Készítette: Dr. Ács Éva Kutatóhelyi témavezető

Átírás

1 Dunakutató Intézet részjelentése a A veszélyeztetett biodiverzitás megőrzése a Pannon ökorégióban: az ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitás értékelése szentély jellegű és emberi tájhasználatnak kitett élőhelykomplexekben c. OTKA-NKTH pályázat keretében a pályázat első évében (2010 április március 31) végzett munkákról Készítette: Dr. Ács Éva Kutatóhelyi témavezető A pályázat keretében zajló genetikai diverzitás-vizsgálatok két fő kérdéscsoport megválaszolását célozzák meg. Az egyik faj fölötti, míg a másik faj alatti szinten kíván detektálni genetikai polimorfizmust több különböző taxon esetében. Az egyes taxonok filogenetikailag igen távol állnak egymástól (kovaalga, kagyló, kétéltű, hüllő), ezért ugyanazon kérdés megválaszolásához merőben eltérő genetikai markerre, illetve módszerre lehet szükség. A megfelelő eljárások kiválasztásánál emellett fontos szempont a megvalósíthatóság a hozzáférhető eszközpark figyelembevételével, valamint a költséghatékonyság. A kutatás szerteágazó mivolta miatt az egyes témakörökben elérhető, eddig megjelent tudományos eredmények alapos áttanulmányozása rendkívüli jelentőségű a további lépések megalapozását illetően. A faj fölötti genetikai polimorfizmus kérdése egy taxon esetében merült fel, itt egy kovaalga faj filogenetikai helyzetének meghatározása a cél. A Skeletonema potamos (Bacillariophyta, Thalassiosirales) az egyetlen olyan tagja a Skeletonema genusnak, amely kizárólag édesvízben fordul elő, magyarországi folyóvizekben, a Dunában és a Tiszában is megtalálható. A Thalassiosirales rend rokonsági viszonyait a közelmúltban rekonstruálták sejtmagi és kloroplasztisz markerek alapján (Alverson et al. 2007), így feltárva az édesvízi és tengeri fajok filogenetikai helyzetét, azonban ez a szervezet nem szerepelt a vizsgált fajok között. A Skeletonema genus többi, tengeri tagja egy monofiletikus kládba csoportosul, amely viszonylag távol helyezkedik el a rend más, édesvízi genusaitól. A nagyobb csoportok szétválasztására alkalmas genetikai markernek bizonyultak a sejtmagban található riboszómális RNS gének (18S rdns, 28S rdns), míg faji szinten a kloroplasztiszban kódolt fotoszintetikus fehérjék génjei (rbcl, psbc) nyújtottak kellő felbontást. A publikációban leírt markerek szekvencia-analízise segítségével a S. potamos filogenetikai helyzete meghatározható, és eldönthető, hogy a többi Skeletonema fajjal, vagy más genusok édesvízi tagjaival áll-e közelebbi rokonságban.

2 A másik kérdéscsoport 4 különböző taxonba tartozó faj populációi közti és azon belüli genetikai diverzitásának feltárását célozta meg, mely nagyobb felbontású genetikai markerek használatát igényli. A vizsgálatnak alávetett fajok a következők: Cyclotella ocellata (Bacillariophyta), Unio crassus és Pseudoanodonta complanata (Bivalvia), Triturus dobrogicus (Caudata), illetve Zootoca vivipara (Squamata). Minden élőlénycsoport esetében az irodalomban fellelhető, a fenti célra alkalmazható genetikai markerekkel kapcsolatos információk összegyűjtése nagyrészt lezajlott. A korábban leírt, különböző markerekre specifikus primerek összegyűjtése és in silico tesztelése, illetve az adatbázisokban szereplő egyes markerek nukleotid-szekvenciái alapján új primerek tervezése folyamatban van. Az összehasonlítandó populációk minden taxon esetében zavarásmentes, illetve zavarásnak kitett élőhelyekről egyaránt származnak, a minták gyűjtése elkezdődött, és folyamatosan zajlik. A számos különböző típusú minta megkívánta a mintavétel, a tartósítás, illetve a DNS-izolálási módszerek költség-hatékony módon történő optimálását. Mivel a vizsgálandó állatfajok védettek, további szempont olyan mintavételi eljárások kidolgozása, melynek során elkerülhető az egyed elpusztítása, illetve a lehető legkisebb stresszt jelenti az állat számára. Az elevenszülő gyík esetében a farokból kis mennyiségű szövet eltávolítása, illetve a ledobott farok begyűjtése az optimális módszer. A dunai gőte esetében a tarajból, illetve a farokból kis mennyiségű szövet eltávolítása viszonylag csekély mértékű stresszt okoz az állat számára. Ezen minták tartósítására a 96%-os, analitikai tisztaságú alkohol megfelelőnek bizonyult. Ezen két élőlény esetében alternatív módszer a száj-nyálkahártyából steril vattapálcával történő kenetvétel (Pidancier et al. 2003). A minták tárolására a foszfát-puffer, a lízis-puffer, illetve a 96%-os etil-alkohol egyaránt alkalmasnak bizonyult. A két kagylófaj esetében μl haemolympha vétele steril tűvel még nem okoz maradandó károsodást az állat számára (Geist et Kuehn 2005). Mivel a védett területeken való gyűjtéshez az engedélyt év végén kaptuk meg, így csak archív kagylóminták álltak rendelkezésre, ez esetben a módszer tesztelésére a közeljövőben kerül sor, amint az élő állatok begyűjtése lehetővé válik. A két kovaalga-faj esetében nehézséget jelent a megfelelő feldolgozási módszer kifejlesztése, melynek segítségével olyan minta állítható elő, amely kizárólag a vizsgálni kívánt faj egyedeit tartalmazza. Az egyik lehetőség, hogy fénymikroszkóp alatt mikromanipulátorral kiválogatjuk az adott faj tartósított, vagy élő egyedeit, azonban ez a technika sem képes kizárni, hogy egyéb sejtek is a mintába kerülnek. Kis százalékban ezek a minták más eukarióta sejteket, esetlegesen más kovaalgákat is tartalmazhatnak. További nehézséget jelent, hogy a módszer időigényessége mellett is csak rendkívül kis mennyiségű

