Szingulett oxigén képződésének, detektálásának és kioltásának vizsgálata

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Fizikai Kémia Tanszék Szingulett oxigén képződésének, detektálásának és kioltásának vizsgálata Ph.D. értekezés tézisei Baranyai Péter Témavezető: Dr. Vidóczy Tamás tudományos tanácsadó MTA Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézet Budapest, 2002.

2 BEVEZETÉS A szingulett oxigén hatása rendkívül sok helyen észlelhető. Mint igen reaktív oxidálószer számolni kell jelenlétével fotoszenzibilizált oxidációkban, daganatok fototerápiájában, festékek és polimerek fotodegradációjában, vírusok fotodinamikus inaktívációjánál, hogy csak néhány példát említsünk. Kis túlzással azt mondhatjuk, hogy szinte bárhol találkozhatunk a szingulett oxigénnel, ahol fény és oxigén is jelen van. Az oxigén az alapállapotú molekulák között ritka kivételként triplett, a legalacsonyabb gerjesztett állapotban pedig szingulett multiplicitású. Mivel az alapállapotba történő dezaktívációja tiltott, ezért viszonylag hosszú (µsms) élettartammal rendelkezik. Kellően nagy gerjesztési energiája (94 kj mol -1 ) pedig lehetővé teszi, hogy számos reakcióban vegyen részt. Különlegessége, hogy a közeli infravörös tartományban (1270 nm) rendkívül gyenge, de jól mérhető foszforeszcenciát mutat. Értekezésemben három témával foglalkozom, amelyek mind a szingulett oxigénnel fotokémiájával kapcsolatosak. A témákon keresztül egy rövid élettartamú gerjesztett állapotú részecske legfontosabb eseményeit, jellemzőit ismerhetjük meg: képződését, detektálását és kioltását. Az első és egyben legbővebb rész a fotodinamikus terápiában használható néhány új porfirin vegyület fotokémiai vizsgálatáról szól. Első lépésként természetesen a szenzibilizátorok fotofizikai, fotokémiai paramétereit, tulajdonságait állapítottuk meg homogén folyadékfázisban (szerves oldószerek). A szingulett oxigén képződése szempontjából kulcsfontosságú a triplett gerjesztett állapotú szenzibilizátor vegyület és az alapállapotú oxigénmolekula között lejátszódó energiaátadással járó kioltási folyamat. A kioltásra komoly befolyást gyakorol a szenzibilizátor mikrokörnyezete, ezért ezt a folyamatot vizsgáltuk a sejtmembrán igen egyszerű modelljeként használatos vezikula kettősrétegben. Vegyületeinkkel ezenkívül lehetőség nyílt fluoreszcenciás mérésekre is. 1

3 A szingulett oxigén kimutatására, mérésére ma már szinte kizárólag foszforeszcenciáját alkalmazzák. A foszforeszcencia intenzitása a sugárzás sebességi együtthatójától függ, aminek nagyságára az oldószer környezet igen jelentős befolyással van. Különböző oldószerekben végzett mérések összehasonlíthatóságához feltétlenül szükséges a radiatív együttható legalább relatív ismerete. Az irodalomban található elrendezések hibáit igyekeztünk kiküszöbölni, ezért egy új, eddig még nem alkalmazott elrendezést építettünk. Kísérleteink egyben lehetővé tették azt is, hogy adott mérési elrendezést a szingulett oxigén mennyiségére kalibráljuk, vagyis a foszforeszcenciás detektálást kvantitatívvá tegyük. Egy gerjesztett állapotú részecske fölös energiáját többféle folyamatban van lehetősége leadni, ez különösen folyadék fázisban következhet be gyorsan. A szingulett oxigén élettartama rendkívül erősen függ az oldószertől, ugyanakkor számos más molekulával is kölcsönhatásba léphet. A gerjesztett állapot energiavesztését hatékonyan elősegítő kioltó anyagok közül néhány érdekes kobalt komplex vizsgálata a harmadik témakör, melyet érintek értekezésemben. A téma egyúttal jó példa arra, hogy a kioltás sebességi együtthatójának vizsgálata hogyan segít a kioltó molekula oldatbeli szerkezetére is következtetni. 2

