Növénynemesítés és génmegőrzés molekuláris genetikai módszerekkel Plant breeding and conservation of genetic resources by molecular methods

Átírás

1 Szőke Antal 1 - Veres Anikó 2 - Kerekes Adrienn 3 - Tóth-Lencsés Kitti 4 - Bedzsó Gabriella 5 - Kozma Pál 6 - Kocsis László 7 - Kiss Erzsébet 8 Növénynemesítés és génmegőrzés molekuláris genetikai módszerekkel Plant breeding and conservation of genetic resources by molecular methods Szoke.Antal@mkk.szie.hu 1 Szent István Egyetem, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő, egyetemi adjunktus 2 Szent István Egyetem, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő, egyetemi docens 3 Szent István Egyetem, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő, PhD hallgató 4 Szent István Egyetem, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő, tanszéki mérnök 5 Szent István Egyetem, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő, PhD hallgató 6 PTE, Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, Pécs, tudományos főmunkatárs 7 Pannon Egyetem, Georgikon Kar, Kertészeti Tanszék, Keszthely, egyetemi tanár 8 Szent István Egyetem, Genetika és Biotechnológiai Intézet, Gödöllő, egyetemi tanár Összefoglalás A DNS polimorfizmusok az evolúció során különböző molekuláris mechanizmusokkal (pl. nukleotid szubsztitúcióval, inszercióval, delécióval) jöttek létre. Az így kialakult szekvencia különbségek kimutatására a szekvenálás adhat közvetlen módszert, de a növénynemesítésben nem mindig van arra szükség, hogy a genomok minden polimorfizmusát egyszerre lássuk. Gyorsabb, költségtakarékosabb közvetett módszerekkel, csak bizonyos régiókra fókuszálva a célorientált polimorfizmusok kimutatása is lehetséges molekuláris markerekkel. A Szent István Egyetem Genetika és Biotechnológiai Intézetében több mint másfél évtizede alkalmazunk molekuláris genetikai markereket szántóföldi és kertészeti növények genotipizálására. A nemesítés során a genetikai markerek nagy segítséget jelenthetnek a megfelelő genotípusok korai szelekciójára, lehetővé teszik a hibridek pedigréjének meghatározását. A génbankokban tárolt és potenciális nemesítési alapanyagokként felhasználható régi, ritka és veszélyeztetett fajták genetikai jellemzésére is egyre nagyobb teret hódítanak az új markerezési technikák. Előadásunkban néhány növény példáján szőlő, karfiol, alma és paradicsom szeretnénk bemutatni a különböző genetikai markerek felhasználási lehetőségeit. Bevezetés A 21. században a növénynemesítésnek számtalan új kihívással kell megbírkóznia. A sokszor szélsőségesen változó klimatikus viszonyok között a növekvő emberiségnek egyre csökkenő termőterületen kell megtermelni a megfelelő mennyiségű és minőségű élelmiszereket. A kultúrnövények genetikailag meghatározott terméspotenciálja miatt a hozamok növelése elsősorban a fajták alkalmazkodóképességének, stresszellenállóságának javításával, illetve hibridek előállításával érhető el. A növénynemesítés azonban viszonylag lassan tud alkalmazkodni a változó piaci igényekhez, mert az elsősorban fenotípusos szelekción alapuló hagyományos módszerekkel egy új fajta előállítása 8-10 évet vesz igénybe. A molekuláris genetika fejlődésével, a genomszekvenálási, géntérképezési és funkcionális genomikai munkák eredményeinek gyakorlati felhasználásával ez az idő a felére csökkenthető. Az adott tulajdonságo(ka)t meghatározó gén(ek)re, kromoszóma részekre specifikus vagy azzal kapcsolt genetikai markerek alkalmazása a nemesítésben egy új, hatékonyabb technika, a marker segített szelekció (MAS Marker Assisted Selection) kifejlesztéséhez vezetett. A MAS legfontosabb előnyei a következőek: Lehetővé teszi a fenofázistól független szelekciót, azaz a keresztezéseket követően a megfelelő genotípusok már csíranövény korban kiválaszthatóak, nincs szükség a teljes keresztezési populáció felnevelésére. Ez csökkenti a költségeket, amely főleg a hosszú 356

2 generációs idejű fajoknál lehet jelentős. A környezettől függetlenek, nem igényli a sokszor bonyolult fenotípusos vizsgálatokat. A kodomináns markerekkel megkülönböztethetőek a homo- és heterozigóta genotípusok is. A molekuláris genetikai markerek felhasználási területe nagyon sokrétű. Alkalmas recesszív, poligénes tulajdonságok, QTL-ek szelekciójára és több gén együttes beépítésére piramidálására. Nélkülözhetetlenek a termesztett növényfajok és természetes populációk diverzitásának felmérésére és megőrzésére. A génbankokban őrzött tételek csak akkor tarthatóak fent változatlan formában és használhatóak fel a későbbi nemesítési munkák alapanyagaként, ha a fenotípusos leírásuk mellett meghatározzuk genetikai ujjlenyomatukat is. A fajták, vonalak, génbanki tételek gyors és hatékony tesztelésével megkönnyíti a nemesítési programok alapanyagául szolgáló genotípusok kiválasztását. Hibridek előállítása során lehetővé teszik a különböző vonalak beltenyésztettségének és genetikai távolságának meghatározását és a maximális heterózis hatás kiaknázása érdekében a legjobban kombinálódó vonalak kiválasztását. A morfológiai markerekkel szemben alkalmasak a fajták pedigréjének meghatározására, eredetvédelmére, a nemesítői jogok biztosítására. A SZIE Genetika és Biotechnológiai Intézetében már több mint 15 éve használunk molekuláris markereket növényfajták szelekciójára, származási vizsgálatokra, fajok, populációk diverzitásának felmérésére, génbanki tételek genetikai ujjlenyomatának meghatározására. Publikációnkban ebből mutatunk be néhány már befejeződött és jelenleg is folyó kutatást. Markerekre alapozott szelekció a rezisztencia nemesítésben A mezőgazdasági termelés egyik legköltségesebb része a növényvédelem. A környezeti vegyszerterhelés csökkentésének és az egészségesebb élelmiszerek előállításának leghatékonyabb módja a rezisztencia nemesítés. A markerekre alapozott szelekció nagymértékben gyorsíthatja a megfelelő rezisztencia-forrásokból származó rezisztenciagének beépítését az értékes, jó minőségű fajtákba. A rezisztenciagénekkel együtt hasadó kapcsolt markerek a vad fajokból származó rezisztenciagének nemes fajtákba történő bevitelének gyorsítása mellett a fajtákban elősegíti kedvező allél-társulások, haplotípusok felfedezését is. A rezisztencia nemesítés folyamán a mesterséges fertőzések sok kórokozó esetében nehezen vagy egyáltalán nem valósíthatók meg, illetve egyes patogének nem tarthatók fenn, mert táptalajon nem szaporíthatóak. A fertőzési tünetek fenotípusos értékelése sokszor hosszadalmas és nehézkes folyamat. A nemesítés során a rezisztencia génekkel szorosan kapcsolt markerek használatával azonban nincs szükség az egyes keresztezési nemzedékek mesterséges fertőzésére, ezt elegendő csak a fajtajelölt esetében elvégezni, ezzel is csökkentve a költségeket. MAS alkalmazása a szőlő lisztharmat elleni rezisztencia nemesítésben A szőlő egyik legveszélyesebb gombabetegsége a lisztharmat. A termesztett szőlő (Vitis vinifera) eredetileg fogékony a kórokozóra. Rezisztenciaforrásként elsősorban vad Vitis fajok alkalmazhatóak, azonban a velük történő keresztezés során egyéb, agronomiailag kevésbé értékes tulajdonságokat is átvihetünk. A Muscadinia (Vitis) rotundifolia egy nagyhatású domináns lisztharmat rezisztenciagént tartalmaz (Run1) (Pauquet et al. 2001), amelyre alapozva Bouqeut (1986) több visszakeresztezett BC 4 és BC 5 nemzedéket állított elő. A PTE Szőlészeti és Borászati Kutató Intézet (Pécs) 1999-ben indított rezisztencia nemesítési programjában ezeket a BC nemzedékeket is felhasználták. A BC 4 és a Cardinal keresztezésével Pécsett előállított és mesterséges fertőzéssel fenotipizált BC 5 nemzedék egyedeit a Run1 génnel kapcsolt GLP1-12P1-P3 CAPS (Donald et al 2002) és a VMC8g9 mikroszatellit (Di Gaspero et al 2000) markerekkel genotipizáltuk (Molnár et al. 2007). A GLP1-12P1-P3 markerre a polimeráz láncreakció során első lépésben mind a rezisztens (R), mind a fogékony genotípusokban (S) egy 870 bp hosszúságú DNS fragmentumot kaptunk (1/A ábra). A PCR terméket az EcoRI restrikciós enzim a fogékony genotípusokban nem emésztette, míg a rezisztensekben egy 200 és egy 670 bp méretű fragmentumot 357

3 eredményezett (1/B ábra). A kapcsolt VMC8g9 mikroszatellit marker esetén a 160 bp nagyságú allél kapcsolt a Run1 génnel, amely a BC 4-en kívül csak a rezisztens genotípusokban amplifikálódott (1/C ábra). 1. ábra: A M. rotundifolia-ból származó Run1 gén markerezése a BC4 x Cardinal hibrid populációban. 1/A: A GLP1-12P1-P3 markerrel a PCR után genotípustól függetlenül egy 870 bp méretű DNS fragmentum szaporodik fel. 1/B: GLP1-12P1-P3 PCR termék EcoRI restrikciós emésztése. A DNS termék a fogékony egyedekben nem emésztődik, míg a rezisztensekben 200 és 670 bp nagyságú fragmentumokat eredményez. 1/C: A VMC8g9 SSR markerre kapott PCR eredménye 3,5%-os metafor gélen történő elválasztást követően. A 160 bp hosszúságú DNS fragmentum kapcsolt a Run1 génnel. M: molekula méret marker, R: rezisztens, S: fogékony egyed, Cd: Cardinal. A nemesítésben egyre fontosabbá válik a tartós rezisztencia kialakítása, amely egy adott kórokozó ellen különböző forrásokból származó rezisztencia géneket épít be piramidál egyetlen genotípusban. A lisztharmat rezisztencia nemesítés másik fontos génforrása lehet az Ázsiából származó Kismis vatkana fajta domináns Ren1 génje (Kozma et al 2006). A génnel több olyan kapcsolt mikroszatellitet azonosítottak, amelyek alkalmasak a markerszelekcióra (Hoffmann et al 2008). A tartós rezisztencia kialakítására Kozma és mtsai a BC 4 és a Kismis vatkana keresztezésével a Run1 és Ren1 rezisztenciagéneket egyetlen genotípusban egyesítették. A keresztezést követően a rezisztencia génekkel szorosan kapcsolt mikroszatellit markerek lehetővé tették a mindkét gént tartalmazó egyedek kiválogatását egyetlen multiplex PCR segítségével. A genotipizálásra azért is szükség van, mert a különböző eredetű lisztharmat rezisztencia géneket hordozó, de azonos fenotípust mutató egyedeket nem lehet egymástól elkülöníteni. A multiplex PCR-re a Run1 génnel kapcsolt VMC8g9 és a Ren1 génnel kapcsolt VMC9h4.2 SSR markereket választottuk ki. A PCR termékeket 4%-os metafor agaróz gélen választottuk szét. A VMC8g9 marker esetén a 160 bp nagyságú allél a Run1, a VMC9h4.2 estén a 286 bp hosszúságú allél a Ren1 gén jelenlétét bizonyította (2. ábra). Azok a genotípusok, amelyek mindkét allélt hordozzák, mindkét rezisztencia gént tartalmazzák. 2. ábra: A VMC8g9 és VMC9h4.2 markerekkel végzett duplex PCR 4%-os Metaphor agaróz gélen elválasztva. M: Molekula méret marker, KV: Kismis vatkana (Run1-/Ren1+), BC4 (Run+/Ren1-), 601: Run1-/Ren1-, 90: Run1+/Ren1+, 6: Run1+/Ren1-, 36: Run1-/Ren1+. A rezisztencia génnel kapcsolt allélokat nyíllal jelöltük 358

4 Molekuláris markerek alkalmazása a paradicsom fonálféreg rezisztencia nemesítésben A gyökérgubacs-fonálféreg (Meloidogyne) fajok veszélyes károsítói a paradicsomnak. Ezek az obligát polifág endoparaziták a gyökereken 1 3 cm nagyságú gubacsokat alakítanak ki, átalakítják a megtámadott sejtek anyagcseréjét. A fertõzött növények hervadnak, vontatottan növekednek, fogékonyabbá válnak más betegségekre. A legfontosabb védekezési mód a rezisztencianemesítés. A védelmet biztosító Mi rezisztencia gént Lycopersicon peruvianum-ból izolálták, amelyet keresztezéssel és az azt követő embriótenyésztéssel építették be a paradicsomba. A fenotípusos szelekció nehézségei miatt a rezisztens genotípusok szelekciójára elsősorban az Mi rezisztencia génnel kapcsolt markerek használhatóak (Williamson et al 1994). Genotipizálási munkánkban a PM3 génspecifikus markert és a kapcsolt CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) REX markereket alkalmaztuk (Szőke et al 2005). A domináns PM3 markerrel végzett PCR a rezisztens genotípusokban az 500 bp méretű DNS szakasz amplifikációjával jelezte az Mi gén jelenlétét, amely hiányzott a fogékony egyedekben (3/A ábra). Mesterséges fertõzéssel és a domináns PM3 marker segítségével a homozigóta és heterozigóta genotípusok nem különíthetõk el. Az Mi gén allélösszetételének vizsgálatára a CAPS módszert használtuk. A REX primerpár genotípustól függetlenül egy 720 bp szakaszt szaporít fel (3/B ábra). A fragmentumot a TaqI restrikciós enzim a fogékony genotípusokban (mi/mi) nem hasítja. Emésztés után a homozigóta rezisztensben 554 bp és 166 bp, a heterozigóta rezisztensben 750 bp, 554 bp és 166 bp hosszúságú DNS szakaszokat kaptunk (3/C ábra). 3. ábra: Az Mi rezisztenciagén kimutatása. A: a PM3 primerpár az 500 bp fragmentumot csak a rezisztens genotípusokban (11, 12, 13, 16, 17, 18, 19) szaporította fel. B: a REX primerpár genotípustól függetlenül restrikciós emésztés előtt egy 720 bp méretű DNS szakaszt szaporít fel. C: a REX primerpárral amplifikált termékek TaqI enzimes hasítás után. A homozigóta fogékony nem emésztődik (10, 14, 15), a homozigóta rezisztensben 554 és 166 bp méretű (11, 12, 16), a heterozigóta rezisztensben (13, 17, 18, 19) 720, 554, 166 bp fragmentumot kaptunk az emésztést követően. M: DNS molekulatömeg marker 359

5 Minőségi tulajdonságok markerekre alapozott szelekciója A termésmennyiségek növelése mellett egyre nagyobb hangsúlyt fektetnek a minőségi tulajdonságok javítására. Ezek a jellegzetességek az eszétikai érték és az organoleptikus tulajdonságok javítása mellett hozzájárulhatnak az egészséges táplálkozáshoz is. A legtöbb minőségi tulajdonság fenotípusos értékelése a tenyészidőszak vége felé végezhető el, illetve a hosszú generációs idejű növények esetén a keresztezést követően a terméssel kapcsolatos tulajdonságok csak 3-5 év múlva értékelhetőek. Ennek az időnek a rövidítésére és a költségek csökkentésére szintén különböző molekuláris markerek állnak rendelkezésre. A bogyószín és a muskotályos íz molekuláris szelekciója szőlőben A bogyók színe és aromája mind a csemege, mind a bor, mind a mazsolaszőlő fajták fontos értékmérője. A mutációk, a természetes és mesterséges szelekció, valamint a tudatos keresztezés hatására e két tulajdonságban is nagyfokú variabilitás figyelhető meg. A színes bogyójú fajták antociánokat halmoznak fel a héjban, amelyek teljesen hiányoznak a fehér fajtákban. Ennek oka az antociánok szintézisének kulcsenzimét - UDPglükóz:flavonoid 3-O-glükoziltranszferáz (UFGT) - szabályozó két Myb transzkripciós faktor független mutációja (VvMybA1, VvMybA2). A VvMybA1 promoterébe a Gret-1 retrotranszpozon inszertálódott és ez gátolja a transzkripciós faktor átíródását és ezen keresztül az UFGT gén expresszióját (Kobayashi et al 2004). A mutáció homozigóta formában fehér bogyószínt eredményez. A VvMybA2 gén kódoló régiójában két olyan pontmutációt találtak, amelyek szintén gátolják az antociánok termelődését (Walker et al 2007; Carrasco et al., 2015). A jellegzetes muskotályos aromát a monoterpének határozzák meg, amelyek nagy mennyiségben vannak jelen a muskotályos fajtákban és jóval kisebb mennyiségben más aromás genotípusokban. A monoterpének bioszintézisének kulcsenzime az 1-deoxi-D-xilulóz-5-foszfát szintáz (DXS) (Duchéne et al 2009). A gén kódoló régiójában több olyan domináns pontmutációt (SNP=Single Nucleotide Polymorphism) azonosítottak, amelyek egymástól függetlenül felelősek a muskotályos íz kialakításáért (Emanuelli et al 2010). 4. ábra: A Nektár x Jacquez keresztezéséből származó utódok bogyószínének (A) és ízének (B) markerszelekciója. M: molekula méret marker marker, 1. Vitis aestivalis, 2. Nektár, 3. Jacquez, 4-6. magoncok, 7. Nektár, 8. Jacquez, 9-12 magoncok. A bogyószín és a muskotályos íz molekuláris szelekciójának lehetőségét a Pannon Egyetem Georgikon Karán a Nektár és a Jacquez keresztezésével előállított utódpopuláción mutatjuk be. A bogyószín markerezésére a VvMybA génekkel kapcsolt 20D18CB9 markert (Walker et al. 2007), a muskotályos jellegére az SNP1822 mutációra tervezett CAPS markert (Emanuelli et al 2014) alkalmaztuk. A 20D18CB9 markerrel a fehér színű Nektár szülőben egy 577 bp, míg a fekete Jacquez szülőben két, 543 (a Vitis aestivalis-ból származó) és 577 bp hosszúságú DNS szakaszt kaptunk. Azok az utódok, amelyek csak a Nektárra jellemző 577 bp DNS fragmentumot tartalmazzák fehér, míg a Jacquez-ra jellemző két fragmentumot hordozók fekete színűek (4/A ábra). A muskotályos ízzel lapcsolt SNP1822 markerrel amplifikált PCR terméket StyI restrikciós enzimmel emésztettük. A Nektárral azonos allélmintázattal rendelkező magoncok feltételezhetően örökölték a muskotályos 360

6 jelleget, míg a Jacquez-val megegyezőek nem (4/B ábra). A marker-fenotípus értékelése azonban csak a magoncok termőre fordulása után erősíthető meg. Színes rózsájú karfiolok marker alapú szelekciója Az antociánokban és karotinoidokban gazdag élelmiszerek nélkülözhetetlenek az egészséges táplákozásban. A lila és a narancsárga színű rózsa kialakulása a transzpozonok által kiváltott és meglehetősen ritka, ún. funkció nyeréses természetes génmutációk csoportjába tartozik. A lila karfiol esetében a Harbinger DNS transzpozon inszertálódott a BoMYB2 transzkripció faktort kódoló (Pr) gén szabályozó régiójába. Ez felelős a gén túlexpresszálódásáért, mivel az inszercióval a promóter régióba két új E-box szabályozó motívum, valamint egy extra TATA-box is került (Chiu et al 2010). A színes rózsájú karfiolok genetikai vizsgálatára RBIP (Retrotransposon Based Insertion Polymorphism) módszert alkalmaztunk, amelyben a PCR primereket egyrészt a retrotranszpozonra, másrészt a gazda DNS-re tervezik. A lila rózsájú karfiolok már a magszín és a csíranövények antociános szineződése alapján felismerhetőek, azonban a retrotranszpozonra hetero- és homozigóta egyedek fenotípusosan nem különböztethetők meg. Az erre alkalmas három primert a génbanki szekvencia (GU219986) alapján terveztük meg (Bedzsó et al. 2012). Ha a BoMYB2 gén promóter régiójába nem integrálódott a DNS transzpozon, a PCR során egy 292 bp méretű terméket kapunk (5. ábra: 1-3 minták). A mutációt homozigóta formában hordozóknál, amely karfiolok rózsája intenzívebb lila egy 464 bp méretű termék szaporodik fel (5. ábra: 4-11 minták). Heterozigóta növények esetében mindkét fragmentumot megkapjuk (5. ábra: minták). 5. ábra: A fehér (1-3), a homozigóta (4-11) és heterozigóta (12-14) lila karfiolok elkülönítése A karfiol narancssárga mutációja esetén egy 4.7 kb méretű retrotranszpozon inszertálódott egy olyan gén (or) harmadik exonjába, amely egyébként nem a karotinoidok bioszintézisében játszik szerepet, hanem a plasztiszok differenciálódásában (Li és Garvin 2003). Olyan három új transzkriptum jelenik meg a gén átírása során, amelyek végső soron a proplasztiszok kromoplasztiszokká alakulását idézik elő, ezáltal új forrást nyitva a karotinoidok szintéziséhez. A fehér, a homo- és heterozigóta narancs genotípusok egyidejű elkülönítésére az or gén szekvenciája alapján (DQ482460) szintén három primert terveztünk (Kiss et al. 2014). Ha a narancs rózsájú karfiol homozigóta Or/Or genotípusú, akkor csak a 817 bp méretű termék szaporodik fel. A vad típus esetében (or/or) egy 605 bp méretű fragmentumot kapunk, míg a mutáns allélt heterozigóta formában hordozóknál (Or/or) mindkét termék felszaporodik (6. ábra). 6. ábra: A fehér (1, 2, 6), a homozigóta (5, 7, 10-12) és heterozigóta (3, 4, 8, 9, 13, 14) narancsszínű karfiolok elkülönítése 361

7 Alma szomatikus mutánsok elkülönítése genetikai markerekkel A fajták egyedi DNS ujjlenyomatánk meghatározásában alkalmazott mikroszatellit markerek általában nem teszik lehetővé a klónok, szomatikus mutánsok egyedi megkülönböztetését, ezért ennek meghatározására más markerrendszerre van szükség. A Jonatán fajtakörbe tartozó rügymutánsok genetikai elkülönítésére az AFLP alapú MSAP módszert próbáltuk ki. A módszer során a genomiális DNS-t az EcoRI és a HpaII/MspI izoskizomer restrikciós enzimpár egyikével emésztjük, amelyek különféleképpen érzékenyek a felismerő helyen található citozin metilációra (Xiong et al 1999). Az emésztett DNS fragmentumokhoz adaptereket ligálunk, majd a PCR-t adapter specifikus, de a genomiális DNS-re szelektív nukleotidokat is tartalmazó primerekkel végezzük el. A PCR termékeket nagy felbontású poliakrilamid gélen válaszjuk el és ezüstfestéssel vizualizáljuk. A technika alkalmazása során eddig egy olyan szelektív primerkombinációt találtunk, amely lehetővé tette a Csányi Jonatán megkülönböztetését a fajtacsoport többi tagjától (7. ábra). 7. ábra: Az EcoRI-HpaII enzimkombinációban az EcoRI-AGC-HpaII/MspI-TCAA szelektív primerekkel kapott PAGE és ezüstfestés eredménye. A nyíllal jelölt helyen a fragmentum hiányzik a Csányi Jonatánban. A: Első ismétlés, B: Második ismétlés. M: molekula méret marker, 1. Jonatán alapfajta, 2. Jonatán M41, 3. Szatmárcsekei Jonatán, 4. Csányi Jonatán, 5. Watson Jonatán. Génbanki tételek, termesztett fajták molekuláris pedigréje, ujjlenyomata A génbankokban őrzött genotípusok megőrzése nélkülözhetetlen feladat a diverzitás fenntartása érdekében; emellett értékes forrásokat jelenthetnek a nemesítés számára. A változatlan formában történő megőrzés, a fajták 362

8 jellemzésének fontos eszközeivé váltak a molekuláris markerek. Az egyedi megkülönböztethetőséget biztosító genetikai ujjlenyomat mellett lehetővé teszik a szinonímák és a homonímák kiszűrését is. A különböző agronómiailag hasznos tulajdonságokkal kapcsolt markerek megkönnyítik a nemesítési alapanyagok kiválasztását. A GENRES CT96 No81 és a GrapeGene06 Eu projektek keretében 115 régi és őshonos kárpát-medencei fajta genetikai ujjlenyomatát határoztuk meg 12 mikroszatellit lokuszban (Halász et al 2005; Galbács et al 2009). A mikroszatellit adatok vonalkóddá alakításával lehetővé vált a fajták egyszerű összehasonlítása is (8. ábra). A vizsgálatokat további magyar nemesítésű fajtákkal is kibővítettük, az eredmények alapján készítettük el a magyar szőlő mikroszatellit adatbázist. 8. ábra: Néhány kárpát-medencei fajta mikroszatellit alapú vonalkódja A rügymutánsok kivételével amelyek egyedül a bogyó színében különböznek egymástól valamennyi fajtánál egyedi allélmintázatot kaptunk. Ezek elkülönítésére a bogyószín molekuláris szelekciójánál már bemutatott VvMybA1 és VvMybA2 allélspecifikus primereket használtunk (Bodor & Szőke et al 2014; Kerekes et al 2015). A VvMybA1 specifikus markerek lehetővé tették a különböző színű Lisztes, Muskotály és Furmint fajták megkülönböztetését (9. ábra). 9. ábra: A szőlő rügymutánsok elkülönítése VvMybA1 allélspecifikus primerekkel. M: Molekulatömeg marker, 1. Barbera, 2. Pinot noir, 3. Chardonnay, 4. Lisztes piros, 5. Lisztes fehér, 6. Bakator piros, 7. Bakator tüdőszínű, 8. Gohér piros, 9. Gohér fehér, 10. Gohér változó, 11. Piros muskotály, 12. Fekete muskotály, 13. Sárga muskotály, 14. Csíkos muskotály, 15. Furmint piros, 16. Furmint fehér, 17. Furmint változó, 18. Kék barátcsuha, 19. Szürke barátcsuha A szőlőfajták mellett 66 kereskedelmi forgalomban lévő almafajta genetikai jellemzését is elvégeztük 6 SSR lokuszban (Galli et al 2005), az adatokból készítettük el a magyar alma mikroszatellit adatbázist. A genotipizálási munkákat jelenleg szilva, cseresznye, meggy, kajszi és őszibarack fajtákon végezzük. 363

9 Irodalom Bedzsó G, Szőke A, Katuláné Debreceni D, Galli Zs, Komjáthy L, Kiss E. (2012): Domináns és kodomináns molekuláris markerek fejlesztése és gyakorlati alkalmazása a lila mutációra karfiolban. Kertgazdaság. 44(4): Bodor P, Szoke A, Toth-Lencses K, Veres A, Deak T, Kozma P, Bisztray GD, Kiss E (2014): Differentiation of grapevine (Vitis vinifera L.) conculta members based on molecular tools. Biotechnology & Biotechnological Equipment 28(1): Bouquet A. (1986): Introduction dans l espece Vitis vinifera L. d un caractere de resistance a l oidium (Uncinula necator Schw. Burr) issu l espece Muscadinia rotundifolia (Michx.) Small. Vignevini 12 (suppl): Carrasco D, De Lorenzis G, Maghradze D, Revilla E, Bellido A, Failla O, Arroyo-Garcia R. (2015): Allelic variation in the VvMybA1 and VvMybA2 domestication genes in natural grapevine populations (Vitis vinifera subsp. sylvestris). Plant Syst. Evol. 301: Chiu LW, Zhou X, Burke S, Wu X, Prior LR., Li L. (2010): The purple cauliflower arises from activation of a 2. MYB transcription factor. Plant Physiology, 54: Di Gaspero G, Cipriani G, Adam-Blondon AF, Testolin R. (2007): Linkage maps of grapevine displaying the chromosomal locations of 420 microsatellite markers and 82 markers for R-genes candidates. Theor. Appl. Genet. 114: Donald TM, Pellerone F, Adam-Blondon AF, Bouquet A, Thomas MR, Dry IB. (2002): Identification of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapevine. Theor. Appl. Genet. 104: Duchéne E, Butterlin G, Claudel P, Dumas V, Jaegli N, Merdinoglu D. (2009) A grapevine (Vitis vinifera L.) deoxy-d-xylulose synthase gene colocates with a major quantitative trait loci for terpenol content. Theor. Appl. Genet. 118: Emanuelli F, Sordo M, Lorenzi S, Battilana J, Grando MS. (2014): Development of user-friendly functional molecular markers for VvDXS gene conferring muscat flavor in grapevine. Molecular Breeding. 33: Galbács Zs, Molnár S, Halász G, Hoffmann S, Kozma P, Kovács L, Veres A, Galli Zs, Szőke A, Heszky L, Kiss E. (2009): Identification of grapevine cultivars using microsatellite-based DNA barcodes. Vitis 48: Galli Zs, Halász G, Kiss E, Heszky L, Dobránszky J. (2005): Molecular identification of commercial apple cultivars with microsatellite markers. HortScience 40(7): Halász G, Veres A, Kozma P, Kiss E, Balogh A, Galli Zs, Szőke A, Hoffmann S, Heszky L (2005): Microsatellite fingerprinting of grapevine (Vitis vinifera L.) varieties of the Carpathian Basin. Vitis 44: Hoffmann S, Di Gaspero G, Kovács L, Howard S, Kiss E, Galbács Zs, Testolin R, Kozma P. (2008): Resistence to Erysiphe necator in the grapevine Kishmish vatkana is controlled by a single locus through restriction of hyphal growth. Theor. Appl. Genet. 116: Kerekes A, De Lorenzis G, Szőke A, Kiss E, Failla O. (2015): Analysis of VvMybA1 and VvMybA2 genes in grape bud sports. Vitis 54(Special Issue): Kiss E, Liszt B, Szőke A, Debreceni D, Kerekes A, Heszky L, Galli Z (2014): Kodomináns marker fejlesztése és tesztelése a karfiol narancssárga mutációjára. Kertgazdaság 46(3): Kobayashi S, Goto-Yamamoto N, Hirochika H. (2004): Retrotransposon induced mutations in grape skin colours. Science. 304:

10 Kozma P, Kiss E, Hoffmann S, Galbács Zs, Dula T. (2006): Using the powdery mildew resistant Muscadinia rotundifolia and Vitis vinifera cv. Kismis vatkana for breeding new cultivars. 9th Internatinal Conference on Grape Genetics and Breeding. Udine, Italy Book of abstracts, p Li L, Garvin DF.(2003): Molecular mapping of Or, a gene inducing beta-carotene accumulation in cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis). Genome. 46: Molnár S, Galbács Zs, Halász G, Hoffmann S, Kiss E, Kozma P, Veres A, Galli Zs, Szőke A, Heszky L. (2007): Marker assisted selection (MAS) for powdery mildew resistance in a grapevine hybrid family. Vitis 46: Pauquet J, Bouquet A, This P, Adam-Blondon AF. (2001) Establishment of a local map of AFLP markers around the powderly mildew resistance gene Run1 in grapevine and assement of their usefulness for marker assisted selection. Theor. Apple. Genet. 103: Szőke A, Kiss E, Milotay P, Szabó-Hevér Á, Heszky L. (2005): Molekuláris markerek alkalmazása a paradicsom fonálféreg-rezisztencia nemesítésben. Kertgazdaság. 37(3): Walker AR, Lee E, Bogs J, McDavid DAJ, Thomas MR, Robinson S. (2007) White grape arose through the mutation of two similar and adjacent regulatory genes. Plant J. 63: Williamson VM, Ho JY, Wu FF, Miller N, Kaloshian I. (1994): A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene, Mi in tomato. Theor. Appl. Genet. 87: Xiong LZ, Xu CG, Maroof S, Zhang Q. (1999): Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique. Mol Gen Genet (1999) 261: A kutatásokat a SZIE MKK Kutató Kari Kiválósági Támogatás /2016/FEKUT támogatta. 365