(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A61K 39/39 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/IB 07/ () Elsõbbségi adatok: GB (72) Feltaláló: KLEIN, Norbert, 041 Marburg (DE) (73) Jogosult: Novartis AG, 6 Basel (CH) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Eljárások szkvaléntartalmú olaj a vízben emulziók minõségének ellenõrzésére HU T2 A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 1 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgyköre A találmány vakcinaadjuvánsok gyártásának, elõnyösen a szkvaléntartalmú olaj a vízben emulziók minõség-ellenõrzésére szolgáló vizsgálatok témakörébe tartozik. A találmány háttere Az MF9 néven ismert vakcinaadjuváns [1 3] szkvalén, Tween 80 és Span 8 szubmikronos méretû olaj a vízben emulziója. Mindezek mellett még citrátionokat például mm nátrium-citrát-puffert is tartalmazhat. Az emulziókészítmény tartalmazhat körülbelül térfogat% szkvalént, körülbelül 0, térfogat% poliszorbát 80¹at és körülbelül 0, térfogat% Span 8¹öt. Az adjuváns a 4. számú hivatkozás. fejezetében és az. számú hivatkozás 12. fejezetében részletesebben le van írva. Az MF9-ben lévõ olajcseppek eléggé kis méretûek ahhoz, hogy a készítményt 0,2 m¹es szûrõn sterilre lehessen szûrni. Mivel ezt az adjuvánst embereknek adják be (például, az adjuváns a FLUID vakcina részét képezi), ezért a vakcina minõség-ellenõrzése különösen fontos, és a tételek közötti eltérést keskeny határok között kell tartani. Az MF9¹re nézve fontos paraméterek közé tartozik az emulzióban lévõ cseppek átlagos mérete, a bioterhelés (bioburden), a ph, a látható megjelenés, és az összetevõk lebomlási termékeinek vagy szokásos szennyezõdéseinek jelenléte. A találmány szerinti megoldás célja további és javított vizsgálatok kifejlesztése olaj a vízben emulziós adjuvánsok, mint például MF9, minõségének ellenõrzésére. A találmány leírása Felismertük, hogy az MF9 adjuváns egyes tételeiben a szkvalén mérése alkalmazható a termelés során elõforduló problémák ellenõrzésére. Konkrétan azt ismertük fel, hogy a szkvaléntartalom csökkenése jelezheti, hogy problémák merültek fel a szûréskor. A gyártási végtermékben könnyebb tesztelni a szkvaléntartalmat, mint vizsgálni a szûrõ jellemzõit, különösen akkor, ha a szûrõ egy olyan berendezés részét képezi, amelyet GMP körülmények között kell karbantartani. Így a szkvalénvizsgálat leegyszerûsíti az olaj a vízben emulziók minõség-ellenõrzését. Ennek megfelelõen, a találmány tárgya minõség-ellenõrzési teszteljárás olyan olaj a vízben emulziókhoz, amelyekben az adjuváns szkvalént tartalmaz, és amely eljárás az adjuváns aktuális szkvaléntartalmának egy standard szkvaléntartalommal való összehasonlítására szolgáló lépést tartalmaz. Amennyiben az aktuális szkvaléntartalom a standardtól eltér, akkor a gyártásban hiba fordult elõ és az adjuváns nem felel meg a minõség-ellenõrzési tesztnek; azonban amennyiben az aktuális tartalom elfogadható, az adjuváns átmegy a minõség-ellenõrzési teszten és alkalmazható vakcinagyártásra. Továbbá, a találmány tárgya eljárás olaj a vízben emulziós adjuváns gyártására, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: (i) szubmikronos méretû olaj a vízben emulzió készítése vizes hordozók, felületaktív anyag és szkvalén ismert mennyiségeinek alkalmazásával, (ii) az emulzió szûréses sterilizálása steril emulzió készítése céljából, és (iii) a szkvaléntartalom mérése a sterilizált emulzióban. Az (iii) lépésben mért szkvaléntartalmat össze lehet hasonlítani az (i) lépésbõl ismert szkvaléntartalommal. Amennyiben ez az összehasonlítás feltárja, hogy a szkvaléntartalom jelentõs mértékben megváltozott, akkor a gyártásban valamilyen hiba fordult elõ, és így az adjuváns nem megy át a minõség-ellenõrzési vizsgálaton. Egy adott betegnek való beadás elõtt az emulziós adjuvánst általában antigénnel keverik össze. Az összekeverés történhet helyben, az alkalmazás idõpontjában (ez esetben az antigén és az adjuváns külön van becsomagolva), vagy történhet a vakcina gyártása során, még a töltést megelõzõen. Az elõbbi esetben, a minõség-ellenõrzési vizsgálatot önmagán az adjuvánson végezzük, míg a második esetben a minõség-ellenõrzési vizsgálat az adjuváns antigénnel való összekeverése elõtt és/vagy az adjuváns-antigén keveréken történik. Ennek megfelelõen, a találmány tárgya minõség-ellenõrzési teszteljárás olyan vakcina ellenõrzésére, amely szkvalént tartalmazó, olaj a vízben adjuvánst tartalmaz, ahol az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: (i) az adjuváns aktuális szkvaléntartalmának összehasonlítása egy standard szkvaléntartalommal; és ha az aktuális szkvaléntartalom elfogadható, akkor (ii) a vakcina elõállítása az adjuváns antigénnel való kombinálásával. A (ii) lépés részét képezheti az adjuváns és az antigén külön-külön csomagolása úgy, hogy azok az alkalmazás idõpontjában összekeverhetõk legyenek, vagy a (ii) lépésben az adjuvánst és az antigént össze lehet keverni még a töltés elõtt vagy az alatt. Hasonlóképpen, a találmány tárgya minõség-ellenõrzési teszteljárás olyan vakcinára, amely antigént és szkvaléntartalmú olaj a vízben emulziót tartalmaz, és amely eljárás a vakcina aktuális szkvaléntartalmának egy standard szkvaléntartalommal való összehasonlítására szolgáló lépést tartalmaz. Amennyiben az aktuális szkvaléntartalom eltér a standardtól, akkor a gyártásban hiba fordult elõ és a vakcina nem felel meg a minõség-ellenõrzési tesztnek; azonban amennyiben az aktuális tartalom elfogadható, a vakcina átmegy a minõség-ellenõrzési teszten és értékesítésre és/vagy forgalmazásra bocsájtható. A találmány különösen alkalmazható az influenzavírus-vakcinák gyártása során, és eszerint, a találmány tárgya eljárás, amely tartalmazza az (i) influenzavírusantigén és (ii) szkvalént tartalmazó olaj a vízben emulziós adjuváns összekeverésének lépését, és ahol az eljárás olyan lépést is tartalmaz, amelyben az adjuváns szkvaléntartalma mérésre kerül (a) a keverési lépés elõtt és/vagy (b) a keverési lépés után az antigénadjuváns keverékben. Ahogyan a fentiekben már említettük, a termelési hiba kiszûrése céljából a mért szkvaléntartalom (szkvaléntartalmak) összehasonlítható(k) standard szkvaléntartalommal (szkvaléntartalmakkal). 2