3 mintát eredményez ( db sejt), mely nem feltétlenül elegendő a hatékony DNSizoláláshoz. Ezen problémák kiküszöbölése céljából párhuzamosan elkezdődtek kísérletek a vizsgálandó fajok tenyésztésbe vonására. Tiszta tenyészet előállítása szintén problémákba ütközik a kovaalgák esetében, a kevésbé zavaró baktériumszennyezés mellett könnyen túlnőhetik a kívánt fajt más eukarióta szervezetek. Amennyiben a zavaró hatásokat lehetőség szerint sikerül minimalizálni, a tenyésztés előnye, hogy olyan minta állítható elő egy-két sejtből, vagy egy adott populációból, amely nagy százalékban a kívánt faj egyedeit tartalmazza, és a sejtszám elegendően nagy a hatékony DNS-izoláláshoz. Feltételezhetően azonban a tenyésztés során az eredeti genotípus-gyakoriság értékek torzulnak, így ez az eljárás populációk diverzitásának feltárására kevésbé alkalmas. A tenyésztett törzsek jól felhasználhatóak azonban olyan, kisebb variabilitású markerek azonosításához, melyek szekvenciája jelenleg hiányzik az adatbázisokból, illetve új, fajspecifikus primerek ellenőrzéséhez. Minden különböző mintatípus esetében megkerestük, illetve optimáltuk és teszteltük azt a DNS-izolálási módszert, amely a lehető legkisebb költséggel jó minőségű, a további applikációkat gátló anyagoktól mentes DNS kinyerésére alkalmas. Amennyiben rendelkezésre állt archivált minta korábbi mintavételekből, a teszteléseket azokon is elvégeztük. A hagyományos fizikai + enzimatikus sejtfeltárás fenol-kloroformos tisztítási lépéssel kombinálva a legtöbb esetben alkalmas DNS-izolálási eljárásnak bizonyult, a mintatípusoknak megfelelő kisebb módosításokkal. Azokból a mintákból (U. crassus, nagy mennyiségű algasejt-keverék), amelyek tartósítószere bármilyen %-ban formalint tartalmazott, nem volt kinyerhető DNS ezzel a módszerrel, a kiindulási minta típusától és mennyiségtől függetlenül. A formalin-oldat azonban minden mintatípus esetében helyettesíthető alkohol-keverékkel, illetve 96%-os etil-alkohollal. A DNS-izolálás hatékonyságát úgy ellenőriztük, hogy a 18S rdns egy szakaszát specifikus primerekkel felszaporítottuk, és amennyiben kaptunk PCR-terméket, a költségminimalizálást szem előtt tartva minden mintatípusból 1-1 példányt szekvencia-analízisnek vetettük alá, majd a GeneBank adatbázissal összevetve megkerestük a legközelebbi rokon fajt a BLASTn algoritmus segítségével. Zootoca vivipara esetében 4 egyed archív, alkohol-keverékben tárolt minta farokszövetéből sikerült DNS-t kinyerni, a szekvencia-analízis jó minőségű, tiszta szekvenciát eredményezett, amely a legnagyobb hasonlóságot az adatázisban fellelhető legközelebbi rokon faj bázissorrendjével mutatta.

4 Triturus dobrogicus esetében egy élő egyedből történt mintavétel száj nyálkahártyáról, illetve bőrfelszínről steril vattapálcával, több párhuzamosban. Egy-egy mintát foszfátpufferben, lízis-pufferben, illetve 96%-os etil-alkoholban tároltuk órán át 4 C-on, és mindhárom eljárás alkalmasnak bizonyult a DNS-izolálás szempontjából, de a legerősebb PCR-terméket a lízis-pufferben tárolt minta eredményezte. A szekvencia-analízis a száj nyálkahártya-mintából tiszta szekvenciát eredményezett, amely a legnagyobb hasonlóságot az adatázisban fellelhető legközelebbi rokon faj bázissorrendjével mutatta. A bőrfelszíni kenet azonban enyhén kevert szekvenciát eredményezett, amely a legnagyobb hasonlóságot egy édesvízi, mikroszkopikus gyűrűsféreg-fajjal adta, tehát ez a módszer nem bizonyult alkalmazhatónak. A további minták terepi gyűjtése megkezdődött, feldolgozásuk folyamatosan zajlik. Unio crassus esetében a formalinban fixált, és később alkohol-keverékbe helyezett archív minta nem bizonyult alkalmasnak DNS kinyerésére, a kizárólag alkohol-keverékben tárolt egyedből azonban sikeresen izoláltunk DNS-t. A szekvencia-analízis jó minőségű, tiszta szekvenciát eredményezett, amely a legnagyobb hasonlóságot az adatázisban fellelhető legközelebbi rokon faj bázissorrendjével mutatta. A két kovaalga-faj esetében a rendkívül kis kiindulási mintamennyiség megnehezíti a hatékony DNS-kinyerést, ezért esetükben a módszer optimálása folyamatban van. A populációk közti, illetve esetlegesen azokon belüli diverzitás feltárásához variábilis, kellő felbontást biztosító genetikai markerekre van szükség. Ezek elméleti kiválasztása is megtörtént mindegyik vizsgálandó élőlénycsoport esetében. A nagy tó komplex élőhely vizsgálata során a Balaton két eltérő trofitású medencéjében (Keszthelyi és Siófoki) a különböző alzatokon kialakult mikroba-közösségek szerkezetét vizsgáltuk mikroszkópos és molekuláris módszerekkel. Az eukarióta-, illetve baktériumközösségek DGGE analízisét Ingeny PhorU készülékben végeztük. Az eukarióta- és bakteriális diverzitás egyaránt magasabb értékeket ért el júniusban, mint augusztusban a legtöbb minta esetében (1.ábra). A Keszthelyi-medencében diverzebb eukarióta közösséget találtunk (több eukarióta operatív taxonómiai egységet {(OTU-t} mutattunk ki, mint bakteriális csoportot, ez a tendencia a Siófoki-medencében fordított volt. Idézett irodalom Alverson, A., J., Jansen, R., K., Theriot, E., C., Bridging the Rubicon: Phylogenetic analysis reveals repeated colonizations of marine and fresh waters by thalassiosiroid diatoms. Molecular Phylogenetics and Evolution 45:

5 Geist, J., Kuehn, R., Genetic diversity and differentiation of central European freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera L.) populations: implication for conservation and management. Molecular Ecology 14: Pidancier, N., Miqel, C., Miaud, C., Buccal swabs as a non-destructive tissue sampling method for DNA analysis in amphibians. Herpetological Journal 13: A pályázat témaköréből megtartott előadások: Pohner Zsuzsanna, Ács Éva, K. Borsodi Andrea, Kiss Keve Tihamér, Palatinszky Márton, Reskóné Nagy Mária, Várbíró Gábor, Bíró Péter: Bevonatban élő mikrobiális közösségek genetikai diverzitásának összehasonlítása a Balaton két eltérő trofitású medencéjében. - LII. Hidrobiológus Napok Tihany, október 6-8. Pohner Zs., Bódis E., Duleba M., Kiss K. T., Puky M., Ács, É.: Alga-, kagyló-, kétéltű- és hüllőfajok genetikai diverzitásának összehasonlítása a Pannon Ökorégió zavarással terhelt és szentély jellegű élőhely-komplexeiben. Vácrátót, Tudomány Ünnepe, 2010 nov. 30. Absztraktok: Pohner Zsuzsanna, Ács Éva, K. Borsodi Andrea, Kiss Keve Tihamér, Palatinszky Márton, Reskóné Nagy Mária, Várbíró Gábor, Bíró Péter: Bevonatban élő mikrobiális közösségek genetikai diverzitásának összehasonlítása a Balaton két eltérő trofitású medencéjében LII. Hidrobiológus Napok. Tihany október 6-8. p. 36. Publikációk: Pohner, Zs., Ács, É.; Borsodi, A.; Kiss, K.T.; Palatinszky, M.; Reskóné, N. M.; Várbíró, G.; Mészáros, É.; Duleba, M.; Bíró, P. (0000): Bevonatban élő mikroba-közösségek genetikai diverzitásának összehasonlítása a Balaton két eltérő trofitású medencéjében. submitted paper. Hidrológiai Közlöny. Duleba, M., Ács, É., Borsodi, A.K., Kiss, K.T., Palatinszky, M., Pohner, Zs., Reskóné, N.M., Várbíró, G., Bíró, P. (0000): Comparison of benthic community patterns and diversity profiles in three basins with different trophic levels of Lake Balaton (Hungary). submitted paper Microbs and Environments IF: 2,248