A A HLA-diagnosztika jelentősége szerv és hematopoetikus őssejt transzplantációban, illetve a transzfúziológiai gyakorlatban

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A A HLA-diagnosztika jelentősége szerv és hematopoetikus őssejt transzplantációban, illetve a transzfúziológiai gyakorlatban"

Mihály Csonka
5 évvel ezelőtt
Látták:

gyakorlatban Tordai Attila Semmelweis Egyetem Kórélettani

1 A A HLA-diagnosztika jelentősége szerv és hematopoetikus őssejt transzplantációban, illetve a transzfúziológiai gyakorlatban Tordai Attila Semmelweis Egyetem Kórélettani Intézet Transzfúziológiai szinten tartó tanf.,

2 HLA történelem Felfedezés: Jean Dausset 1958, Nobel-díj: 1980 (Dausset, Snell, Benacerraf) HLA=human leukocyta antigén MHC=major hisztokompatibilitási komplex MIRC=major immune response complex

3 A HLA-rendszer fő funkciója Antigén-prezentáció, az allo-immunválasz megindulásának előfeltétele Kumar V. ed. Robbins Pathologic Basis Of Disease, 9th ed. 2015

4 A HLA I/II. osztály összehasonlítása HLA I. osztály Expresszió Funkció Minden magvas sejt + vérlemezke (esetenként alacsonyabb), kivétel: spremium, trophoblast Saját + intracell. peptidek (6-10 as., vírus, tumor antigének) prezentációja a CD8+ T sejtek felé Professzionális antigén prezentáló sejtek (APC): - dendritikus sejt, HLA II. - Langerhans sejt, osztály - macrophag, - B sejt, - aktivált T sejt Idegen, vezikulárisan internalizálódott peptidek (9-22 as., mikróbák solubilis fehérjék) prezentációja a CD4+ T sejtek felé

5 HLA gének, MHC-fehérjék, variabilitás Kodomináns expresszió

6 Fehérje alapú (szerológiai ) HLAtipizálás

Elve: Sejtpermeabilizáció következik be, ha a HLA sejtfelszíni antigénhez egy arra specifikus, komplement aktivációra

7 Komplement-dependens citotoxicitás (CDC) Terasaki & McLelland: mikrolymphocyto-toxicitás tipizálásra: 1964:HLA-A,-B,-C 1977:HLA-DR 1984:HLA-DQ 2013:múzeumban. Elve: Sejtpermeabilizáció következik be, ha a HLA sejtfelszíni antigénhez egy arra specifikus, komplement aktivációra képes HLA-ellenes antitest köt dik. A pozitivitás viabilitási festékkel jeleníthet meg. Terasaki-tálca: 1 µl szérum!!!! Alkalmas: (i) antigén-meghatározás (tipizálás); (ii) antitest-kimutatás; (iii) keresztpróba.

8 HLA-tipizálás szerológiai módszerrel (CDC)

9 A CDC-teszt mikroszkópos képe Negatív Pozitív

10 Szekvencia specifikus primerek (SSP)

HLA-tipizálás szekvencia specifikus primerekkel (SSP) A

reakciók; A variánsra a 3 végen specifikus egyedi

Analízis: agaróz gélelektroforézis; A HLA-típus megállapítása

11 HLA-tipizálás szekvencia specifikus primerekkel (SSP) A vizsgálni kívánt variánsok számához igazodó, párhuzamos PCR reakciók; A variánsra a 3 végen specifikus egyedi amplifikációs primerek; Univerzális amplifikációs kontroll; Analízis: agaróz gélelektroforézis; A HLA-típus megállapítása megoldókulccsal vagy célprogrammal. Kis felbontás Nagy felbontás (szubtipizáló kit)

12 Szekvencia specifikus oligonukleotidok (SSO, Luminex)

LUMINEX xmap technológia A két (vörös és

13 LUMINEX xmap technológia A két (vörös és infravörös) festék eltér arányú keveréke 100-féle gyöngytípust (5 µm átmér jű, polisztirén) eredményez egyedi spektrális kódot eredményezve. Egy reakcióban egyszerre elméletileg 100 féle analit is vizsgálható.

14 LUMINEX xmap szendvics-immunoassay A piros lézerrel a gyöngy típusa azonosítható, a zölddel pedig a vizsgált analit.

15 Sanger-szekvenálás (sequence based typing, SBT)

Szekvenálás (régi generációs, Sanger) Tetszőleges DNS-szakasz bázissorrendjének meghatározása, molekula-sokaság szummációs képe, végpont-analízis.

16 Szekvenálás (régi generációs, Sanger) Tetszőleges DNS-szakasz bázissorrendjének meghatározása, molekula-sokaság szummációs képe, végpont-analízis. Módszer: lánctermináció fluoreszcensen jelölt didezoxi (módosított) nukleotidokkal (BigDye terminator kit) Lépések: Amplifikáció PCR-rel PCR termék tisztítás Szekvenáló reakció Termék tisztítás Analízis: kapilláris elektroforézis T CG T A A C G C T AG T C

17 Egyértelmű nagy felbontású HLA-típus HLA-A A*01:01:01:01, 30:01:01

HLA-ellenes antitest szűrés CDC-vel panel reaktív antitestek (PRA) A beteg HLA ellenes antitest-előfordulási gyakorisága %-ban kerül meghatározásra ismert HLA

18 HLA-ellenes antitest szűrés CDC-vel panel reaktív antitestek (PRA) A beteg HLA ellenes antitest-előfordulási gyakorisága %-ban kerül meghatározásra ismert HLA típusú paneltagok limfocitáival (szűrősejtek) szemben. pozitív negatív PRA = 92% A számszerű eredményt befolyásolja, hogy milyen gyakori antigén ellen termel dik antitest.