3 A tesztelési eljárás A találmány szerinti eljárásokat szkvaléntartalmú olaj a vízben emulziókkal alkalmazzuk, és az eljárás során a szkvaléntartalmat mérjük vagy (i) önmagában az adjuvánsban, és/vagy (ii) az antigénnel összekevert adjuvánst tartalmazó vakcinakészítményben. A technikában különféle eljárások ismertek a szkvalén mérésére. Például, a 6. számú hivatkozás kvantitatív kolorimetriás eljárást ismertet a szkvalén mérésére. A 7. számú hivatkozásban magas hõmérsékletû gázkromatográfiás lángionizációs kimutatási eljárást írtak le a szkvalén szabad zsírsav¹, szabad szterol- és acilglicerol-molekulák jelenlétében való mennyiségi mérésére. A 8. számú hivatkozás olyan, validált, nagynyomású folyadékkromatográfiás UV¹detekciós vizsgálatot közölt, amelynek kimutatási határértéke 1 ppb (parts per billion, ezermilliomod rész). A 9. számú hivatkozásban ismertetik a szuperkritikus folyadékkromatográfia alkalmazását a szkvalén mennyiségi analízisére. A. számú hivatkozásban lézer deszorpciós/ionizációs repülésidõ tömegspektrometriás eljárást ismertetnek a szkvalén vizsgálatára. A 11. számú hivatkozás ismerteti a gázkromatográfia-tömegspektrometria és a nagynyomású folyadékkromatográfia szuperkritikus CO 2 extrakció alkalmazását szkvaléntartalom vizsgálatára. A 12. számú hivatkozás egyszerû és megbízható eljárást ismertet a szkvalén, ¹tokoferol és szterolok mennyiségi meghatározására, amely eljárásban szililezés után kapott, el nem szappanosítható anyagot gázkromatográfiával analizálják. A 13. számú hivatkozás eljárást ismertet, amelyben az el nem szappanosítható anyagot normál fázisú HPLC-vel, szilikagél oszlopon frakcionálják hexán/2¹propanol/víz elegybõl álló mozgófázis alkalmazásával, és az eluátumot 21 nm hullámhossznál követik nyomon, és a szénhidrogén-frakcióban lévõ szkvalént analitikai oszlopon, hexánnal végzett elúcióval kvantifikálják. Közvetlen és közvetett vizsgálatok is alkalmazhatók, például a szkvalént elõször hideg elszappanosításnak, majd pedig a hexánnal készült kivonatot gázkromatográfia-tömegspektrometriának lehet alávetni. Egy adott adjuváns vagy antigén szkvaléntartalmának meghatározása után, a kapott eredményt standard szkvaléntartalommal hasonlítjuk össze. Standard szkvaléntartalom lehet az a mennyiség, amelyrõl ismert, hogy az egy adott betegnek való beadást tekintve elfogadható mennyiség a kérdéses adjuvánsból. Ez lehet az adjuváns elõállítására alkalmazott szkvalénmennyiség. Ez esetben a szkvalén végsõ mennyisége összehasonlítható a kiindulási mennyiséggel. A standard tartalom különféle formákban lehet. Például, egy adott adjuváns pozitív kontroll mintája vizsgálható a tesztelendõ adjuvánssal párhuzamosan, így össze lehet hasonlítani ezek szkvaléntartalmát. Esetleg, összehasonlítás céljából a pozitív kontrollt analizálni lehet a tesztelendõ adjuváns analízise elõtt vagy után. További lehetõségként, a standard tartalom lehet a korábbi analízisek eredményeként megállapított abszolút érték. Azonban, az eljárás minden esetben fel fogja tárni azt, ha a tesztelendõ adjuváns szkvaléntartalma minõség-ellenõrzési célokból megfelelõ. Amennyiben a mért szkvaléntartalom eltér a standard tartalomtól, akkor az eltérés gyártási hibára utal. A standard tartalom lehet abszolút mennyiség vagy koncentráció, vagy lehet relatív mennyiség, például, a felületaktív anyagok tartalmához vagy antigéntartalomhoz viszonyítva megadott mennyiség. Az abszolút mennyiség vagy koncentráció gyakoribb. A standard tartalom lehet pontos érték vagy lehet tartomány. Például, lehet valamilyen, elfogadható százalékos értékkel például ±%, ±% stb., megadott abszolút érték. Ilyenkor egy mért tartalom összehasonlítható egy adott standard tartalom tartományával, és ha az érték a tartományon kívül esik, akkor a vizsgálat eredménye elégtelen. Olaj a vízben emulziós adjuvánsok esetében a jellemzõ abszolút standard szkvaléntartalom lehet, például, 4 mg/ml (például, 43 mg/ml), mg/ml (például, 39 mg/ml), 2 mg/ml például, 21, mg/ml), mg/ml (például, 19, mg/ml) stb., közötti. A normális statisztikai standardoknak megfelelõen, a szkvaléntartalmat jellemzõen számos mintára nézve mérjük a kísérleti eltérés hatásainak minimalizálása végett. Eszerint, a találmány szerinti megoldásban egy adott átlagértéket összehasonlíthatunk a standard tartalommal. Ahogyan a következõkben részletesebben kifejtésre kerül, a szkvalénvizsgálat végezhetõ egy adott adjuvánson még az antigénnel való összekeverés elõtt, vagy antigén/adjuváns keverékeken még a töltés elõtt, kiszereletlen készítménybõl kivont, töltött anyagon stb. Az adjuváns A találmány szerinti eljárásokat olaj a vízben emulziós adjuvánsokkal alkalmazzuk. Az adjuvánsok közé tartozik a szkvalén, amely telítetlen terpenoid olaj (C H 0 ; [(CH 3 ) 2 C [=CHCH 2 CH 2 C (CH 3 )] 2 =CHCH 2 ] 2 ; 2,6,,1,19,23-hexametil-2,6,,14,18,22-tetrakozahexaén; CAS RN ). Az adjuvánsok a szkvalén mellett más olajokat is tartalmazhatnak. Elõnyös, ha a többi olaj biológiailag lebontható (metabolizálható) és biológiailag kompatibilis. Az adjuvánsok tartalmazhatnak olyan olajokat is, amelyek állatokból (például halakból) vagy növényi forrásból származnak. Növényi olajforrások közé tartoznak a diók, magok és gabonamagvak. Diókból származó olaj például a mogyoróolaj, szójaolaj, kókuszolaj és az olívaolaj. A jojobababból nyert jojobaolaj is alkalmazható. Magolajok közé tartozik a pórsáfrányból ( sufflower ) származó olaj, gyapotmagolaj, napraforgóolaj, szezámolaj és hasonlók. A gabonamagvak csoportjában a kukoricaolaj a legkönnyebben beszerezhetõ, de más gabonamagvak, például búza, zab, rozs, rizs, tõtippan ( teff ), tritikálé és hasonlók olaja is alkalmazható. A glicerin és az 1,2-propándiol a magolajokban természetes körülmények között nem elõforduló 6 szénatomszámú zsírsav-észterei elõállíthatók a dió- és magolajokból származó megfelelõ kiindulási anyagok hidrolízisével, elválasztásával és észterezésével. Mivel az emlõsök tejébõl származó zsírok és 3

4 olajok lebonthatók, ezért a találmány gyakorlatba vételében alkalmazhatók. Tiszta olajok állati forrásból való kinyeréséhez szükséges elválasztási, tisztítási, szappanosítási és más módok a technikában jól ismertek. A legtöbb hal tartalmaz könnyen kinyerhetõ, lebontható olajokat. Például, a tõkehalmájolaj, cápamájolajok és bálnaolaj, mint például a spermacetolaj, hozható fel példaként a találmányban alkalmazható számos halolaj közül. Biokémiai szintézissel számos elágazó láncú olajat szénatomszámú izoprénegységekbõl állítanak elõ. Ezeket általában terpenoidoknak nevezik. A szkvalén is idetartozik. A szkvalén telített analógja, a szkvalán is alkalmazható. Halolajok, így a szkvalén és szkvalán kereskedelmi forgalomban könnyen beszerezhetõ, vagy a technikában ismert módon kinyerhetõ. További elõnyös olajok közé tartoznak a tokoferolok. Tokoferolt tartalmazó készítményben az ¹, ¹, ¹, ¹, ¹, vagy ¹tokoferolok alkalmazhatók, azonban az ¹tokoferol elõnyös. A tokoferol számos formában például különféle sók és/vagy izomerek formájában lehet. Sók közé tartoznak szerves savak, például szukcinát, acetát, nikotinét stb. A D¹ -tokoferol és DL¹ -tokoferol egyaránt alkalmazható. Elõnyös ¹tokoferol a DL¹ -tokoferol. Amennyiben e tokoferol sóját alkalmazzuk, az elõnyös só a szukcinát. A szkvalén (és igény szerint egy vagy több további olaj) mellett az emulzió vizes fázist és felületaktív anyagot is tartalmaz. A felületaktív anyag elõnyösen biológiailag lebontható (metabolizálható) és biológiailag kompatibilis. Felületaktív anyagokat HLB -értékük (hidrofil/lipofil egyensúly) szerint lehet osztályozni. A találmány szerinti elõnyös felületaktív anyagok HLBértéke legalább, elõnyösen legalább 1, és még elõnyösebben legalább 16. A találmány szerinti megoldás az alábbi, de a találmányt semmiben sem korlátozó felületaktív anyagokkal alkalmazható: a poli(oxi-etilén)-szorbitán-észter felületaktív anyagok (általában a Tweenek), különösen a poliszorbát és poliszorbát 80; az etilén-oxid (EO), propilén-oxid (PO), és/vagy butilén-oxid (BO) kopolimerjei, amelyek a DOWFAX kereskedelmi néven árusítanak, mint például a lineáris EO/PO blokk-kopolimerek; oktoxinolok, amelyek az ismétlõdõ etoxi-(oxi-1,2-etánediil)-csoportok