4 ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Méréseink túlnyomó többségét lézervillanófény-fotolízissel végeztük. A gerjesztéshez villanólámpával pumpált festéklézert illetve Nd-YAG lézert használtunk. A detektálás a porfirin triplett molekulák esetében fényabszorpciós úton történt. A szingulett oxigén mérésére annak közeli infravörös emisszióját használtuk. A tranziens abszorbancia mérésére szolgáló összeállítás nagynyomású xenonlámpából, monokromátorból, fotoelektronsokszorozóból és egyéb optikai elemekből állt. A foszforeszcencia időfelbontásos detektálását egy cseppfolyós nitrogénnel hűtött gyors és nagy érzékenységű germánium fotodiódával végeztük. A detektorok jelét számítógépbe helyezett A/D kártyával illetve oszcilloszkóppal digitalizáltuk és saját fejlesztésű vagy kereskedelmi programokkal értékeltük ki. Természetesen hagyományos (nem időfelbontásos) módszereket is alkalmaztunk vegyületeink jellemzésére, így UV-látható abszorpciós spektroszkópiát, illetve membránokban hőmérsékletfüggő fluoreszcencia polarizációs méréseket. A szingulett oxigén kioltásának vizsgálata kapcsán folyamatos besugárzással is végeztünk kísérleteket, a fotooxidáció termékét pedig HPLC analízissel mértük. Végül meg kell említeni mint kísérleti módszert a Monte Carlo szimulációt. Ezzel a szingulett oxigén foszforeszcenciáját detektáló összeállításunk optikai tulajdonságait derítettük fel. 3

5 ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Részben új, eddig még nem publikált tetrafenil-porfirin típusú fotoszenzibilizátorokat jellemeztem fotofizikai sajátságaik alapján, alapvető paramétereiket (triplett moláris abszorpciós együttható, a triplett és a szingulett oxigén képződésének kvantumhatásfoka illetve a triplett porfirin oxigénnel történő kioltásának sebességi együtthatója) határoztam meg szerves oldószerekben. A szenzibilizátorok az alapvegyülethez fotokémiai szempontból nagyon hasonló viselkedést mutattak, a trihidroxi származék némileg kisebb szingulett oxigén képződési kvantumhatásfokkal rendelkezik, vélhetően a megnövekedett aggregációs hajlam miatt. 2. Vizsgáltam porfirin triplett és az alapállapotú oxigénmolekula között lejátszódó energiaátadásos folyamatot, vagyis a szingulett oxigénhez vezető szenzibilizációs lépést, foszfolipid vezikulák membránjában. Megállapítottam, hogy a porfirin triplettek oxigénnel történő kioltása folyamatával jól jellemezhető a vezikula kettősrétegű membránjának állapota, a membrán fő fázisátmenete során bekövetkező fluiditás változás erősen befolyásolja a folyamat sebességét, a fázisátmenet hőmérséklete ez alapján jól detektálható, értéke az adott vezikula típusra az irodalmi adatnak megfelelő. 3. Számítások alapján egyértelműen igazolható, hogy kísérleteinkben a képződött triplett mennyisége jóval meghaladja a membránban található oxigén mennyiségét, ezért a triplett kioltásához szükséges oxigén döntő hányada a vizes fázisból érkezik. Ezért a kioltás másodrendű sebességi együtthatójának számításához megfelelő, hogy az oxigén vízben mérhető koncentrációját alkalmaztuk. 4. A membránban lejátszódó kioltási folyamatra jellemző aktiválási energiákat határoztam meg a membrán gél illetve folyadékkristályos fázisában. A membrán fázisátmeneténél kisebb hőmérsékleten a triplett oxigénnel történő kioltási folyamatának aktíválási energiája a 4

6 porfirin polaritásának növekedésével csökken. A porfirin a membránon belül polaritásának megfelelően különböző mélységben helyezkedik el, ott a hőmérséklet emelésével bekövetkező fluiditás növekedés is különböző, ez tükröződik az eltérő aktíválási energiákban. 5. Az előbbi magyarázat további ellenőrzésére fluoreszcencia polarizációs méréseket is végeztünk. Ezek eredményei teljes összhangban állnak a triplett kioltásos kísérletekkel, figyelembe véve a fluoreszcencia ns-os és a triplett kioltás µs-os karakterisztikus idői miatti különbségeket. 6. A triplett kioltás hőmérséklet függését kétféle átlagos méretű (50 és 100 nm átmérőjű) vezikulában vizsgáltam. A fázisátmenet hőmérséklete a kisebb vezikulában mintegy 2 C-al alacsonyabb volt, amit a derivált görbék egyértelműen igazoltak. Ennek egyik oka lehet, a membránban a kisebb görbületi sugár miatt fellépő nagyobb feszültség, amely a merevebb gél szerkezetben csökkenti a foszfolipid molekulák szoros illeszkedését. 7. Az irodalomban nem publikált, új mérési elrendezést építettem a szingulett oxigén foszforeszcenciájának vizsgálatára, mellyel az emissziós detektálás kvantitativitásához szükséges kalibrációt végeztem, illetve a szingulett oxigén foszforeszcencia sebességi együtthatóját határoztam meg különböző oldószerekben. A kísérletek során a szingulett oxigénnel kémiai reakcióba lépő akceptor vegyület (1,3-difenil-izobenzofurán) tranziens abszorpciós technikával mért fogyásából következtettem a képződött szingulett oxigén mennyiségére, amelyet a szimultán mért emissziós foszforeszcencia jelhez viszonyítottam. 8. A mérések kiértékeléséhez, foszforeszcencia sebességi együttható számításához Monte Carlo szimulációs módszerrel modelleztem a mérési elrendezés geometriáját, a detektálás hatékonyságát vizsgáltam több kísérleti paraméter függvényében. Megállapítottam, hogy az 5

7 adott mérési elrendezésben, a detektálási hatékonyság gyakorlatilag nem függ a minta abszorbanciájától, vagyis a képződött szingulett oxigén térbeli eloszlásától. Ezzel szemben a detektálási hatékonyságot erősen befolyásolja az oldat törésmutatója, ezt az ismert hatást általában egy egyszerű korrekcióval próbálják figyelembe venni. 9. Az irodalomban alkalmazott, az oldat törésmutatójának négyzetével végzett korrekció, a szimuláció szerint, az adott mérési geometriánál kevésnek bizonyult, mert a küvettafalról való visszaverődéssel detektált fény mennyiségét nem veszi figyelembe. A küvetta üvegének törésmutatójától jelentősen eltérő törésmutatójú oldatból a visszaverődéssel érzékelt fény mennyisége akár 25 % is lehet a közvetlenül detektált fényhez képest. 10. Az általam meghatározott relatív foszforeszcencia sebességi együtthatók az irodalomban fellelhető értékekkel jó egyezést mutatnak, ami reményteljessé teszi más közegek (oldószerek, membrán kettősréteg) vizsgálatát. A szimulációkból levont következtetések, és a szerzett tapasztalatok más emissziós (pl. fluoreszcencia) méréseknél is felhasználhatók, a program megfelelő módosításával más kísérleti elrendezések is modellezhetők, vizsgálhatók. 11. Koordinatíve telítetlen (L)-bisz-(1,2-szemi-benzokinondiimináto)kobalt(III) komplexek szingulett oxigén kioltási sebességi együtthatóit vizsgáltam széles polaritás és viszkozitás tartományt felölelő oldószer csoportban. A kioltás sebessége az adott komplexek körében nem függött az axiális ligandumtól, az ekvatoriális ligandum klór szubsztitúciójának hatására minden oldószerben csökkent. A sebességi együtthatók vizsgálata egyértelműen igazolta, hogy a kioltási folyamat diffúzióvezérelt. 6