19 HLA-ellenes antitestek azonosítása (single antigen) LABScreen Single Antigen, HLA I. osztály

20 TX-modellezés -- keresztpróba (crossmatch, XM) Kérdés: van-e a recipiens szérumban a donor sejtekre specifikus antitest. Technika: 1. CDC komplement aktiváló antitestek; 2. FACS (áramlási citométer) nemcsak komplement aktiváló antitestek, de érzékenyebb. Célsejtek: perifériás vér mononukleáris sejtek vagy lép/ny.cs. sejtek (cadaver).

21 PLT-transzfúzió modellezés -- keresztpróba (cross-match, XM) Kérdés: van-e a recipiens szérumban a donor PLT-re specifikus antitest. Technika: 1. ELISA donor PLT + recipiens szérum antiigg-vel fedett lemez centrifugálás egyenletes fedettség = pozitív, üledék = negatív; 2. Latex gyöngy agglutináció donor PLT szolubilizáció glikoprotein adszorpció a gyöngyhöz (tárolható) gyöngy-agglutináció recipiens szérummal.

22 Mitől idegen a graft? -- alloantigének HLA=MHC: HLA-I; HLA-II. Egyéb: Minor hisztokompatibilitási antigének; Endothel specifikus antigén; Vese tubuláris antigén, MHC I peptid related sequence A = MICA. A TX kapcsán a szervet ért stressz hatására fokozódik az allo-antigének, gyulladásos citokinek és adhéziós molekulák kifejeződése!!

23 Szövetek össze-egyeztethetősége (hiszto-komaptibilitás) --Idegen/saját Transz fúziológia plantáció Vörösvérsejteken nem fejeződnek ki a HLA-fehérjék, de thrombocytákon igen. Betegség-asszociáció Coeliakia (glutén szenzitív enteropathia) Bechterew kór (spondylitis ankylopoetica) Narcolepsia Behcet kór Rheumatoid arthritis Abacavir (anti-hiv) hiperszenzitivitás (HLA-B*5701)

24 A HLA-egyezés hatása a hosszú távú graft-túlélésre vese TX-ban (Collaborative TX Study -- Heidelberg) Opelz&Döhler 2007a. Transplantation

25 A HLA-egyezés hatása a hosszú távú grafttúlélésre vese TX-ban (USA) Cecka Int. J. Immunogenet.

26 A HLA-egyezés hatása az immunizáltsági állapotra Meier-Kriesche Transplantation

27 A HLA-egyezés hatása a post-tx NHL előfordulási gyakoriságára Opelz&Döhler Transplantation

28 Hematopoetikus őssejt transzplantáció (HSCT) Ha csak részleges a kompatibilitás, nő a szövődmény kockázata: Graft versus host betegség (GVHD) donorból hiányzó allo-antigén a recipiensben; Host versus graft (HVG, graft elégtelenség, aplasia) a recipiensből hiányzó allo-antigén a donorban.

29 A HSCT kimenetele a HLA-egyezés függvényében (nem rokon donoros TX) Marsh S. EBMT presentation

30 Miért foglalkozunk TX-ban a HLA-ellenes antitestekkel? TX el tt a preformált (vetélés/szülés, transzfúzió, korábbi TX) antitestek hiperakut rejekciót vagy vérlemezkepusztulást okozhatnak; MEGEL ZÉS TX után antiest-mediált rejekciót okozhatnak. NYOMON KÖVETÉS

31 Anti-HLA antitestek + transzfúziológia o Antitest-függő PLT-transzfúzió refrakteritás: az egyéb oki tényezők (fertőzés, splenomegalia, DIC, masszív trafo, heparin, csökkent készítmény minőség) KIZÁRÁSA után. o Lázas reakció leuko-depléció hiányában: recipiens antitest reakció donor leukocytákkal. o TRALI (transzfúzió asszociált tüdő-károsodás, nonkardiogén tüdő- oedema): anti-hna (humán neutrolfil antigén), anti-hla (gyengébb) antitestek a donorban gyulladásos reakció (infiltráció) a tüdőben oedema légzési elégtelenség.

32 A PLT-refrakteritást okozó HLA alloimmunizáció sajátosságai o A HLA I. osztály antigének szerepe (II. osztály nem jelentős) o A leukocyták veszélyesebbek, mint a PLT-k o Anamnézis: korábbi trafo, terhesség Megelőzés: Leukocyta-depléció: <5 106 összes leukocyta. Teendő PLT refrakteritásban ( increment-hiány ): PLT egyedi donortól (apheresis) Non-reaktív donor szűrés (donor-panel, HLA-tipizálás csak A&B) PLT keresztpróba (XM)

Hasonló dokumentumok

Újabb szempontok a donor és a recipiens kiválasztásánál szerv és hemopoetikus őssejt transzplantáció előtt

Újabb szempontok a donor és a recipiens kiválasztásánál szerv és hemopoetikus őssejt transzplantáció előtt A TRANSZFUZIOLÓGIA AKTUÁLIS KÉRDÉSEI KÖTELEZŐ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM TRANSZFUZIOLÓGUSOKNAK Budapest,