számát illetõen eltérhetnek, melyek közül különösen érdekes az oktoxinol¹9 (Triton X¹0 vagy t¹oktil-fenoxi-polietoxietanol); (oktil-fenoxi)-polietoxi-etanol (IGEPALCA- 6/NP¹); foszfolipidek, mint például foszfatidilkolin (lecitin); lauril¹, acetil¹, sztearil- és oleil-alkoholokból származó poli(oxi-etilén)-zsírsav-észterek (más néven Brij felületaktív anyagok), mint például, trietilénglikolmonolauril-éter (Brij ); poli(oxi-etilén)-9-lauril-éter; és (az általában SPAN¹ok néven ismert) szorbitán-észterek, például szorbitán-trioleát (Span 8) és szorbitánmonolaurát. Az emulzióban alkalmazható elõnyös felületaktív anyag a Tween 80 [poli(oxi-etilén)-szorbitánmonooleát], Span 8 (szorbitán-trioleát), lecitin és Triton-X-0. Felületaktív anyagok keverékei, például Tween 80/Span 8 keverékek, vagy Tween 80/Triton-X0 keverékek, is alkalmazhatók. Poli(oxi-etilén)-szorbitánészterek, mint például poli(oxi-etilén)-szorbitán-monooleát (Tween 80), és oktoxinol, mint például t¹oktil-fenoxi-polietoxi-polietoxi-etanol (Triton X¹0), kombinációja is alkalmas. Egy másik alkalmas kombináció laureth 9¹et és poli(oxi-etilén)-szorbitán-észtert és/vagy oktoxinolt tartalmaz. A felületaktív anyagok elõnyös mennyiségei (tömeg%-ban megadva) a következõk: poli(oxi-etilén)- szorbitán-észterek (például, Tween 80): 0,01 1%, különösen 0,1%; oktil- vagy nonil-fenoxi-polioxi-etanolok (például, Triton X¹0, vagy a Triton sorozatba sorolt más felületaktív anyag): 0,001 0,1%, különösen 0,00 0,02%; poli(oxi-etilén)-észterek (például, laureth 9): 0,1 %, elõnyösen 0,1 % és különösen 0,1 1%, vagy körülbelül 0,%. Az emulzió vizes fázisa elõnyösen pufferelt, például foszfáttal pufferelt sóoldat. Az emulzióban lévõ olajcseppek átmérõje jellemzõen 1 m-nél kisebb (átlagosan). Stabil emulziók biztosításához, mikrofluidizálóval könnyen elérhetõk a mikron mérettartomány alatti átmérõk. Különösen elõnyösek a 2 nm-nél kisebb méretû cseppek, mivel ezeket sterilizálni lehet szûréssel. Különösen alkalmasak az olyan emulziók, amelyekben a cseppek legalább 80%- ának átmérõje az 0 0 nm¹es tartományba esik. Szkvalént tartalmazó és a találmány szerinti eljárásokkal tesztelhetõ specifikus olaj a vízben emulziók közé tartoznak minden korlátozás nélkül a következõk: Szkvalén, Tween 80 és Span 8 szubmikron emulziója. Az emulzió összetétele térfogat%-ban a következõ lehet: körülbelül % szkvalén, körülbelül 0,% poliszorbát 80 és körülbelül 0,% Span 8. Tömegre vetítve ezek a mennyiségek a következõk: 4,3% szkvalén, 0,% poliszorbát 80 és 0,48% Span 8. Ezt az adjuvánst nevezik MF9 -nek. Az MF9 adjuváns elõnyösen citrátionokat például mm nátrium-citrát-puffert tartalmaz. Szkvalén, tokoferol és Tween 80 emulziója. Az emulzió foszfáttal pufferelt sóoldatot tartalmazhat. Span 8 (például, 1%) és/vagy lecitin is lehet még benne. Ezekben az emulziókban 2 % szkvalén, 2 % tokoferol és 0,3 3% Tween 80 lehet, és egy stabilabb emulzió képzése céljából a szkvalén:tokoferol súlyaránya elõnyösen 1¹nél nagyobb. Szkvalén és Tween 80 körülbelül :2 térfogatarányban lehet jelen. Egy ilyen emulzió elkészítése úgy történik, hogy Tween 80 PBSben való feloldásával 2%¹os oldatot állítunk elõ, majd ebbõl az oldatból 90 ml¹t összekeverünk g DL¹ -tokoferol és ml szkvalén keverékével, majd a kapott keveréket mikrofluidizáljuk. A kapott emulzióban szubmikron méretû például, 0 és nm közötti, elõnyösen körülbelül 180 nm átlagos átmérõjû olajcseppek lehetnek. Az emulzió tartalmazhat még 3d¹MPL¹t és/vagy szaponint (például, QS21) is. Szkvalén, tokoferol és Triton detergens (például Triton X¹0) emulziója. Az emulzió tartalmazhat 4

5 még 3¹O-deacilezett monofoszforil lipid A¹t ( 3d- MPL ) is. Az emulzió tartalmazhat foszfátpuffert. Szkvalént, Pluronic F¹68 blokkpolimert, tojáseredetû foszfatidilkolint, glicerint és tokoferolt tartalmazó emulzió [14]. Szkvalént, poliszorbátot (például poliszorbát 80), Triton detergenst (például Triton X¹0) és tokoferolt (például ¹tokoferol-szukcinát) tartalmazó emulzió. Az emulzió ezt a három komponenst körülbelül 7:11: tömegarányban tartalmazhatja (például, 70 g/ml poliszorbát 80, 1 g/ml Triton X¹0 és 0 g/ml ¹tokoferol-szukcinát), és e koncentrációknak tartalmazniuk kell az egyes komponensek antigénekbõl származó hozzájárulását is. Az emulzió 3d¹MPL¹t is tartalmazhat. Az emulzió szaponint, például QS21¹et, is tartalmazhat. A vizes fázis tartalmazhat foszfátpuffert. Szkvalént; vizes oldószert; hidrofil, nemionos poli(oxi-etilén)-alkil-éter felületaktív anyagot [például, poli(oxi-etilén) (12) cetosztearil-étert] és hidrofób, nemionos felületaktív anyagot (például szorbitán-észtert vagy mannid-észtert, mint amilyen a szorbitán-monooleát vagy Span 80 ) tartalmazó emulzió. Elõnyös, ha az emulzió termoreverzíbilis és/vagy amelyben az olajcseppek legalább 90 térfogat%¹a 0 nm¹nél kisebb méretû [1]. Az emulzió az alábbiakból egyet vagy többet tartalmazhat: alditol; fagyásgátló ágens (például cukor, mint amilyen a dodecilmaltozid és/vagy szacharóz); és/vagy alkil-poliglikozid. Tartalmazhat továbbá TLR4 agonistát, például olyat, amelynek kémiai szerkezetében nincs cukorgyûrû [16]. Az ilyen emulziókat lehet liofilizálni. Szkvalén, poloxamer és Abil-Care emulziója [17]. Az adjuvált vakcinában e komponensek végkoncentrációja a következõ: % szkvalén, 4% poloxamer (pluronic poliol) és 2% Abil-Care 8 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimetikon; kaprilsav/triglicerid-kaprilát). Az antigén Bár az olaj a vízben adjuvánsok önmagukban is beadhatók betegeknek (például adjuváns hatás biztosítására a betegnek külön beadott antigénhez), sokkal gyakoribb, ha az adjuvánst még a beadás elõtt keverik össze a kérdéses antigénnel. A keverés történhet a gyártás során így a kereskedelmi forgalomba kiadott vakcinakészítmény beadásra kész állapotban van vagy történhet az alkalmazás helyén és idején. Olaj a vízben emulziókkal különféle antigének alkalmazhatók, így például minden korlátozás nélkül az alábbiak: vírusantigének, például a vírusok felszíni fehérjéi; baktériumokból származó antigének, például fehérje és/vagy szacharid típusú antigének; parazitákból származó antigének; és daganatokból származó antigének. A találmány különösen alkalmas az alábbiak elleni vakcinákra: influenzavírus, horogféreg, hepatitis B varus, herpes simplex vírus, veszettség, légúti óriássejtes vírus, citomegalovírus, Staphylococcus aureus, chlamydia, SARS koronavírus, varicella zoster vírus, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Epstein Barr vírus, humán papillomavírus stb. Influenzavírus antigénjei. Ezek az antigének lehetnek élõ vírus vagy inaktivált vírus formájában. Inaktivált vírus alkalmazása esetén a vakcina tartalmazhat teljes viriont, osztott viriont, vagy tisztított, felszíni antigéneket (így hemagglutinint és gyakran ezen felül még neuraminidázt is). Az influenzaantigének viroszómák formájában is bemutathatók [18]. Az antigének a következõk közül választott bármilyen hemagglutinit altípusúak lehetnek: H1, H2, H3, H4, H, H6, H7, H8, H9, H, H11, H12, H13, H14, H1 és/vagy H16. A vakcina tartalmazhat egy vagy több (például 1, 2, 3, 4 vagy több) influenzavírus-törzsbõl így influenza A vírus- és/vagy influenza B vírustörzsbõl