cystic tubules. In this study, TMEM27 and AQP2 antibodies, which recognize structural proteins of proximal tubules and principal cells of the collecting duct, respectively, stained only single tubules in ESRD/ACRD kidneys. It was recently documented that SCEL, a marker of distal tubular cells, shows diffuse immune-reaction in nearly all cells of ESRD/ACRD kidneys (22). Therefore, we suggest that the vast majority of solid epithelial cell clusters, aberrant tubular and cystic structures in ESRD/ACRD kidneys correspond to proliferating distal tubules. Strong arterial and arteriolar sclerosis leads to slow or blocked blood flow in ESRD kidneys (23). The reduced oxygen and nutrient delivery results in damage of epithelial cells especially of proximal tubules, which cannot easily convert from oxidative to glycolytic metabolism. Thus, 5219

75 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) Figure 1. Morphological heterogeneity of precursor lesions and ESRD/ACRD tumors. A, Tubulopapillary growth of small-cell pre-neoplastic lesion (A) and papillary RCT (B). A pre-neoplastic lesion showing a transition from small-cell papillary morphology towards large eosinophilic cells (C) and the ACRD-associated vacuolated eosinophil tumor (D) of the same kidney. A proliferative cyst lined with large vacuolated eosinophil cells (E) and corresponding tumor (F). Small chromophobe-like pre-neoplastic lesion (G) and tumor (H). Figure 2. Expression of KRT7 and KRT19 in ESRD kidney, pre-neoplastic lesions and tumors. Diffuse KRT7 (A) and KRT19 (B) positivity but no or scattered staining with AQP2 (C) and TMEM27 (D); the corresponding tumor (T) shows positive reaction with KRT19. KRT7 positive immunoreaction in a papillary preneoplastic lesion (E), papillary RCT (F) as well as in a small chromophobe-like lesion (G) and corresponding tumor (H). Note the strong KRT19 staining in a tubulopapillary (I) and papillary (J) RCT, scattered positivity in a ACRD-associated tumor (K) and also in a conventional RCC (L). 5220

76 Sarlos et al: End-stage Kidney and Cancer proximal tubular cells are not only the victims but actively participate in the inflammatory response to ischemia by releasing cytokines and chemokines which play an important role in progressive fibrosis which in turn increases the hypoxemic stress (24, 25). Cells of the distal tubules are more resistant to hypoxia and have greater capacity to shift from oxidative to glycolytic metabolism, which may explain the survival and preferential proliferation of cells of distal tubules. Corresponding to the hypoxemic stage, high expression of hypoxia inducible gene HIG2, HIF1A and also NFkB triggering the expression of pro-inflammatory and inflammatory proteins, has been documented in ESRD/ACRD kidneys, cysts and epithelial hyperplasia (25). HIF1A is also expressed in conventional RCC whereas HIG2 in papillary RCTs. Using global gene expression analysis two groups of functionally related genes have been detected in ESRD/ACRD kidneys (14). The high expression of cytokines including IL-6, IL-8 and their receptors indicated a strong inflammatory microenvironment (14). The other group of functionally related genes included KRT7 and KRT19, which are known to be associated with increased plasticity of epithelial cells. Recently, it was also shown that expression of IL-6, TNFa and NFkB leads to upregulation of cytokeratins in experimental renal disease models (26). Highly specialized epithelial cells of kidney express, at normal state, only KRT8 and KRT18, which are crucial in keeping the integrity and mechanical stability of tubular epithelial cells. Recent studies showed that this structural support may be modulated to accommodate the changing needs of cells and pointed out a novel role of intermediate filaments influencing cell growth and death through dynamic interactions with non-structural proteins. Keratins are not only structural cell markers but are also stress-responsive proteins in tubular cells (26). For example, KRT7 and KRT19 are upregulated during renal epithelial injury and repair (16). Thus, upon various types of stress such as hypoxemia, inflammation, renal tubular injury or atrophy, each of them occurring in ESRD/ACRD, epithelial cells may switch on expression of KRT7 and KRT19, which appears to correlate with reduction in the degree of terminal differentiation. A diffuse expression of KRT7 and KRT19 was found not only in ESRD/ACRD kidneys, cysts, pre-neoplastic lesions but also in tumors of distinct histological types. KRT19 has been described as a putative marker of epidermal stem cells (17). The increased expression of KRT19 shows a good correlation with the invasive growth and metastatic potential of liver and cancer (18, 19). Serum levels of CYFRA 21-1, a KRT19 fragment, can be used as a tumour marker in variety of cancers such as non-small cell lung cancer, breast, ovarian, liver and bladder cancer to detect tumour cell dissemination and presence of metastasis (27, 28). In summary, our results indicate that tubular cells of endstage kidneys suspend their program of terminal differentiation and shift their keratin expression profile from KRT8 and KRT18 to KRT7 and KRT19 which allows them to alter their shape and to increase their plasticity necessary for the remodeling and tumorigenic processes. ESRD/ACRD is associated with large number of proliferative cysts and pre-neoplastic lesions with distinct cellular characteristics similar to those observed in tumors from the corresponding kidney. Previous and present data indicates that ESRD/ACRD is a novel disease. The hypoxemic and inflammatory microenvironment alters the plasticity and leads to stem cell characteristics of epithelial cells which might be crucial factor in tumor development. Conflicts of Interest Authors have no conflicts of interest to declare. Acknowledgements This work was supported by a grant of PTE-AOK KA The Authors thank Drs. G. Staehler (Department of Urology, University of Heidelberg, Germany), B. Schulze-Brüggemann (Department of Urology, District Hospital Bad-Hersfeld, Germany), D. Ferluga (Insitute of Pathology, University of Ljubljana, Slovenia), and Mr. D. Cranston (Department of Urology, Radcliffe Hospital, Cambridge, UK) for making clinical material available from end-stage kidneys. References 1 Nadasdy T, Laszik Z, Lajoie G, Blick KE, Wheeler DE and Silva FG: Proliferative activity of cyst epithelium in human renal cystic diseases. J Am Soc Nephrol 5: , Dunnill MS, Millard PR and Oliver D: Acquired cystic disease of the kidneys: A hazard of long-term intermittent maintenance haemodialysis. J Clin Pathol 30: , Ishikawa I and Kovacs G: High incidence of papillary renal cell tumors in patients on chronic haemodialysis. Histopathology 22: , Chudek J, Herbers J, Wilhelm M, Kenck C, Bugert P, Ritz E, Waldman F and Kovacs G: The genetics and morphology of renal cell tumors in end-stage renal failure may differ from those occurring in the general population. J Am Soc Nephrol 9: , Tickoo SK, deperalta-venturina MN, Harik LR, Worcester HD, Salama ME, Young AN, Moch H and Amin MB: Spectrum of epithelial neoplasms in end-stage renal disease: an experience from 66 tumor-bearing kidneys with emphasis on histologic patterns distinct from those in sporadic adult renal neoplasia. Am J Surg Pathol 30: , Pan CC, Chen YJ, Chang LC, Chang YH and Ho DM: Immunohistochemical and molecular genetic profiling of acquired cystic disease-associated renal cell carcinoma. Histopathology 55: , Kuntz E, Yusenko MV, Nagy A and Kovacs G: Oligoarray-CGH of renal cell tumors developed in patients with acquired cystic renal disease. Hum Pathol 41: ,

77 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) 8 Inoue T, Matsuura K, Yoshimoto T, Nguyen LT, Tsukamoto Y, Nakada C, Hijiya N, Narimatsu T, Nomura T, Sato F, Nagashima Y, Kashima K, Hatakeyama S, Ohyama C, Numakura K, Habuchi T, Nakagawa M, Seto M, Mimata H and Moriyama M: Genomic profiling of renal cell carcinoma in patients with endstage renal disease. Cancer Sci 103: , Chow WH, Dong LM and Devesa SS: Epidemiology and risk factors for kidney cancer. Nat Rev Urol 7: , Butler AM, Olshan AF, Kshirsagar AV, Edwards JK, Nielsen ME, Wheeler SB and Brookhart MA: Cancer incidence among US Medicare ESRD patients receiving haemodialysis, Am J Kidney Dis 65: , Denton MD, Magee CC, Ovuworie C, Mauiyyedi S, Pascual M, Colvin RB, Cosimi AB, Tolkoff-Rubin N: Prevalence of renal cell carcinoma in patients with ESRD pre-transplantation: A pathologic analysis. Kidney Int 61: , Kovacs G: High frequency of papillary renal cell tumours in end-stage kidneys is there a molecular genetic explanation? Nephrol Dial Transplant 10: , Konda R, Sato H, Hatafuku F, Nozawa T, Ioritani N and Fujioka T: Expression of hepatocyte growth factor and its receptor c-met in acquired renal cystic disease associated with renal cell carcinoma. J Urol 171: , Nagy A, Walter E, Zubakov D and Kovacs G: High risk of development of renal cell tumor in end-stage kidney disease: the role of microenvironment. Tumor Biol 37: , Cohen EP and Elliott WC: The role of ischemia in acquired cystic kidney disease. Am J Kidney Dis 15: 55-60, Djudjaj S, Papasotiriou M, Büpow RD, Wagnerova A, Lindenmeyer MT, Cohen CD, Strnad P, Goumenos DS, Floege J and Boor P: Keratins are novel markers of renal epithelial injury. Kidney International 89: , Commo S, Gaillard O and Bernard BA: The human hair follicle contains two distinct K19 positive compartments in the outer root sheath: a unifying hypothesis for stem cell reservoir? Differentiation 66: , Kabir NN, Rönnstrand L and Kazi JU: Keratin 19 expression correlates with poor prognosis in breast cancer. Mol Biol Rep 41: , Govaere O, Komuta M, Berkers J, Spee B, Janssen C, de Luca F, Katoonizadeh A, Wouters J, van Kempen LC, Durnez A, Verslype C, De Kock J, Rogiers V, van Grunsven LA, Topal B, Pirenne J, Vankelecom H, Nevens F, van den Oord J, Pinzani M and Roskams T: Keratin 19: a key role player in the invasion of human hepatocellular carcinomas. Gut 63: , Kovacs G, Akhtar M, Beckwith BJ, Bugert P, Cooper CS, Delahunt B, Eble JN, Fleming S, Ljungberg B, Medeiros LJ, Moch H, Reuter VE, Ritz E, Roos G, Schmidt D, Srigley JR, Störkel S, van den Berg E and Zbar B: The Heidelberg classification of renal cell tumours. J Pathol 183: , Banyai D, Banyai D, Sarlos DP, Anetta Nagy A and Kovacs G: Recalling Cohnheim's theory: Papillary renal cell tumor as a model of tumorigenesis from impaired embryonal development to malignant tumors in adults. Int J Biol Sci 14: , Nagy A, Banyai D, Semjen D, Beothe T and Kovacs G: Sciellin is a marker for papillary renal cell tumours. Virchows Arch 467: , Hughson MD, Hennigar GR and McManus JFA: Atypical cysts, acquired renal cystic disease, and renal cell tumors in end-stage dialysis kidneys. Lab Invest 42: , Daha MR and van Kooten C: Is the proximal tubular cell a proinflammatory cell? Nephrol Dial Transplant (6): 41-43, Konda R, Sugimura J, Sohma F, Katagiri T, Nakamura Y and Fujioka T: Over expression of hypoxia-inducible protein 2, hypoxia-inducible factor-1a and nuclear factor kb is putatively involved in acquired renal cyst formation and subsequent tumor transformation in patients with end-stage renal failure. J Urol 180: , Toivola DM, Strnad P, Habtezion A and Omary MB: Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol 20: 79-91, Huang YL, Chen J, Yan W, Zang D, Qin Q, Deng AM: Diagnostic accuracy of cytokeratin-19 fragment (CYFRA 21-1) for bladder cancer: a systematic review and metaanalysis. Tumor Biol 36: , Kolostova K, Rzechonek A, Schützner J, Grill R, Lischke R, Hladik P, Simonek J and Bobek V: Circulating tumor cells as an auxiliary diagnostic tool in surgery. In Vivo 31: , Received July 2, 2018 Revised July 16, 2018 Accepted July 17,

78 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) doi: /anticanres Embryonal Origin of Metanephric Adenoma and its Differential Diagnosis DONAT PETER SARLOS 1, DANIEL BANYAI 1, LEHEL PETERFI 1, ARPAD SZANTO 1 and GYULA KOVACS 1,2 1 Department of Urology, Medical School, University of Pecs, Pecs, Hungary; 2 Medical Faculty, Ruprecht-Karls-University, Heidelberg, Germany Abstract. Background/Aim: The association of Wilms tumor (WT), papillary renal cell tumor (PRCT) and mucinous tubular and spindle cell carcinoma (MTSCC) with embryonal rests has already been documented, but the cellular origin of metanephric adenoma (MA) is not yet known. The aim of this study was to understand their developmental evolution and find diagnostic markers. Materials and Methods: CD57, KRT7, AMACR, SCEL, WT1 and CDH17 expression was analysed by immunohistochemistry in the four types of tumors and the associated pre-neoplastic lesions. Results: Immunohistochemistry was able to differentiate WT, MA, MTSCC and PRCT. A phenotypic correlation between MA and perilobar nephrogenic rest associated with WT was identified. Conclusion: Perilobar nephrogenic rest and MA arise from differentiation arrested cells of the proximal domain of the S-shape body. We propose that WT1, MA, MTSCC and PRCT derive from different forms of maturation arrested embryonal rests. Metanephric adenoma (MA) is an epithelial tumor of the kidney composed of small, uniform, embryonal-looking cells, which are frequently seen in nephrogenic rests (NR) associated with Wilms tumor (WT) (1). Initially it was suggested that MA derives from persistent blastemal cells (2). Following the first description several concepts were published regarding its possible origin. It has been proposed, that the more active malignant WT matures with time into an inactive benign MA (3). Because MA may display a papillary growth pattern and sometimes psammoma bodies, which are characteristic for papillary renal cell tumor (PRCT), it was considered to be a solid variant of PRCT (4). Correspondence to: Gyula Kovacs, Department of Urology, Medical School, University of Pecs, Munkacsy M. u. 2, H-7621 Pecs, Hungary. Tel: , Fax: , g.kovacs@gmx.de; gyula.kovacs@urz.uni-heidelberg.de Key Words: Metanephric adenoma, embryonal origin, nephrogenic rest, CDH17, immunohistochemistry. PRCT is composed by solid, tubular and papillary structures and display the whole spectrum of epithelial differentiation, from small blastema-like cells towards more differentiated epithelial cells. Another kidney tumor, mucinous tubular and spindle cell carcinoma (MTSCC) may also contain small cells growing in solid or papillary formations (5, 6). Because of the latter growth pattern, it was proposed that MTSCC is a variant of PRCT (7). The association of WT, MTSCC and PRCT with NR and pre-neoplastic lesion (PNL) has already been documented, but the origin of MA is not yet known (6, 8, 9). WT, MTSCC and PRCT arise from not fully differentiated cells that may explain their heterogeneous morphology and overlapping phenotype, the latter leading in some cases to differential diagnostic problem. Although the genetic analysis can identify WT, MA, MTSCC and PRCT unequivocally, it does not give information about their cellular origin (5, 6, 10-12). Several antibodies have been proposed to identify WT, MA, MTSCC and PRCT, even those with an overlapping phenotype. It was reported that solid growing PRCT, a mimicry of MA, is positive for KRT7 and AMACR, epithelial predominant WT for WT1 and MA for WT1 and CD57 antibodies (13-15). Recently, CDH17 has been added to this panel as an MA-specific marker (16). The aim of this study was to establish the marker profile of diagnostic importance for the abovementioned tumors by using immunohistochemistry with WT1, CD57, AMACR, KRT7, SCEL and CDH17 antibodies. Moreover, the associated precursor lesions were analyzed to get an insight into their cellular origin and natural history. Materials and Methods Tissue samples. Twelve tri- or biphasic WT including 4 with MAlike areas, and 3 WT with blastemal predominant histological pattern were included. Ten MAs, 9 MTSCCs and 76 papillary RCTs including 18 cases with solid or solid-tubular growth pattern of small blue cells were also subjected to immunohistochemistry. In addition, 9 PLNR, 4 and 10 PNL associated with WT, MTSCC and PRCC, respectively, were examined. Original paraffin blocks of 3 foetal and 3 adult kidneys, WT, MA, MTSCC, PLNR and PNL as 6663

79 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) well as a tissue microarray (TMA) containing multiple core biopsies of 76 PRCT were used for this study. TMA was constructed by one of the authors (GK) as described earlier (9). Immunohistochemistry. For IHC staining 4 µm sections placed onto FLEX IHC microscope slides (DAKO, Glostrup, Denmark) were dewaxed in xylene and rehydrated in graded ethanol. Antigen retrieval was performed by boiling the slides in 10 µm sodium citrate buffer, ph 6.0 in 2100-Retriever (Pick-Cell Laboratories, Amsterdam, The Netherlands). Endogenous peroxidase activity and nonspecific staining were blocked by incubation with 3% hydrogen peroxide containing 1% normal horse serum for 10 min at room temperature. Slides were then incubated overnight at 4 C in moist chamber with rabbit polyclonal anti- CDH17 antibody (NBP , Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) at the dilution of 1:500 and anti SCEL antibody (HPA040154, Sigma Aldrich, Budapest, Hungary) at the dilution of 1:250. HRP conjugated antirabbit secondary antibody (MACH4 Universal HRP-Polymer, Biocare Medical, Concord, CA, USA) was applied for 30 minutes and colour was developed using DAB substrate (DAKO). Tissue sections were counterstained with Mayer's hematoxylin (DAKO) and cover-slipped with Pertex (Medite GmbH, Burgdorf, Germany). In negative controls, the primary antibody was omitted. Tissue sections were also stained with mouse monoclonal anti- KRT7 antibody (OV-TL, M7018, DAKO) at the dilution 1:3000, rabbit monoclonal anti-p504s/amacr antibody (13H4, RM-9130-A, Thermo-Scientific) at 1:150 dilution, mouse monoclonal anti CD57 antibody (NCL-NK1, Leica Novocastra) at 1:100 dilution, mouse monoclonal anti-wt1 antibody (6F-H2, M3561, DAKO) at dilution 1:100, after antigen retrieval at ph6 and ph9, respectively. The IHC was processed in a BOND-MAX Automated IHC/ISH Stainer (Leica Biosystems) and the reaction was visualized by DAB (DAKO). The results were evaluated by scoring as negative or positive, the latter classified according to the percentage of positive cells. Results and Discussion Differentiation between WT, MA, MTSCC and PRCT and their precursor lesion by immunohistochemistry. The immune profile of tumors which are considered to be derived from embryonal remnants (2, 6, 8, 9) is described. The result of immunohistochemistry of tumors as well as the associated precursor lesions are summarized in Table I. The B3GAT1 gene product CD57 has been proposed to be a reliable marker for MA (13, 15). In our study not only MA but also WT, MTSCC and PRCT showed a strong reaction with CD57 antibody, albeit in different percentage of tumor cells. The epithelial components of WTs with MA-like structures have also displayed positive staining for CD57. Our findings confirm the results of two other studies reporting CD57 positivity in MA, WT and PRCT as well (4, 17). The positive CD57 staining in all types of tumor and their precursor lesions exclude CD57 as marker for MA and for its possible cellular origin. WT1, KRT7 and AMACR antibodies differentiated between two groups of tumors and their precursor lesions (Table I). The WT1 antibody showed a positive immune Table I. Immunohistochemistry of WT, MA, MTSCC, PRCT and precursor lesions. Antibodies WT MA MTSCC PRCT PLNR T PNL T PNL T CD57 9/9 15/15 10/10 4/4 7/9 10/10 56/76 WT-1 9/9 12/15 10/10 0/4 0/9 0/10 0/76 CDH17 9/9 0/15 9/10 0/4 0/9 0/10 2/76 KRT7 0/9 0/15 0/10 3/4 6/9 7/10 57/76 AMACR 0/9 0/15 0/10 2/4 8/9 7/10 74/76 SCEL 0/9 0/15 0/10 0/4 0/9 7/10 57/76 WT: Wilms tumor; PLNR: perilobar nephrogenic rest; T: tumor; MA: metanephric adenoma; MTSCC: mucinous tubular and spindle cell carcinoma; PNL: pre-neoplastic lesion; PRCT: papillary renal cell tumor. reaction in 12 of 15 WT, in all perilobar nephrogenic rests (PLNR) and MA. However, none of the 9 MTSCC, 76 PRCC and associated pre-neoplastic lesions (PNL) displayed nuclear staining with WT1. MTSCC and PRCT as well as their PNL were all positive for KRT7 and AMACR. Our data are in line with previous observations showing that both PRCT and MTSCC are positive for KRT7 and AMACR whereas epithelial predominant WT and MA for WT1 (13, 15). Our study revealed that SCEL immunohistochemistry can differentiate between MTSCC and PRCT and associated PNL. Within the first group of tumors CDH17 antibody differentiated between WT and MA. All but one MA but none of the 15 WT expressed the CDH17 protein. Surprisingly, each of the 9 PLNR associated with WT was positive for CDH17 indicating an overlapping phenotype of MA and PLNR (Table I). Expression of CDH17 in normal kidney. This unexpected result prompted us to analyse the expression of CDH17 and also the WT1 in developing kidneys. Foetal kidneys at gestational age of 12 weeks showed a positive staining with CDH17 only in parietal epithelium of Bowman s capsule, but not in the proximal tubules or other structures (Figure 1E). Kidneys of 3-6 months old infants and adults were completely negative. The WT1 was positive in cells of the proximal compartments of the S-shape body, glomerular podocytes and in some parietal cells of Bowman s capsule in kidneys of 12 weeks old foetus (Figure 1F). In infants and adults, a strong nuclear positivity was seen in 50-70% of podocytes. The expression of CDH17 in parietal cells of the Bowman capsule was not expected because it is known to be specifically expressed in gastrointestinal tract and tumors arising from the digestive system including hepatocellular carcinoma (18). CDH17 gene encodes a cadherin-like protein with 7 extracellular cadherin domains and a transmembrane 6664

80 Sarlos et al: Origin of Metanephric Adenoma Figure 1. Immunohistochemistry of CDH17 and WT1. (A) Positive staining with anti-cdh17 antibody in a tubular growing metanephric adenoma. (B) Strong CDH17 immune-reaction in a MA with papillary structures. (C) Expression of CDH17 antibody in tubular growing perilobar nephrogenic rest and (D) WT1-positive staining in a perilobar nephrogenic rests both associated with Wilms tumor. (E) Positive immunoreaction with anti- CDH17 antibody in the parietal epithelium of the Bowman capsule in foetal kidney (arrow). (F) Strong positive staining with the WT1 antibody in the podocytes and parietal cells of the Bowman capsule in a foetal kidney (arrows). region but has no conserved cytoplasmic domain. It has a structural similarity to CDH16, a kidney-specific cadherin, but no expression of CDH17 was seen in adult kidneys. Metanephric adenoma arises from perilobar nephrogenic rest. Termination of nephrogenesis and differentiation of specialized cell types along the nephron is a well-coordinated molecular process controlled by several genes (19). By the S-shaped body stage, expression of WT1 is seen in proximal domain, where there is a distinct separation of cellular morphology between those cells fated to be podocytes and those forming parietal epithelial cells of Bowman s capsule (20). The impaired differentiation of cells of the proximal domain may lead to the development of PL-NR, expressing WT1 and CDH17 (Figure 1C and D), and subsequently to the development of MA. The observation that CDH17 is expressed in PL-NR and MA and in parietal cells of the Bowman s capsule exclusively in foetal kidneys strengthens 6665

81 ANTICANCER RESEARCH 38: (2018) Figure 2. Proposed developmental sequences of WT, MA, MTSCC and PRCT due to embryonal differentiation arrest and results of immunohistochemistry supporting the hypothesis. this suggestion (Figure 1A-C, E). The development of diffuse tubular adenomas replacing both kidneys after a first trimester suicide attempt with aspirin also suggests that diffuse maturation arrest may lead to this alteration (21). Embryonal hyperplasia of the Bowman capsular epithelium (EHBCE) was observed in an infant with germ line WT1 mutations having progressive kidney failure (22). Association of EHBCE with MA has also been reported (23). Hughson et al. observed EHBCE in end stage kidney, which developed during remodelling of kidney structures in adults and therefore, cannot be originated from impaired cellular differentiation during nephron development (24). The presence of CD24- and CD133-positive cells in the epithelium of Bowman s capsule suggests that these cells retain their plasticity throughout life and they may be the source of regeneration of podocytes and also of EHBCE in end stage kidneys of adults (25, 26). Conclusion In this study, immunohistochemistry revealed that different types of embryonal rest may occur. WT is known to be associated with IL-NR and PL-NR. IL-NR is arising due to differentiation arrest at earliest stage of nephron development and has potential to develop different mesenchymal and epithelial structures such as blastemal, stromal and epithelial cells of distinct cellular lineages characteristic for tri- or biphasic WT (8). The PL-NR, however, corresponds to impaired differentiation of primitive epithelial cells at a narrow window of epithelial differentiation, shows a slow but continuous growth and may evolve to MA. Within a PL- NR, hyperplastic lesions (HP-NR) may develop sometimes leading to epithelial form of WT (8). The pre-neoplastic lesions (PNL) associated with MTSCC and PRCT arise after completing the mesenchymal-to-epithelial transition and therefore their potential is limited exclusively to development of epithelial lesions (Figure 2). One of the novel findings of our study is the documentation that, in spite of earlier suggestion (4), MA and PRCT are distinct entities derived from different precursors at different developmental stages of embryonal kidney. Another novel finding is the demonstration of a phenotypic correlation between PL-NR and MA suggesting their common origin from differentiation arrested cells of the proximal domain of S-shape body fated to form the parietal cells of the Bowman s capsule. The finding that all WT including those with MA-like structures were negative for CDH17 antibody staining excludes the possibility that MA is the hyper differentiated benign end of WT spectrum. The specificity of CDH17 staining in the diagnosis of MA was confirmed and was shown that WT1, CDH17, AMACR, KRT7 and SCEL immunohistochemistry can differentiate WT, MA, MTSCC and PRCC. We propose that WT1, MA, MTSCC and PRCC derive from different types of embryonal rest. Conflicts of Interest The Authors have no conflicts of interest to declare. Acknowledgements This work was supported by a grant of PTE-AOK KA The Authors would like to thank Zsuzsanna Halas for preparing the slides and also Judit Szilagyine for helping in the immunohistochemistry. The collection and use of all tissue samples for this study was approved by the Ethics Committee of the University of Pecs, Hungary (No. 5343/2014). References 1 Moch H, Humphrey PA, Ulbright TM and Reuter VE (eds.): WHO Classification of tumours of the urinary system and male genital organs (4th edition). IARC: Lyon, Brisigotti M, Cozzutto C, Fabbretti G, Sergi C and Callea F: Metanephric adenoma. Histol Histopathol 7: ,