8 12. A kioltási folyamatra a diffúzióvezérelt reakciók kinetikájának elméletét használtam. Ez alapján meghatároztam a fémkomplex és a szingulett oxigén közötti kölcsönhatási távolságot (R = 0,33 nm), amely azt mutatja, hogy a komplex oldatban is gyakorlatilag pentakoordinált, mert csak ebben az esetben képes az oxigén molekula ennyire megközelíteni a kobalt atomot. A kis kölcsönhatási távolság miatt, a kioltás mechanizmusa ütközéses (elektronkicserélődéses) energiaátadás, amelyhez a kölcsönható partnerek elektronpályáinak megfelelő átfedése szükséges. Ezzel összhangban az ekvatoriális ligandum elektronküldő tulajdonságának csökkenésekor (klór szubsztitúció) csökken a kioltás sebessége, mivel a központi kobalt atomon csökken az elektronsűrűség. 13. Folytonos besugárzásos mérésekkel megállapítottam, hogy a szingulett oxigén és a komplex közötti kölcsönhatás során kis hatásfokkal olyan köztitermék is képződik, ami a hidrokinont benzokinonná oxidálja. Ez a tény azt jelzi, hogy a kioltásnál kis valószínűséggel elektronátadási folyamat is szerepet játszik. A komplex mennyisége nem csökken, a kölcsönhatás folyamán visszaalakul eredeti állapotába, vagyis a vizsgált kobalt komplexek katalítikus fotoxidációra képesek. 7

9 KÖZLEMÉNYEK Az értekezéshez kapcsolódó publikációk: 1. Katona, A. Grofcsik, P. Baranyai, I. Bitter, G. Grabner, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Triplet state spectroscopic studies on some 5,10,15,20-tetrakis(methoxyphenyl)porphyrins Journal of Molecular Structure, 450, (1998) IF: 0, P. Baranyai, S. Gangl, G. Grabner, M. Knapp, G. Köhler, T. Vidóczy: Using the Decay of Incorporated Photoexcited Triplet Probes to Study Unilamellar Phospholipid Bilayer Membranes Langmuir, 15, (1999) IF: 3, P. Baranyai, T. Vidóczy: Quenching of singlet oxygen ( 1 g ) by cobalt complexes with four nitrogen atoms in the equatorial plane Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 58, (2000) IF: 1,529 Egyéb publikációk: 4. D. Duca, P. Baranyai, T. Vidóczy: A Monte-Carlo Model for the Hydrogenation of Alkenes on Metal Catalyst Journal of Computational Chemistry, 19, (1998) IF: 2, T. Vidóczy, P. Baranyai: Quenching of Porphyrin Triplet and Singlet Oxygen by Stable Nitroxide Radicals: Importance of Steric Hindrance Helvetica Chimica Acta, 84, (2001) IF: 2,209 8

10 Konferenciák 1. P. Baranyai, S. Németh, T. Vidóczy: Quenching of singlet oxygen by cobalt complexes: kinetics and mechanism 11th International Symposium on the Photochemistry and Photophysics of Coordination Compounds 1995 július 9-13., Krakkó, Lengyelország 2. T. Vidóczy, P. Baranyai: Singlet oxygen concentration correlated with its IR emission intensity 6th Congress of the European Society for Photobiology 1995 szeptember 3-8., Cambridge, Nagy-Britannia 3. P. Baranyai, T. Vidóczy: Simultaneous measurement of singlet oxygen concentration and near- IR emission intensity XVIth IUPAC Symposium on Photochemistry 1996 július , Helsinki, Finnország 4. Baranyai P., Vidóczy T., Németh S.: Szingulett oxigén kobalt komplexekkel történő kioltása MTA Reakciókinetikai és Fotokémiai Munkabizottság 1996 november 7-8., Gyöngyöstarján, Magyarország 5. Z. Katona, P. Baranyai, I. Bitter, A. Grofcsik, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Synthesis and spectroscopic investigations of some 5, 10, 15, 20- tetraarylporphyrins 40th Hungarian Conference - 8th Hungarian-Italian Symposium on Spectrochemistry 1997 június 29 - július 4., Debrecen, Magyarország 6. Z. Katona, P. Baranyai, I. Bitter, A. Grofcsik, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Synthesis and photophysical properties of some meso-tetraarylporphyrins XVIIIth International Conference on Photochemistry 1997 augusztus 3-8., Varsó, Lengyelország 9

11 7. P. Baranyai, Z. Katona, F. Ricchelli, G. Jori, I. Bitter, A. Grofcsik, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Meso-tetraarylporphyrins as molecular probes of the microenvironment 7th Congress of the European Society for Photobiology 1997 szeptember 8-13., Stresa, Olaszország 8. A. Grofcsik, Z. Katona, P. Baranyai, I. Bitter, G. Grabner, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Triplet state spectroscopic studies of some 5, 10, 15, 20-tetrakis- [methoxyphenyl]-porphyrins 4th National Conference on Molecular Spectroscopy 1997 szeptember 28 - október 1, Wroclaw, Lengyelország 9. P. Baranyai, S. Németh, T. Vidóczy: Quenching of singlet oxygen by cobalt complexes First Internet Conference on Photochemistry and Photobiology 1997 november december 19., P. Baranyai, S. Gangl, G. Grabner, G. Köhler, M. Knapp, T. Vidóczy: Studies of lateral diffusion and phase transition in lipid vesicle membranes using triplet-triplet absorption European Photochemistry Association Summer School június , Noordwijk, Hollandia 11. P. Baranyai, S. Gangl, G. Grabner, G. Köhler, M. Knapp, T. Vidóczy: Studies of lateral diffusion and phase transition in lipid vesicle membranes using triplet-triplet absorption XVIIth IUPAC Symposium on Photochemistry 1998 július , Sitges, Spanyolország 12. S. Gangl, S. Stark, P. Mayerhofer, D. Rünzler, M. Knapp, G. Grabner, P. Baranyai, T. Vidóczy, G. Köhler, B. Mayer: Generic structure and function of transmembrane channel elements FEBS Practical Course Membrane receptors and transporters 1998 augusztus , Debrecen, Magyarország 10

12 13. P. Baranyai, G. Grabner, M. Knapp, G. Köhler, T. Vidóczy: Utilization of triplet probes to study membrane fluidity and phase transition 8th Congress of the European Society for Photobiology 1999 szeptember 3-8., Granada, Spanyolország 14. P. Baranyai, G. Grabner, A. Grofcsik, M. Knapp, G. Köhler, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Utilization of triplet probes to study properties of unilamellar phospholipid membranes 13th International Congress on Photobiology 2000 július 1-6., San Francisco, USA 15. P. Baranyai, G. Grabner, A. Grofcsik, G. Köhler, M. Kubinyi, T. Vidóczy: Depth of embedment of some meso-tetraphenyl-porphyrin derivatives in phospholipid vesicle membranes 9th Congress of the European Society for Photobiology 2001 szeptember 3-8., Lillehammer, Norvégia 16. A. Grofcsik, P. Baranyai, I. Bitter, A. Grün, É. Kőszegi, M. Kubinyi, K. Pál, T. Vidóczy: Photochromism of a spiropyran derivative of 1,3-calix[4]crown-5 XIXth IUPAC Symposium on Photochemistry 2002 július , Budapest, Magyarország 11