származó antigén(eke)t. Az influenzavírus lehet több vírusból származó genetikai állományt hordozó (reasszortáns) és esetleg reverz genetikai eljárásokkal elõállított törzs [például 19 23]. Eszerint, a vírus tartalmazhat egy vagy több, A/PR/8/34 vírusból származó RNS-szegmentumot (jellemzõen 6 szegmenst az A/PR/8/34-bõl, és emellett a HA és N szegmentumokat egy adott vakcinatörzsbõl, azaz ez egy 6:2 arányú reasszortáns). Az antigén forrásaként alkalmazott vírusokat tojásokban (például, fejlõdõ tyúktojásokban) vagy sejttenyészetben lehet tenyészteni. Sejttenyészet alkalmazása esetén a sejtszubsztrátum jellemzõen emlõseredetû sejtvonal, például MDCK; CHO; 293T; BHK; Vera; MRC¹; PER.C6; WI¹38; stb. Influenzavírusok tenyésztésére szolgáló elõnyös emlõseredetû sejtvonalak közé tartoznak az alábbiak: Madin Darby-kutyavesébõl származó MDCK-sejtek [24 27], afrikai zöldmajom (Cercopithecus aethiops) veséjébõl származó Vera-sejtek [28 ], emberi embrionális retinoblasztból származó PER.C6-sejtek [31]. E sejtvonalak széles körben elérhetõk például az American Type Cell Culture (ATCC) gyûjteménybõl [32], a Coriell Cell Repositories [33] raktárból, vagy az European Collection of Cell Cultures (ECACC) gyûjteménybõl. Például, az ATCC különféle, CCL¹81, CCL¹81,2, CRL-186 és CRL- 187 katalógusszámú Vera-sejteket, és CCL¹34 katalógusszámú MDCK-sejteket szállít. PER.C6- sejtek 9229 letéti számon érhetõk el az ECACC-tól. Az emlõseredetû sejtvonalak kevésbé elõnyös alternatívájaként, a vírusok madársejtvonalakon [például 34 36] szaporíthatók. Ilyen madársejtvonalak közé tartoznak a kacsákból származó (például kacsaretina) sejtvonalak vagy tyúkokból származó sejtvonalak, például csirkeembrió-fibroblasztok (CEF) stb. Amennyiben a vírust emlõseredetû sejtvonalon szaporították, a készítmény elõnyösen mentes a tojásfehérjéktõl (például, ovalbumin és ovomucoid) és a

6 csirkeeredetû DNS-tõl, ezáltal a készítmény kevésbé allergén. Humán immunhiányos vírus (Human immunodeficiency virus), ideértve a HIV-1¹et és HIV-2¹õt. Az antigén jellemzõen burokeredetû (envelope) antigén. Hepatitis B vírus felszíni antigének. Ezeket az antigéneket elõnyösen rekombináns DNS-eljárásokkal például Saccharomyces cerevisiae élesztõben történt expresszióval állítják elõ. A natív virális HBsAg-tól eltérõen, az élesztõvel expresszált rekombináns antigén nem glikozilált. Az antigén lehet (az átlagosan körülbelül nm átmérõjû) szferikus részecskéktõl így foszfolipideket tartalmazó lipidmátrixtól lényegében mentes formában. A natív HBsAg részecskéktõl eltérõen, az élesztõben expresszált részecskék foszfatidil-inozitolt tartalmazhatnak. A HBsAg az ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq és adrq+ altípusok bármelyikének formájában lehet. Horogféreg, különösen a kutya horogférge (Ancylostoma caninum). Az antigén lehet rekombináns Ac¹MTP¹1 (asztacinszerû metalloproteáz) és/vagy aszparagin hemoglobináz (Ac-APR¹1), amelyeket bakulovírus/rovarsejt rendszerben lehet szekretált fehérjeként expresszálni [37, 38]. Herpes simplex vírus antigénjei (HSV). A találmányban való alkalmazásra szolgáló elõnyös HSV antigén a gd membrán-glikoprotein. Elõnyös, ha gd HSV¹2 törzsbõl származó dg ( gd2 antigén) alkalmazására kerül sor. A készítményben olyan gd forma alkalmazható, amelyben a C¹terminális membránhorgony-régiót deletálták [39], például a természetes fehérje 1 6. aminosavait és annak C¹terminálisához hozzáadott aszparagint és glutamint tartalmazó csonkolt gd. A fehérje e formája tartalmazza a szignálpeptidet, amelynek lehasítása érett, 283 aminosavat tartalmazó fehérjét eredményez. A horgony deléciója teszi lehetõvé a fehérje oldható formában való elõállítását. Humán papillomavírus antigének (HPV). A találmányban való alkalmazásra elõnyös HPV antigének az L1 kapszidfehérjék, amelyek összeállva vírusszerû részecskékként (VLP¹k) ismert szerkezeteket alkothatnak. A VLP¹k elõállíthatók az L1 élesztõsejtekben (például S. cerevisiae) vagy rovarsejtekben (például Spodoptera sejtek, például S. frugiperda, vagy Drosophila sejtekben) végzett rekombináns expressziójával. Élesztõsejteknél plazmidvektorok hordozhatják az L1 gén(eke)t; rovarsejtek esetében pedig bakulovírus-vektorok hordozhatják az L1 gén(eke)t. Elõnyösebben, a készítmény egyaránt tartalmaz HPV¹16 és HPV¹18 törzsekbõl származó L1 VLPket. E bivalens kombinációt nagyon hatékonynak mutatták ki []. A HPV¹16 és HPV¹18 törzsek mellett, a készítmény HPV¹6 és HPV¹11 törzsekbõl származó L1 VLP-ket is tartalmazhat. Az onkogén HPV törzsek alkalmazása is lehetséges. Egy adott vakcinában HPV törzsenként g/ml (például, körülbelül g/ml) L1 lehet. Antrax antigének. Az antraxot a Bacillus anthracis baktérium okozza. Alkalmas B. anthracis-eredetû antigének közé tartoznak az A komponensek [letális faktor (LF) és ödéma faktor (EF)], amelyeknek lehetnek közönséges védõantigénként (PA) ismert B komponensei. Az antigén igény szerint detoxifikálható. További részletek a hivatkozásokban találhatók. Rákeredetû antigének. Különféle daganatspecifikus antigének ismertek. A találmány alkalmazható olyan antigénekkel, amelyek tüdõrák, melanóma, mellrák, prosztatarák stb. ellen immunválaszt váltanak ki. A találmány víruseredetû felszíni antigéneket és heterológ antigéneket tartalmazó hibrid vagy fúziós fehérjéken alapuló antigénekkel is alkalmazható. Például ismert, hogy HBsAg szekvenciát fuzionálnak heterológ antigénekkel a HBsAg részecskékké való összeállási képességének kiaknázása céljából. Például a 44. számú hivatkozás natív HBsAg részecskékre hasonlító részecskékké spontán összeálló fehérjének HIV¹1 gp1 és HBsAg fúzióival történõ elõállítását ismerteti. E megközelítést maláriavakcinákra is alkalmazták. A 4. számú hivatkozásban leírtak szerint a malária gp190 antigénjébõl akár 61 aminosav alkotta epitópokat illesztettek a HBsAg szekvenciába, és az expresszált hibridrészecskék gp190 elleni immunválaszt tudtak kiváltani állatokban. A 46. hivatkozásban leírtak szerint, a sporozoita felületi (cirkumsporozoita) fehérje 4 tagú szekvenciájának 16 ismétlõdését tartalmazó fehérjét HBsAg-val képzett fúziós fehérjeként expresszáltak. A 47. hivatkozásban leírják a Pfs16 HBsAgval történt fuzionálásával képzett vírusszerû részecskék élesztõben való elõállítását. A 48. hivatkozásban olyan hibrid antigént ismertetnek, amelyben circumsporozoit fehérjét fuzionáltak HBsAg-val. A 49. számú hivatkozás a P. vivax merozoit felszíni 1¹es fehérjéjének C¹terminális régiója fúzióját ismerteti, amely révén 4 nm méretû immunogén részecskék alakultak ki. Így a HBsAg alkalmazása maláriaantigének önmaguktól összeálló részecskeformában való bemutatására a technikában jól ismert. Ennek megfelelõen a találmány vitális felszíni antigént és heterológ antigént tartalmazó hibrid antigénekkel alkalmazható. Különösen az olyan esetekben, ahol a virális felszíni antigén HBsAg, a heterológ antigén származhat a Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae vagy Plasmodium ovale fajokból. HBsAg hibridek elõállítására alkalmas HIV antigének közé tartozik a burokeredetû gp1 glikoprotein vagy annak antigén hatású fragmentumai. HBsAg hibridek elõállítására alkalmas P. falciparum antigének alapulhatnak a circumsporozoita felszíni antigén ( CSP ) valamelyik alegységén, például tartalmazhatja az alegység NANP motívumának 3 ismétlõdését, és/vagy tartalmazhatja a CSP C¹terminális régióját (de jellemzõen nem tartalmazza a 6

