Algaközösségek ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitásának vizsgálata

Átírás

1 Algaközösségek ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitásának vizsgálata Duleba Mónika Környezettudományi Doktori Iskola II. évf. Témavezető: Dr. Ács Éva

2 Előzmények Pályázat - Pannon ökorégió 9 jellegzetes, szárazföldi, vízi, vizes élőhelyének kevéssé zavart és zavart változatának ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitásának meghatározása része: eukarióta alga-közösségek Zavarás bióta válasza közösséget alkotó fajok adaptációs képességétől genetikai diverzitástól függ A közösség-szintű diverzitás felmérésének alapja a fajok egyértelmű megkülönböztetése

3 Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

4 Kiválasztott fajok: Skeletonema potamos A Skeletonema genus egyetlen édesvízi faja; Skeletonema subsalsum (ritkán) A Duna nyári fitoplanktonjának meghatározó tagja Filogenetikai helyzete nem tisztázott

5 Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

6 Anyag és módszer Skeletonema specifikus (szennyezés miatt) primerek tervezése 4 génre (filogenetikai információ) rbcl - Plasztiszban: psbc trnk ycf12 ycf9 ~1100bp Sejtmagban: 18S rdns 28S rdns ITS1 5,8S ITS2 ~950bp ~1100bp

7 Anyag és módszer Mintavétel: Duna (Göd) június Tenyésztés nehéz Sejtek izolálása - mikromanipulátor DNS-izolálás (kevés sejt, törékeny váz!) (semi)nested PCR szekvenálás illesztés törzsfa

8 Eredmények 18S rdns törzsfa (neighbour joining módszer, maximum composite likelihood szubsztitúciós modell, gamma eloszlás, bootsrap, 500 ism.) Stephanodiscus minutulus Stephanodiscus hantzschii Cyclostephanos invisitatus Cyclotella bodanica Cyclotella ocellata Discostella pseudostelligera Detonula pumila Thalassisiosira angustelineata 77 Thalassiosira nodulolienata 64 Minidiscus trioculatus Bacterosira bathyomphala 29 Shionodiscus ritscheri Thalassiosira oceanica Skeletonema menzellii Skeletonema potamos Skeletonema pseudocostatum CCAP I 46 Skeletoenma pseudocostatum CCAP B 97 Skeletonema subsalsum Skeletonema costatum NB A Skeletonema costatum NB02 45 A Skeletonema japonicum Skeletonema grethae CCAP Skeletonema costatum CCAP Skeletonema costatum CCAP Cyclotella meneghiniana LS03 01 Cyclotella striata 100 Thalassiosira pseudonana ETC1 100 Thalassiosira pseudonana CCMP1057 Porosira pseudodenticulata Lauderia annulata 0.01

9 Eredmények 28S rdns törzsfa (neighbour joining módszer, maximum composite likelihood szubsztitúciós modell, gamma eloszlás, bootsrap, 500 ism.) Stephanodiscus minutulus Stephanodiscus hantzschii Cyclostephanos invisitatus 49 Cyclotella ocellata 99 Cyclotella bodanica 17 Discostella pseudostelligera Shionodiscus ritscheri Bacterosira bathyomphala Detonula pumila Minidiscus trioculatus Thalassiosira nodulolineata Thalassiosira angustelineata Skeletonema subsalsum Skeletoenema potamos Skeletonema costatum Skeletonema menzelii 99 Skeletonema japonicum Skeletonema pseudocostatum Skeletonema grethae Cyclotella stylorum Cyclotella meneghiniana LS Thalassiosira pseudonana ETC1 100 Thalassiosira pseudonana CCMP1057 Thalassiosira oceanica Porosira pseudodenticulata Lauderia annulata 0.05

10 Eredmények Stephanodiscus minutulus Stephanodiscus hantzschii psbc törzsfa Cyclostephanos invisitatus Cyclotella ocellata Cyclotella bodanica (neighbour joining módszer, maximum composite likelihood szubsztitúciós modell, gamma eloszlás, bootsrap, 500 ism.) Discostella pseudostelligera Thalassiosira nodulolineata Minidiscus trioculatus Bacterosira bathyomphala Thalassiosira angustelineata Shionodiscus ritscheri Detonula pumila Thalassiosira pseudonana ETC1 100 Thalassiosira pseudonana CCMP Skeletonema subsalsum Skeletonema potamos 98 Skeletonema menzellii Skeletonema costatum Skeletonema japonicum Skeletonema pseudocostatum Skeletonema grethae CCAP Skeletonema grethae CCAP Thalassiosira oceanicia Lauderia annulata 99 Porosira pseudodenticulata Cyclotella stylorum 98 Cyclotella meneghiniana LS

11 Eredmények Fa kalibrálása fosszilis adatok alapján: Stephanodiscus megjelenése: min. 5 Mév (Sim et al., 2006) Pinnularia megjelenése: min. 40 Mév (Souffreau et al., 2011) Pinnularia borealis megjelenése: min. 13 Mév (Souffreau et al., 2011) Skeletonema subsalsum - S. potamos ág leválása: min. 8,4 Mév (18S rdns), min. 1,9 Mév (28S rdns) S. subsalsum és S. potamos elválása: min. 5,1 Mév (18S rdns), min. 0,84 Mév (28S rdns) mindhárom gén konszenzus fa kell

12 6.0 P_borealis_v_subislandica Stephanodiscus_hantzschii Skeletonema_grethae Cyclotella_ocellata Thalassiosira_oceanica Pinnularia_viridis Stephanodiscus_minutulus_Y95_6 Porosira_pseudodenticulata Cyclostephanos_invisitatus Sellaphora_blackfordensis Thalassiosira_nodulolineata Skeletonema_potamos Skeletonema_subsalsum Skeletonema_costatum_CCAP1077_4 Skeletonema_costatum_NB02_45_A Skeletonema_pseudocostatum_CCAP1077_7_B Skeletonema_costatum_NB02_45_2A Lauderia_annulata Skeletonema_japonicum Skeletonema_menzellii Pinnularia_nodosa Thalassiosira_angustelineata Discostella_pseudostelligera Stephanodiscus_minutulus_Y98_1 Skeletonema_pseudocostatum_CCAP1077_7_I Stephanodiscus_neoastraea P_borealis_Tor12d P_borealis_Alka1 Porosira_glacialis Skeletonema_costatum_CCAP1077_3 5, ,7507 1, , , , ,3048 5,0399 0,7904 5,9043 0,6204 2, , , ,0092 8,0074 0,8561 1,4519 1, ,2647 8,8008 1, ,1875 8,4008 3,9658 4, , ,8743 6, S rdns törzsfa elválási időkkel (max likelihood, GTR, gamma)

13 5.0 Cyclotella_ocellata Stephanodiscus_hantzschi Thalassiosira_angustelineata Stephanodiscus_minutulus_Y98 Skeletonema_menzellii Skeletonema_costatum_c Porosira_glacialis Stephanodiscus_neoastraea Pinnularia_nodosa Thalassiosira_angulata Pinnularia_borealis_Tor12d Shionodiscus_ritscheri Porosira_pseudodenticulata Stephanodiscus_minutulus_Y95 Pinnularia_viridiformis Skeletonema_japonicum Skeletonema_grethae Lauderia_annulata Cyclostephanos_invisitatus P_borealis_v_subislandica Skeletonema_pseudocostatum Cyclotella_bodanica Skeletonema_potamos Thalassiosira_oceanica Pinnularia_borealis_Alka1 Thalassiosira_nodulolineata Lauderia_undulatum Sellaphora_blackfordensis Skeletonema_subsalsum 0, , ,5671 5, , ,1482 0,8101 1,9682 8,1733 8,8268 2,306 16,6414 0,2537 7,5164 1, , ,8615 3, ,0913 3,2729 0, , ,613 45,3828 4, , ,7158 4, S rdns törzsfa elválási időkkel (max likelihood, GTR, gamma)

14 Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

15 Kiválasztott fajok: Cyclotella ocellata Sokféle élőhelyen előfordul, gyakori faj ÁLLÓVÍZI ELŐFORDULÁSOK FOLYÓVÍZI ELŐFORDULÁSOK

16 Cyclotella ocellata Változatos morfológia (méret, valvafelszín) ocellum fultoportula Cyclotella trichonidea?

17 Cyclotella ocellata Gyakran fordul elő együtt a más Cyclotella fajokkal, melyek filogenetikai Cyclotella comensis (=Cyclotella pseudocomensis; Scheffler&Morabito, 2003) helyzete nem ismert Cyclotella radiosa Cyclotella balatonis

18 legtöbb Cyclotella faj A Cyclotella genus nem monofiletikus (Alverson et al., 2007) Cyclotella ocellata (LB8) és C. bodanica

19 Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

20 Mintavételi helyek Hegyeshalom Mályi Nyékládháza Dunaharaszti Alsóörs Bugyi + Horvátország (C. trichonidea?)

21 Módszerválasztás Rokon fajok vizsgálata Kriptikus fajok kimutatása Minta-közösség (~Thalassiosirales) Klónozás, de ismeretlen szekvenciák (kevés ismeretlen faj legyen a mintában) 18S rdns, 5,8SrDNS+ITS2, cox1 Minta-populáció (morfológiailag egy faj) Egyeden + populáción belüli polimorfizmus Populációgenetika Minta-populáció (morfológiailag egy faj) 18S rdns, 5,8SrDNS+ITS2, cox1 Minta-egy sejt ( egy sejt PCR ) Egyeden populáción belüli polimorfizmus ITS1, ITS2, Sig1?, SIT1-3? Mikroszatellita (primer?) (AFLP fajspecifikusság?) Haploid markerek rbcls intergenikus régió hosszpolimorfizmusa

22 Módszerek Genetikai vizsgálatok: Sejtek izolálása mikromanipulátorral Tenyésztés - Minta - populáció szükséges sejtmennyiség? élő sejtek (1x PBS) Lugol - Alkohol (96%) ( ) DNS-kinyerés (fagyasztás, főzés, centrifugálás) Fenol-kloroform ( ) Minta - 1 sejt szükséges mintamennyiség? 1 sejt PCR? minta nem ismételhető; felszaporítani teljes genomot Morfológiai vizsgálatok: SEM + morfometria

23 Összefoglalás Skeletonema potamos filogenetikai helyzetének meghatározása Pontosítás: hosszabb szakaszok; az elválás idejének meghatározásához több fosszilis adat; mind3 gén konszenzus fa Cyclotella ocellata (és vele együtt előforduló Cyclotella fajok) módszerek kiválasztása és beállítása fajok elválasztásához ill. populációk közti különbségek feltárásához

24 Publikáció, konferencia Pohner, Zs., Ács, É., Borsodi, A., Kiss, K. T., Palatinszky, M., Reskóné N. M., Várbíró, G., Mészáros, É., Duleba, M., Bíró, P. (2011): Bevonatban élő mikroba-közösségek genetikai diverzitásának összehasonlítása a Balaton két eltérő trofitású medencéjében. Hidrológiai Közlöny 91/6: Duleba, M., Ács, É., Borsodi,A., Kiss, K.T., Palatinszky, M., Pohner, Zs., Reskóné, N.M., Várbíró, G., Bíró, P. : Comparison of the diatom biota and the whole benthic communities of Lake Balaton. European Journal of Phycology, 5th European Phycological Congress, Rhodes, Greece 2011, 46: 166. Pohner, Zs., Duleba, M., Kiss, K.T., Ács, É.: Preliminarily studies of inter- and intraspecific genetic polymorphism of two Thalassiosirales species. European Journal of Phycology, 5th European Phycological Congress, Rhodes, Greece 2011, 46: 185.

25 Köszönöm a figyelmet!

26 - 2. elektroforézis (gél, kapilláris) + 3. detektálás: DNS-festék, jelölt primer AFLP amplifikált fragmenthossz polimorfizmus

27 Balaton bentikus mikrobiális közössége korábbi mikroszkópos kovaalga-vizsgálat kiegészítése a teljes bakteriális és eukarióta közösség molekuláris biológiai vizsgálatával 16S és 18S rdns DGGE Bakteriális közösség: északi és déli part elválása, Siófoki-medencében legmagasabb a diverzitás (alacsony trofitás), Eukarióta közösség: aljzat szerinti elválás, kő legalacsonyabb diverzitású Szekvenciák (kovaalga, fonalféreg, poloska)

28 Multiple displacement amplification Lizált sejtek Hexamer primerek módosított 3 vég Polimeráz 3 5 exonukleáz aktivitással 1. Primerek kötődése a denaturált DNS-szálakhoz 2. Lánchosszabbítás az újonnan szintetizált, kettős szálú DNS eléréséig, majd kezdi kiszorítani az új szálat elágazás 3. A primerek az újonnan szintetizált szálra kötődnek 4. Lánchosszabbítás az újonnan szintetizált szálon