7 C¹terminális utolsó 12 aminosavát). Például a találmány alkalmazhatja az RTS -ként ismert antigént, amely a P. falciparum NF4 vagy 7G8 izolátumából származó CSP C¹terminálisának nagy részét (a aminosavak alkotta rész, amely 19 NANP ismétlõdést és a aminosavaknál található T¹sejt-eredetû epitóprégiót tartalmazza) a HBsAg N¹terminálisához (a HBsAg pres2 részének négy aminosaván át) fuzionálva tartalmazza. Az RTS szekvenciája így a következõket tartalmazza: (i) N¹terminális metionin aminosav; (ii) Met-Ala-Pro; (iii) a P. falciparum 7G8 izolátumának CS fehérjéje aminosavának vagy a P. falciparum NF4 izolátumának CS fehérjéje aminosavának megfelelõ 189 aminosav; (iv) Arg vagy Gly; (v) a hepatitis B Pre¹S2 fehérjéjébõl származó Pro-Val-Thr-Asn; és (vi) HBsAg. A vakcina A találmány szerinti eljárással már tesztelt emulziós adjuvánsok alkalmazhatók vakcinák elõállítására. Ahogyan a fentiekben említettük, az emulzió és az antigén összekeverése történhet alkalmilag, az alkalmazás idõpontjában, vagy a vakcina gyártása során. A találmány szerinti eljárások mindkét típusú vakcina elkészítésénél alkalmazhatók. Elõre összekevert vakcina esetében az eljárás elvégezhetõ az adjuvánson még annak antigénnel való összekeverését megelõzõen, és/vagy elvégezhetõ az összekeverés után, és a minõség-ellenõrzésen megfelelõnek talált vakcina eladásra és/vagy terjesztésre bocsájtható. Alkalmi összekeverésre szánt formában szállított vakcinánál az eljárás elvégezhetõ az adjuvánson még azelõtt, hogy azt az antigénnel együtt készletbe csomagolták volna. Eszerint találmány szerinti adjuváns tesztelésére szolgáló eljárás részét képezheti egy további, az adjuváns antigénnel való összekeverésére irányuló feldolgozási lépés. Esetleg az eljárás tartalmazhat egy további csomagolási lépést is, amely során az adjuvánst egy készlet részeként egy készletbe csomagoljuk egy adott antigénkomponenssel. E további lépések elvégzése rendszerint akkor történik, ha az adjuváns átment a minõség-ellenõrzési teszten. A találmány szerinti eljárásokat általában kiszereletlen adjuvánsból vagy bekevert vakcinából vett kis mintán alkalmazzák. Minõség-ellenõrzést e mintán végezzük, és az kiszereletlen adjuvánst akkor csomagoljuk dózisokba, ha a minta átment a minõség-ellenõrzési teszten. Ennek megfelelõen, a találmány szerint eljárásban: kiszereletlen adjuvánsból mintát veszünk; a mintát a fentiekben leírtak szerint teszteljük; majd, ha a minta a teszten átment, akkor kombináljuk a kiszereletlen adjuvánst az antigén kiszereletlen keverékével. A kevert kiszereletlen anyag egységnyi dózisait ekkor kivesszük és eladásra és/vagy terjesztésre csomagoljuk. A találmány egy alternatív megvalósítási módjában, a találmány szerinti eljárásban: kiszereletlen adjuvánsból mintát veszünk; a mintát a fentiekben leírtak szerint teszteljük; majd, ha a minta a teszten átment, akkor a kiszereletlen adjuvánsból egységnyi dózisokat veszünk ki az antigén egységnyi dózisaival való összekeverés céljából. A találmány egy további alternatív megvalósítási módjában, a találmány szerinti eljárásban: kiszereletlen adjuvánsból mintát veszünk; a mintát a fentiekben leírtak szerint teszteljük; majd, ha a minta a teszten átment, akkor a kiszereletlen adjuvánsból egységnyi dózisokat veszünk ki, receptre történõ felhasználásra szolgáló készlet komponenseként való csomagolás céljából, a fentiekben leírtak szerint. A találmány egy további alternatív megvalósítási módjában, a találmány szerinti eljárásban: adjuváns és antigén kiszereletlen keverékébõl mintát veszünk; a mintát a fentiekben leírtak szerint teszteljük; majd, ha a minta a teszten átment, akkor csomagolás céljából a kiszereletlen keverékbõl egységnyi dózisokat veszünk ki. Influenzavakcinák esetében jellemzõ, hogy a vakcina egységnyi dózisai jellemzõen az SRID-vel mért hemagglutinin (HA) tartalomra vannak standardizálva. A jelenleg létezõ vakcinák jellemzõen törzsenként körülbelül 1 g HA¹t tartalmaznak, bár alacsonyabb dózisok is alkalmazhatók, különösen valamilyen adjuvánssal való alkalmazás esetén. Részdózisokat, mint például 1/2 (azaz 7, g HA/törzs), 1/4 és 1/8 [0, 1], de magasabb {például, 3¹szoros vagy 9¹szeres [2, 3]} dózisokat is alkalmaztak már. Eszerint, a vakcinák influenzatörzsenként tartalmazhatnak 0,1 10 g HA¹t, elõnyösen 0,1 0 g HA¹t, például 0,1 g, 0,1 1 g, 0,1 g, 0,1 7, g, 0, g stb. HA¹t. Elõnyös dózisok törzsenként például körülbelül 1 g, körülbelül g, körülbelül 7, g, körülbelül g, körülbelül 3,8 g, körülbelül 1,9 g, körülbelül 1, g stb. HA¹t tartalmaznak. Összegezve, ennek megfelelõen, a találmány kevert vakcinák elõállításakor vagy keverésre kész antigént és adjuvánst tartalmazó készletek elõállításakor alkalmazható. Amennyiben a keverés a gyártás során történik, a már összekevert, kiszereletlen antigén és adjuváns térfogatai jellemzõen 1 liternél nagyobbak, például > liter, > liter, > liter, >0 liter stb. Ha a keverés az alkalmazás idõpontjában történik, a már összekevert térfogatok jellemzõen 1 milliliternél kisebbek, például <0,6 ml, <0, ml, <0,4 ml, <0,3 ml, <0,2 ml stb. Mindkét esetben lényegében azonos térfogatú emulzió- és antigénoldatot szokás összekeverni, azaz, az antigén és az emulzió térfogatának aránya lényegében 1:1 (például, 1,1:1 és 1:1,1 közötti, elõnyösen 1 0:1 és 1:1,0 közötti, elõnyösebben 1,02:1 és 1:1,02 közötti). A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban az adjuváns vagy antigén feleslegben is alkalmazható. Ha az egyik komponenst feleslegben alkalmazzuk, a felesleg általában legalább 1,:1, például >2:1, >2,:1, >3:1, >4:1, >:1 stb. Amennyiben egy készletben az antigén és adjuváns külön komponensként van biztosítva, akkor ezek egymástól fizikailag elkülönülten vannak a készletben, és ez az elkülönítés különféle módokon érhetõ el. Például a komponensek lehetnek külön tartóedényekben, például fiolákban. A két fiola tartalmát az alkalmazáskor lehet összekeverni, például az egyik fiola tartalmá- 7

8 nak eltávolításával és a másik fiolához való hozzáadásával, vagy mindkét fiola külön-külön eltávolításával és ezek egy külön tartályban való összekeverésével. Egy elõnyös elrendezésben a készlet egyik komponense egy fecskendõ és egy másik komponense egy tartály, például fiola. A fecskendõ (például egy tûvel együtt) alkalmazható arra, hogy összekeverés céljából a tartalmát egy másik tartályba töltsük, és a keveréket visszaszívjuk a fecskendõbe. A fecskendõ kevert tartalma jellemzõen egy új steril tû alkalmazásával beadható egy adott betegnek. Az egyik komponens fecskendõbe csomagolásával elkerülhetõ a betegnek való beadáshoz szükséges külön fecskendõ alkalmazása. Egy másik elõnyös elrendezésben, a készlet két komponensét ugyanaz a fecskendõ elkülönülten tartalmazza. Ilyen például az stb. számú hivatkozásokban leírt kétkamrás fecskendõ. A fecskendõ mûködtetésekor (például egy betegnek való beadás során) a két tartály tartalma összekeveredik. Ezzel az elrendezéssel elkerülhetõ a beadáskor szükséges külön keverési lépés. A készlet különféle összetevõinek tartalma általában mind vizes formában van. Bizonyos elrendezésekben, egy adott komponens (jellemzõen inkább az antigén-összetevõ, és nem az emulzió) száraz formában (például liofilizált formában), míg a másik összetevõ vizes formában van jelen. A két komponens összekeverésével lehet a száraz komponenst reaktiválni és vizes készítményt elõállítani a kérdéses betegnek való beadás céljából. A liofilizált komponens jellemzõen inkább fiolában és nem pedig fecskendõben van jelen. A szárított komponensek tartalmazhatnak stabilizálókat, például laktózt, szacharózt, vagy mannitolt, illetve ezek keverékét, például laktóz/szacharóz keverékeket, szacharóz/mannitol keverékeket stb. Egy lehetséges elrendezésben vizes emulziós komponens van elõre betöltve egy fecskendõbe, míg egy fiola tartalmazza a liofilizált antigénkomponenst. Amennyiben a vakcinák az adjuváns és az antigén mellett más összetevõket is tartalmaznak, e további összetevõk a készlet két komponense egyikének, vagy a készlet egy harmadik komponensének részét képezhetik. A találmány szerinti kevert vakcinákhoz vagy egyedi készletösszetevõkhöz alkalmas tartályok közé tartoznak fiolák és eldobható fecskendõk. E tartályoknak sterilnek kell lenniük. Amennyiben a készítmény/összetevõ egy fiolában van, elõnyös, ha a fiola üvegbõl vagy mûanyagból készült fiola. Elõnyös, ha a fiolát még a készítmény hozzáadása elõtt sterilizáljuk. A latexre érzékeny betegekkel kapcsolatos problémák elkerülése végett elõnyös, ha fiolák latexmentes dugóval vannak lezárva, továbbá elõnyös, ha egyik csomagolóanyagban sincs latex. A fiola tartalmazhat egyetlen dózis vakcinát, vagy egynél több dózist, például dózist (többdózisú fiola). Az elõnyös fiolák színtelen üvegbõl készültek. A fiolának lehet olyan kupakja (például Luer lock ), amely úgy van kialakítva, hogy az elõre töltött fecskendõt a kupakba illesztve a fecskendõ tartalmát a fiolába lehessen üríteni (például a fiolában lévõ liofilizált anyag helyreállítására), és a fiola tartalmát vissza lehessen szívni a fecskendõbe. Miután a fecskendõt eltávolítottuk a fiolából, a fecskendõhöz tût lehet csatlakoztatni és a készítményt egy adott betegnek be lehet adni. Elõnyös, ha a kupak a pecséten vagy fedõn belül van, így a kupak elérése elõtt a pecsétet vagy fedõt el kell távolítani. Amennyiben egy adott készítmény/komponens fecskendõbe van töltve, normális esetben a fecskendõhöz egy tû van csatlakoztatva, bár összeállítás és alkalmazás céljából a fecskendõ mellé külön tû is biztosítható. Elõnyösek a biztonsági tûk. Jellemzõek a következõ tûk: 1 inch 23¹gauge, 1 inch 2¹gauge és /8 inch 2¹gauge. A fecskendõket el lehet látni lehúzható címkékkel, amelyeken a tételszám, influenza-idõszak és a tartalom lejárati dátuma van feltüntetve a nyilvántartás megkönnyítése céljából. Elõnyös, ha a fecskendõn van olyan stopper, amely megakadályozza, hogy felszívás közben a dugattyút véletlenül eltávolítsuk. A fecskendõknek latexgumi kupakjuk és/vagy dugattyújuk van. Az eldobható fecskendõk egyetlen dózis vakcinát tartalmaznak. A fecskendõ hegyén általában van egy kupak, amely a tû csatlakoztatása elõtt légmentesen zárja hegyet. Elõnyös, ha ez a kupak butilgumiból készült. Amennyiben a fecskendõ és a tû külön-külön van csomagolva, elõnyös, ha a tû butilgumiból készült védõburokba van beillesztve. Elõnyösek azok a fecskendõk, amelyeket Tip-Lok kereskedelmi néven árusítanak. A tartályokon lehet olyan jel, ami a fél dózist jelzi, például gyermekeknek való beadás elõsegítésére. Például 0, ml¹es dózist tartalmazó fecskendõn lehet olyan jel, ami 0,2 ml térfogatot jelez. Üvegtartály (például fecskendõ vagy fiola) alkalmazása esetén elõnyös, ha inkább boroszilikát-üvegbõl és nem közönséges üvegbõl (soda lime glass) készült tartályt alkalmazunk. A készlet vagy készítmény csomagolása (például ugyanabban a dobozban) tartalmazhat leírást, amelyben a vakcina részletes leírása, például a beadásra vonatkozó utasítások, a vakcinában lévõ antigének részletezése stb. Az utasítás tartalmazhat figyelmeztetéseket is. Például, hogy a vakcinálás után esetleg elõforduló anafilaxiás reakció esetére adrenalinoldatot kell készenlétben tartani stb. Gyógyászati készítmények A találmány szerinti eljárásokkal készített készítmények gyógyászatilag elfogadhatók. Az antigénen és adjuvánson felül tartalmazhatnak más összetevõket, például jellemzõ, hogy egy vagy több gyógyászati hordozót és/vagy kötõanyagot tartalmaznak. Az ilyen összetevõk aprólékos leírása a 62. számú hivatkozásban található. A készítmény tartalmazhat tartósítószereket, például timerozált vagy 2¹fenoxi-etanolt. Azonban elõnyös, ha a vakcina a higanyos anyagoktól lényegében mentes (azaz, kevesebb mint g/ml ilyen anyagot tar- 8

9 talmaznak), például timerozáltól mentes [63, 64]. Elõnyösebbek az olyan vakcinák, amelyekben nincs higany. Izotónikusság szabályozása végett elõnyös, ha a készítmény fiziológiás sót, például nátriumsót tartalmaz. Elõnyös a nátrium-klorid (NaCI), amely 1 és mg/ml koncentrációban lehet jelen. A készítményben esetleg jelen levõ más sók közé tartoznak a következõk: kálium-klorid, kálium-dihidrogén-foszfát, dinátrium-foszfát-dehidrát, magnézium-klorid, kalcium-klorid stb. A készítmények ozmolalitása általában 0 mosm/kg és 0 mosm/kg közé, elõnyösen 2 és 3 mosm/kg közé, és még elõnyösebben a mosm/kg tartományba esik. Korábbi közlemények szerint az ozmolalitásnak nincs hatása a vakcinálás okozta fájdalomra [6], azonban mégiscsak elõnyös, ha az ozmolalitást ebben a tartományban tartjuk. A készítmények egy vagy több puffert is tartalmazhatnak. Jellemzõ pufferek közé tartoznak a következõk: foszfátpuffer, trispuffer, borátpuffer, szukcinátpuffer, hisztidinpuffer vagy citrátpuffer. A készítmények jellemzõen mm koncentrációtartományba esõ mennyiségû puffert tartalmaznak. A készítmény ph¹ja általában,0 és 8,1 közé, és jellemzõen 6,0 és 8,0 közé, például 6, és 7, közé esik. Ennélfogva, a találmány szerinti eljárás tartalmazhatja a kiszereletlen vakcina ph¹értékének a csomagolás elõtti beállítását. Elõnyös, ha a készítmény steril. A készítmény elõnyösen nem pirogén, például dózisonként 1 EU¹t (Endotoxin-egység, egy standard mértékegység), és elõnyösen 0,1-nél kevesebb EU¹t tartalmaz. A készítmény elõnyösen gluteinmentes. A készítmény tartalmazhat egyetlen immunizálásra szolgáló anyagot, vagy tartalmazhat többszörös immunizálásra szolgáló anyagot (például többszörös dózisú készlet). Tartósítószer hozzáadása elõnyös a többszörös dózisú elrendezésekben. Jellemzõ, hogy a vakcinákat körülbelül 0, ml¹es dózistérfogatban adjuk be, bár gyermekeknek fél dózis (azaz körülbelül 0,2 ml) is beadható. Elõnyös, ha a készítményeket és készleteket 2 C és 8 C közötti hõmérsékleten tároljuk. Ezeket nem szabad lefagyasztani. Ideális esetben a közvetlen fénytõl védeni kell Kezelési eljárások és a vakcina beadása A találmány tárgyát a találmány szerinti eljárásokkal elõállított készletek és készítmények képezik. E készletek és készítmények emberi betegnek való beadásra alkalmasak, és a találmány tárgya egy adott betegben immunválasz kiváltására szolgáló olyan eljárás, amelyben ilyen készítményt beadunk egy adott betegnek. A találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen készletek és készítmények gyógyszerként való alkalmazása is. A találmány tárgyát képezi továbbá: (i) egy adott antigénbõl elõállított vizes készítmény; és (ii) a találmány szerint tesztelt olaj a vízben emulziós adjuváns alkalmazása egy adott betegben immunválasz kiváltására szolgáló gyógyszer gyártására. Az ezen eljárásokkal és alkalmazásokkal kiváltott immunválasz általában antitestválaszt, elõnyösen védõ antitestválaszt tartalmaz. A készítmény különféle módokon adható be. Az immunizálás legelõnyösebb módja az intramuszkuláris injekció (például a karba vagy lábba), de vannak más lehetséges immunizálási módok, például a szubkután injekció, intranazális [66 68], orális [69], intradermális [70, 71], transzkután, transzdermális [72] stb. mód. A találmány szerint elõállított vakcinák gyermekek és felnõttek kezelésére egyaránt alkalmazhatók. A beteg lehet 1 évesnél idõsebb, 1 éves, 1 éves, 1 éves, vagy legalább éves korú. A beteg lehet idõsebb (például 0 évesnél idõsebb, elõnyösen 6 évnél idõsebb korú), fiatal (például, évesnél fiatalabb), kórházi beteg, egészségügyi dolgozó, fegyveres testület tagja, terhes nõ, krónikus beteg, immunhiányos beteg, és külföldre utazó személy. A vakcinák nem kizárólag ezekre a csoportokra alkalmazhatók, és általánosabban egy adott populációban alkalmazhatók. A kezelés végezhetõ egyetlen dózisú kezelési rend vagy többszörös dózisú kezelési rend szerint. Többszörös dózis elsõdleges immunizálási rendben és/vagy erõsítõ ( booster ) immunizálási rendben alkalmazhatók. Többszörös dózisú rendben a különbözõ dózisok ugyanazon vagy eltérõ módokon adhatók be, például parenterális indító vagy nyálkahártyán át beadott erõsítõ, nyálkahártyán át beadott indító és parenterális erõsítõ stb. Egynél több (jellemzõen két) dózis beadása különösen az immunológiailag naiv betegeknél különösen hasznos. A többszörös dózisok beadása jellemzõen legalább egyhetes eltéréssel történik (például körülbelül 2 hetenként, körülbelül 3 hetenként, körülbelül 4 hetenként, körülbelül 6 hetenként, körülbelül 8 hetenként, körülbelül 12 hetenként, körülbelül 16 hetenként stb.). A találmány szerinti vakcinák más vakcinák beadásával lényegében azonos idõben (például ugyanazon orvosi konzultáció alatt vagy szakorvosnál tett látogatás során) beadhatók a betegeknek. Általános információk A tartalmaz kifejezésbe a tartalmaz és az áll valamibõl kifejezések egyaránt beletartoznak, például X¹et tartalmazó készítmény állhat kizárólag X¹bõl vagy tartalmazhat valami mást is, például X+Y. A lényegében kifejezés nem zárja ki a teljesen kifejezést, például, egy Y¹tól lényegében mentes készítmény lehet Y¹tól teljesen mentes. Ahol az szükséges, a lényegében kifejezés a találmány meghatározásából kihagyható. Egy adott x numerikus értékre vonatkozó körülbelül kifejezés jelentése például, x±%. Hacsak konkrétan meg nem adtuk, két vagy több összetevõ összekeverésének lépését tartalmazó folyamathoz nincs szükség semmilyen specifikus keverési sorrendre. Eszerint a komponensek bármilyen sorrend- 9

10 ben összekeverhetõk. Három komponens esetén két komponenst összekombinálunk egymással, majd a kombináció kombinálható a harmadik komponenssel stb. Amennyiben a sejtek tenyésztésekor állati (és különösen borjú) eredetû anyagok alkalmazására kerül sor, ezeket olyan forrásokból kell beszerezni, amelyek mentesek a fertõzõ szivacsos agysorvadásoktól [transmissible spongiform encephalopathies (TSEs)], és különösen mentes a kergemarhakórtól [bovine spongiform encephalopathy (BSE)]. Általában elõnyös, ha a sejteket állati eredetû anyagoktól teljesen mentesen tenyésztjük. Ha egy vegyületet egy adott készítmény részeként adjuk be a testbe, a kérdéses vegyület egy alkalmas elõgyógyszerrel esetleg helyettesíthetõ. Az ábrák rövid leírása 1. ábra: Olaj a vízben emulzió különféle sarzsainak szkvaléntartalma (mg/ml). Az elfogadható szkvaléntartalomtól való három eltérést A, B és C betûkkel jeleztük. A találmány kivitelezésének módjai Szkvalén, Span 8, Tween 80, víz és citrátpuffer kombinálásával MF9 adjuvánst készítettünk 0 literes tételekben. Az összetevõket az alábbiakban megadott kívánt végtérfogatnak megfelelõ mennyiségekben kombináltuk: térfogat% szkvalén, 0, térfogat% poliszorbát 80, 0, térfogat% Span 8 és mm citrátpuffer. A keveréket körülbelül 700 bar¹on mikrofluidizáltuk, és a végsõ mikrofluidizált keveréket 0,2 m¹es szûrõn szûrtük. Ezen MF9 tételekben a megcélzott szkvaléntartalom 39±3 mg/ml volt. Az 1. ábra több mint 10 különbözõ gyártási tétel szkvaléntartalmát mutatja be. A megcélzott tartománytól való három eltérés egyértelmû, A C-vel van jelölve. A gyártóberendezés A és B tételekre való vizsgálatakor azt találtuk, hogy a hibás kölcsönhatási kamra miatt a szûrõ eltömõdött, és a cseppek mérete az e tételekre vonatkozó megcélzott felsõ szint fölé emelkedett. Szûrõeltömõdést a C tételeknél is tapasztaltunk, de ez esetben a probléma oka inkább a nem megfelelõ szûrõtípus alkalmazása volt, és nem a kölcsönhatási kamrával kapcsolatos hiba. Eszerint az abnormális szkvalénszintek alkalmasak a különféle szûrési nehézségek kimutatására a szûrõ közvetlen vizsgálata nélkül. Egyértelmû, hogy a találmány csak a példa segítségével van leírva, és különféle módosítások lehetségesek a találmány alapgondolatától való eltérés nélkül. Hivatkozások (amelyek tartalma a kitanítás részét képezi) [1] WO90/ [2] Podda és Del Giudice, Expert Rev Vaccines 2, (03). [3] Podda, Vaccine 19, (01). [4] Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, szerk.: Powell és Newman, kiad.: Plenum Press (199) [] Vaccine Adjuvants, Preparation Methods and Research Protocols, Methods in Molecular Medicine, 42. köt., szerk.: CVHagan. [6] Rothblat és munkatársai, Anal Biochem 4, 2 6 (1962). [7] Lau és munkatársai, Lipids, 23 8 (0). [8] Spanggord és munkatársai, J Pharm Biomed Anal (02). [9] Choo és munkatársai, Lipids, (0). [] Zambonin és munkatársai, Rapid Commun Mass Spectrom, 32 7 (06). [11] Ko és munkatársai, J Agric Food Chem 0, (02). [12] Giacometti Analyst 126, 472 (01). [13] Sulpice és Ferezou, Lipids 19, 631 (1984). [14] WO 99/06776 számú nemzetközi közzétételi [1] US 07/ számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi [16] WO 07/0808 számú nemzetközi közzétételi [17] Suli és munkatársai, Vaccine 22, (04). [18] Huckriede és munkatársai, Methods Enzymol 373, (03). [19] Hoffmann és munkatársai, Vaccine, (02). [] Subbarao és munkatársai, Virology, (03). [21] Liu és munkatársai, Virology 314, (03). [22] Ozaki és munkatársai, J. Virol. 78, (04). [23] Webby és munkatársai, Lancet 363, (04). [24] WO 97/37000 számú nemzetközi közzétételi [2] Brands és munkatársai, Dev Biol Stand 98, 93 0 (1999). [26] Halperin és munkatársai, Vaccine, 12 7 (02). [27] Tree és munkatársai, Vaccine 19, (01). [28] Kistner és munkatársai, Vaccine 16, 9 8 (1998). [29] Kistner és munkatársai, Dev Biol Stand 98, 1 1 (1999). [] Bruhl és munkatársai, Vaccine 19, (00). [31] Pau és munkatársai, Vaccine 19, (01). [32] [33] [34] WO 03/0761 számú nemzetközi közzétételi [3] WO 0/ számú nemzetközi közzétételi [36] WO 03/04341 számú nemzetközi közzétételi [37] Williamson és munkatársai, Infection and Immunity 74, (06).

11 [38] Loukas és munkatársai, PLoS Med 2, e29 (0). [39] EP A számú európai közzétételi [] Harper és munkatársai, Lancet 364, (04). [41] J Toxicol Clin Toxicol, 39, 8 0 (01). [42] Demicheli és munkatársai, Vaccine 16, (1998). [43] Stepanov és munkatársai, J Biotechnol 44, 1 1 (1996). [44] Berkower és munkatársai, Virology 321, 7 86 (04). [4] von Brunn és munkatársai, Vaccine 9, (1991). [46] Vreden és munkatársai, Am J Trap Med Hyg 4, 33 8 (1991). [47] Moelans és munkatársai, Mol Biochem Parasitol 72, (199). [48] Stoute és munkatársai, N Engl J Med 336, (1997). [49] Wunderlich és del Portillo, Mol Med 6, (00). [0] WO01/22992 számú nemzetközi közzétételi [1] Hehme és munkatársai, Virus Res. 3, (04). [2] Treanor és munkatársai, J Infect Dis 173, (1996). [3] Keitel és munkatársai, Clin Diagn Lab Immunol 3, 07 (1996). [4] WO 0/ számú nemzetközi közzétételi [] US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi [6] WO 00/07647 számú nemzetközi közzétételi [7] WO 99/178 számú nemzetközi közzétételi [8] US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi [9] US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi [] EP A 0618 számú európai közzétételi [61] WO 98/01174 számú nemzetközi közzétételi [62] Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (00). [63] Banzhoff, Immunology Letters 71, (00). [64] WO 02/ számú nemzetközi közzétételi [6] Nony és munkatársai, Vaccine 27, (01). [66] Greenbaum és munkatársai, Vaccine 22, (04). [67] Zurbriggen és munkatársai, Expert Rev Vaccines 2, 29 4 (03). [68] Piascik, J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43, 728 (03). [69] Mann és munkatársai, Vaccine 22, (04) [70] Halperin és munkatársai, Am J Public Health 69, (1979). [71] Herbert és munkatársai, J Infect Dis 1, (1979). [72] Chen és munkatársai, Vaccine 21, 28 6 (03). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás olaj a vízben emulziós adjuváns gyártására, amely a következõ lépéseket tartalmazza: (i) szubmikron olaj a vízben emulzió készítése ismert mennyiségû vizes hordozó, felületaktív anyag és szkvalén alkalmazásával; (ii) az emulzió szûréses sterilizálása, sterilizált emulzió biztosítása céljából; (iii) a sterilizált emulzió szkvaléntartalmának mérése; és (iv) a (iii) lépésben mért szkvaléntartalom összehasonlítása az (i) lépésbõl ismert szkvaléntartalommal, ahol, amennyiben a (iv) lépésben végzett összehasonlítás azt mutatja ki, hogy az (i) és (iii) lépések között a szkvaléntartalom lényeges mértékben megváltozott, akkor az adjuváns selejtes. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az adjuváns akkor selejtes, ha a (iii) lépésben mért tartalom több mint ±%-ban különbözik az (i) lépésbõl ismert tartalomtól. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a szkvalén (i) lépésbõl ismert koncentrációja 2 8 térfogat%. 4. Az 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a szkvalén (i) lépésbõl ismert koncentrációja 4 6 térfogat%.. Minõség-ellenõrzési teszteljárás olaj a vízben emulziós adjuvánsokhoz az 1. lépés szerint, ahol az adjuváns szkvalént tartalmaz, és ahol az eljárás az adjuváns aktuális szkvaléntartalmának egy standard szkvaléntartalommal való összehasonlítására szolgáló lépést tartalmaz. 6. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol ha az adjuváns szkvaléntartalma elfogadható, akkor azt antigénnel kombinálják. 7. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol ha az adjuváns szkvaléntartalma elfogadható, akkor azt készlet összetevõjeként egy készletbe csomagolják antigénkomponenssel együtt. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol a készlet összetevõi külön fiolákban vannak. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol a fiolák boroszilikát üvegbõl készültek.. A 7., 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, ahol az adjuváns kiszereletlen adjuváns, és ha az adjuváns szkvaléntartalma elfogadható, akkor az eljárás részét képezi a kiszereletlen adjuvánsból egységnyi dózisok kivétele készletösszetevõként való csomagolás céljából. 11. Az 1. igénypont szerinti minõség-ellenõrzési teszteljárás olaj a vízben emulziós adjuvánst, így szkvalént tartalmazó vakcinára, amely eljárás a következõ lépéseket tartalmazza: (i) az adjuváns aktuális szkvaléntartalmának összehasonlítása egy standard szkvaléntartalommal; és ha az aktuális szkvaléntarta- 11

12 lom elfogadható, akkor (ii) vagy a vakcina elõállítása az adjuváns antigénnel való kombinálásával, vagy az adjuváns becsomagolása egy adott készlet összetevõjeként antigénkomponenssel együtt egy készletbe. 12. Az 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a standard szkvaléntartalom 2 8 térfogat% szkvalénkoncentráció. 13. Az 12. igénypont szerinti eljárás, ahol a standard szkvaléntartalom 4 6 térfogat% szkvalénkoncentráció. 14. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az adjuváns akkor selejtes, ha az aktuális tartalom ±%-nál nagyobb mértékben eltér a standard tartalomtól. 1. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az antigén influenzavírus-antigén. 16. A 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a vakcina influenzavírus-törzsenként körülbelül 1 g, körülbelül g, körülbelül 7, g, körülbelül g, körülbelül 3,8 g, körülbelül 1,9 g vagy körülbelül 1, g hemagglutinint tartalmaz. 17. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a vakcina tiomerzál vagy 2¹fenoxi-etanol tartósítószert tartalmaz. 18. Eljárás, amely tartalmazza az (i) influenzavírusantigén és (ii) szkvalént tartalmazó olaj a vízben emulziós adjuváns összekeverésének lépését, ahol az eljárás tartalmazza továbbá a következõ lépést: az adjuváns szkvaléntartalma az 1. igénypont szerinti eljárással történõ mérése (a) a keverési lépés elõtt az adjuvánsban és/vagy (b) a keverési lépés után az antigén-adjuváns keverékben. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, ahol elõállítási hiba ellenõrzése céljából az (a) vagy (b) lépésben mért szkvaléntartalom standard szkvaléntartalommal kerül összehasonlításra.. Az 19. igénypont szerinti eljárás, ahol a standard szkvaléntartalom 2 8 térfogat% szkvalénkoncentráció Az. igénypont szerinti eljárás, ahol a standard szkvaléntartalom 4 6 térfogat% szkvalénkoncentráció. 22. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az adjuváns akkor selejtes, ha az aktuális tartalom ±%-nál nagyobb mértékben eltér a standard tartalomtól. 23. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol szkvaléntartalom-mérésre az (a) és (b) lépésben is sor kerül. 24. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol szkvaléntartalom mérése az (a) lépésben és nem a (b) lépésben történik. 2. A igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol szkvaléntartalom mérése a (b) lépésben és nem az (a) lépésben történik. 26. A 1 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az influenzavírus-antigén H hemagglutinin altípusú. 27. Az igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az emulzió szkvalént, Tween 80¹at és Span 8¹öt tartalmazó szubmikronos emulzió. 28. Az igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az emulzió szkvalén, tokoferol és Tween 80 emulziója. 29. Az igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az emulzió szkvalént, poli(oxi-etilén)-alkil-éter hidrofil, nemionos felületaktív anyagot és hidrofób nemionos felületaktív anyagot tartalmazó emulzió.. Eljárás olaj a vízben emulziós adjuváns gyártására, amely a következõ lépéseket tartalmazza: (i) szubmikronos olaj a vízben emulzió készítése vizes hordozó, felületaktív anyag és szkvalén ismert mennyiségeinek alkalmazásával, (ii) az emulzió szûréses sterilizálása steril emulzió készítése céljából, és (iii) a szkvaléntartalom mérése a sterilizált emulzióban, ahol az emulzió szkvalén, tokoferol és Tween 80 emulziója. 12

13 HU T2 Int. Cl.: A61K 39/39 13

14 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest