!HU000006471T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 006 471 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 0 71740 (22) A bejelentés napja: 0. 01. 12. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 0071740 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 17042 A1 0. 08. 11. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 17042 B1 09. 08. 19. (1) Int. Cl.: C12N /01 (06.01) C12P 7/18 (06.01) C12N 9/02 (06.01) C12P 7/28 (06.01) C12N 1/21 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0073364 PCT/FR 0/000070 () Elsõbbségi adatok: 0400214 04. 01. 12. FR (72) Feltalálók: MEYNIAL-SALLES, Isabelle, F-3140 Fourquevaux (FR); GONZALEZ, Benjamin, F-6 Riom (FR); SOUCAILLE, Philippe, F-3140 Deyme (FR) (73) Jogosult: Metabolic Explorer, 633 Saint Beauzire (FR) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) 1,2-Propándiolt elõállító, evolvált mikroorganizmus HU 006 471 T2 A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
2 3 40 4 0 A találmány tárgyát képezi új eljárás 1,2-propándiolt termelõ, evolvált mikroorganizmus elõállítására, az így elõállított, evolvált mikroorganizmus, valamint annak alkalmazása 1,2-propándiol elõállítására. Az 1,2-propándiol vagy más néven propilénglikol egy C3¹dialkohol, egy vegyi termék, amelyet számos területen alkalmaznak. Telítetlen poliésztergyanták, folyékony detergensek, hûtõ- és fagyálló ágensek, valamint repülõgépek jégmentesítõ folyadékának az összetevõje. A propilénglikol alkalmazása az 1993 1994 évek óta terjedt el etilénszármazékok helyettesítésére, amelyekrõl felismerték, hogy toxikusabbak, mint a propilénszármazékok. Az 1,2-propándiolt jelenleg vegyi úton állítják elõ, propilén-oxid hidratálási eljárással, amely nagy mennyiségû víz alkalmazásával jár. A propilén-oxid elõállítása két eljárással végezhetõ, az egyik epiklórhidrint, a másik hidroperoxidot alkalmaz. Mindkét eljárás erõsen toxikus termékeket alkalmaz. Ezen túlmenõen, a hidroperoxid-eljárás olyan melléktermékek képzõdésével jár, mint a terc-butanol vagy az 1¹feniletanol, amelyek számára alkalmazási területet kell találni ahhoz, hogy a propilén-oxid elõállítása rentábilis legyen. A vegyi eljárás általában racém 1,2-propándiolt állít elõ, ahol az (R)-1,2-propándiol és az (S)-1,2-propándiol-sztereoizomerek különbözõ célokra alkalmazhatók. Az 1,2-propándiol vegyi eljárással történõ elõállításának a hátrányai ígéretes alternatívává teszik biológiai elõállítását. Számos mikroorganizmus képes természetes úton (S)¹ vagy (R)-1,2-propándiolt elõállítani cukrokból, például glükózból vagy xilózból, amelyek glikolízis útján metabolizálódnak, vagy dezoxihexózokból, ami (S)-1,2-propándiol képzõdéséhez vezet [Cameron D. C. és mtsai.: Biotechnol. Prog. (1998)]. A legjobban teljesítõ baktériumok közé tartoznak a Clostridium sphenoides [Tran Din K. és mtsai. (1986)] és a Thermoanaerobium thermosaccharolyticum [Altaras N. E. és Cameron D. C. (01)]. Ez utóbbi több típusú cukrot képes (R) 1,2-propándiollá fermentálni, a felhasznált glükóz egy grammjára vonatkoztatva 0,13 0,28 g 1,2-propándiolhozam mellett. E két mikroorganizmus esetében az 1,2- propándiol-szintézisért felelõs enzimeket nem azonosították, és teljesítményük javítását korlátozza, hogy nem állnak rendelkezésre megfelelõ genetikai eszközök. Egyébként bár az E. coli az 1,2-propándiol elõállításához szükséges minden gént hordoz, a természetben nem termel 1,2-propándiolt. Ugyanis az 1,2-propándiolt metil-glioxálból kell elõállítani, amely sejtek számára már kis koncentrációban erõsen mérgezõ vegyület. Továbbá, az US 6 3 32 és US 6 087 140 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások, valamint a WO 98/374 számú nemzetközi közzétételi irat olyan E. coli-törzseket alkalmazó eljárásokat ismertetnek, amely E. coli-törzseket genetikailag úgy módosítottak, hogy 1,2-propándiolt állítsanak elõ. Ezek az eljárások elsõsorban az 1,2-propándiol elõállításának a metabolikus útjában részt vevõ, egy vagy több enzimnek a fokozott expresszióját alkalmazzák úgy, hogy azok génjét plazmidokba klónozzák, és ezért antibiotikum alkalmazásával végzett szelekciós nyomást igényelnek. A törzsek teljesítményének a javítása érdekében bizonyos endogén géneket deletáltak is [lásd például Alteras N. E. és Cameron D. C: Biotechnol. Prog. 16, 940 946 (00); Alteras N. E. és Cameron D. C: Appl. Env. Microb. 6, 1180 118 (1999)]. Napjainkig nem ismertettek még 1,2-propándiolt és acetont, két elõnyös terméket együtt elõállító, evolvált mikroorganizmust alkalmazó eljárást. A találmány tárgyát képezi tehát eljárás egyszerû cukorforrás metabolizmusa révén 1,2-propándiolt elõállító, evolvált mikroorganizmustörzs elõállítására, tpia gén delécióját, valamint metil-glioxált (propanalt) laktáttá konvertáló egyik enzimet kódoló legalább egy gén delécióját hordozó kiindulási törzsbõl, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a kiindulási törzs tenyésztését egyszerû cukorforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben, olyan szaporodási-hígítási arányok alkalmazásával, amelyek mellett a tápközegben csak azok a mikroorganizmusok maradnak fenn, amelyek szaporodási rátája azonos, vagy jobb, mint az elõírt hígítási arány, abból a célból, hogy a kiindulási törzsben egy vagy több, DHAP-nak metilglioxállá, majd 1,2-propándiollá történõ bioszintézisének az anyagcsereútjában részt vevõ gént evolúciónak vessünk alá javított 1,2-propándiolszintetáz -aktivitást mutató, evolvált gének irányába, és a javított 1,2-propándiol-szintetáz -aktivitást mutató mikroorganizmustörzs vagy törzsek szelektálását és izolálását. A tpia gén a triózfoszfát-izomerázt kódolja, amely a DHAP-nak gliceraldehid-3-foszfáttá történõ konverzióját katalizálja. E gén deletálásának a célja elegendõ mennyiségû metil-glioxál szintézisének a biztosítása. Elméletileg, a tpia gén deletálásának biztosítania kell, hogy a sejtek által metabolizált glükóz szénatomjainak 0%¹a dihidroxi-aceton-foszfátnak metil-glioxállá történõ átalakulása céljára hasznosuljon. A metil-glioxálnak (propanalnak) laktáttá történõ konverziójában részt vevõ legalább egy gén deletálásának a célja a metil-glioxálnak laktáttá történõ konverziójának a gátlása oly módon, hogy úgy a kiindulási törzsben, mint az elõállított, evolvált törzsben jelen levõ és termelt metil-glioxált a sejt gépezete lényegében 1,2-propándiol elõállítására fordítsa. A metil-glioxálnak (propanalnak) laktáttá történõ konverziójában részt vevõ gének a glioxiláz I enzimet kódoló gloa gén (amely laktoil-glutation szintézisét katalizálja metil-glioxálból) és laktaldehid-dehidrogenázt [amely (S)-laktát szintézisét katalizálja (S)-laktaldehidbõl] kódoló alda és aldb gének közül választott. Elõnyösen, a kiindulási törzs mindhárom, azaz a gloa, alda és aldb gének delécióját hordozza. Elõnyösen, a kiindulási törzsön további kiegészítõ módosítást végzünk, amely tartalmazza a glükóz természetes, NADH formájában redukáló ekvivalenseket fogyasztó fermentálási útjainak a szuppresszálását abból a célból, hogy elimináljunk olyan anyagcsereutakat, 2
amelyek az 1,2-propándiol termelõdésével versengenek. Különösen elõnyös a piruvátból laktát szintézisét katalizáló laktát-dehidrogenázt kódoló ldha gén deletálása, valamint az acetil-coa-ból etanol szintézisét katalizáló alkohol-aldehid-dehidrogenázt kódoló adhe gén deletálása. Hasonlóképpen, elérhetõ, hogy a mikroorganizmus anaerob körülmények mellett piruvát-dehidrogenáz komplexet alkalmazzon acetil-coa és NADH elõállítására piruvátból. Ez úgy érhetõ el, hogy a piruvát-formát-liázt kódoló pfla és pflb géneket deletáljuk. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a kiindulási törzsbõl az ldha, pfla, pflb és adhe gének közül választott legalább egy gént deletáljuk, elõnyösen ldha, pfla, pflb és adhe gének mindegyikét deletáljuk. Még elõnyösebben, a találmány szerinti kiindulási törzs tartalmaz továbbá legalább egy gént, amely olyan enzimet kódol, amely kedvez piruvátnak acetáttá történõ anaerob metabolizálódásának. Elõnyösen, az enzim a piruvát anaerob metabolizmusának acetil-coa és NADH elõállítása irányába kedvez. Elõnyösebben, ez az enzim piruvát-dehidrogenáz komplex. Elõnyösen, a piruvát acetáttá történõ anaerob metabolizálódásának kedvezõ enzimet kódoló fenti gén kevéssé érzékeny NADH általi gátlásra. Ez a gén lehet endogén proteint kódoló endogén gén, vagy endogén vagy exogén enzimet kódoló exogén gén vagy heterológ gén. NADH általi gátlásra érzékeny, endogén proteint kódoló endogén gén esetében, a találmány szerinti evolúciós eljárás lehetõvé teszi javított 1,2-propándiolszintetáz -aktivitású törzsek szelektálását, amelyekben a fenti, piruvátnak acetáttá történõ anaerob metabolizálódásának kedvezõ enzimet kódoló gén evolvált enzimet kódol, amely csökkent NADH általi gátlást mutat. A találmány további megvalósítási módja szerint, a kiindulási törzsbe heterológ gént vihetünk be, amely NADH általi gátlásra csökkent érzékenységet mutató enzimet kódol, vagy érzékeny enzimet kódol, amelyet azonban a találmány szerinti evolúciós eljárással csökkentett érzékenységûvé tettünk. Ezen túlmenõen, elõnyös továbbá deletálni az Entner Doudoroff-anyagcsereútban részt vevõ elsõ enzimet, a 6¹foszfoglukonát-dehidratázt kódoló edd gént, abból a célból, hogy elkerüljük a glükóz közvetlen metabolizálódását gliceraldehid-3-foszfáttá és piruváttá, és ezáltal kényszerítsük a glükóz konvertálódását 1,2- propándiollá és acetáttá. Elõnyösen, az elõzõleg izolált, a találmány szerinti evolúciós eljárással kapott, evolvált törzsbe acetil-coanak és acetátnak acetonná történõ konvertálásában részt vevõ egy vagy több enzimet kódoló, heterológ gént viszünk be abból a célból, hogy módosított evolvált törzset kapjunk. Ez az új módosítás lehetõvé teszi 1,2-propándiol mellett aceton elõállítását, amely értékes melléktermék. A módosítás elõnye ezenkívül, hogy javítja az 2 3 40 4 0 1,2-propándiol elõállításának a teljesítményét. Valójában az acetát már kis koncentrációban ( g/l) gátolja baktériumok szaporodását és kemosztátban gyorsan blokkolja az anaerob körülmények mellett tenyésztett törzs teljesítményének a fejlõdését. Az acetátnak acetonná transzformálását katalizáló enzimeket kódoló gének bevitele az evolvált törzsbe csökkenti a kemosztát tenyészetben a reziduális acetát koncentrációját. Aceton termelõdik, amely vegyület sokkal kevésbé gátolja a szaporodást, mint az acetát, így a körülmények kedveznek a törzs szaporodásának és 1,2-propándiol termelõdésének. Az acetil-coa és acetát konverziójában részt vevõ egy vagy több enzimet kódoló heterológ gén vagy gének elõnyösen a C. acetobutylicumból származnak. Az acetil-coa¹t és acetátot acetonná konvertáló egy vagy több enzimet kódoló gének expresszáltathatók kromoszomálisan vagy extrakromoszomálisan. Kromoszomálisan, egy vagy több kópiát vihetünk be a genomba szakember számára jól ismert rekombinációs eljárásokkal. Extrakromoszomálisan, a géneket különbözõ típusú plazmidok hordozhatják, amelyek replikációs origó, kópiaszám és sejten belüli stabilitás tekintetében eltérnek egymástól. Jelen lehetnek 1 kópiaszámban, kópiaszámban vagy több mint 00 kópiaszámban, amelyek alacsony kópiaszámú, egyetlen replikációs eredetû, strict típusú plazmidoknak (psc1, RK2), alacsony kópiaszámú plazmidoknak (pacyc, prsf) vagy nagy kópiaszámú plazmidoknak (psk bluescript II) felelnek meg. A gének expresszáltathatók különbözõ erõsségû, indukálható vagy nem indukálható promoterek alkalmazásával. Ilyenek például a szakember számára jól ismert Ptrc, Ptac, Plac vagy más promoterek. A célgének mûködése mrns¹t [Carrier és Keasling Biotechnol. Prog., 8 64 (1998)] vagy proteineket (például GSTtags, Amersham Biosciences) stabilizáló vagy destabilizáló elemek által fokozható vagy csökkenthetõ. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a korábban kapott, módosított, evolvált törzset szelekciós nyomás mellett, egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben tenyésztjük abból a célból, hogy a módosított, evolvált törzsben egy vagy több olyan gént evolváljunk, amely részt vesz acetil-coa és acetát konverziójában javított aceton-szintetáz -aktivitás irányába, majd ezt követõen olyan, második generációs, evolvált mikroorganizmusokat szelektálunk és izolálunk, amelyek javított 1,2-propándiol-szintetáz és javított aceton-szintetáz -aktivitást mutatnak. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti kiindulási törzs, amelyet fentebb, alább és a példákban ismertetünk, és amely hordozza továbbá az alda és/vagy aldb gének delécióját, és/vagy amelyben a NADH¹t fogyasztó, glükózt fermentáló természetes utakat szuppresszáltuk, és/vagy amely hordozza továbbá az adhe és ldha gének delécióját, és/vagy amelyben a piruvát-dehidrogenáz komplex lipoamiddehidrogenázát kódoló lpd génben pontmutációt hordoz, amely az. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítését jelenti, és/vagy hordozza továbbá a pfla és pflb és/vagy az edd gének delécióját. 3
2 3 40 4 0 A találmány tárgyát képezi továbbá evolvált törzs, amely javított 1,2-propándiol-szintetáz -aktivitást mutat és amelyben az lpd gén pontmutációt hordoz, amely az. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítését jelenti, ebbe a definícióba tartoznak olyan második generációs evolvált törzsek, amelyek ezen túlmenõen javított aceton-szintetáz -aktivitást mutatnak. Végül, a találmány tárgyát képezi eljárás 1,2-propándiol elõállítására, amely szerint egyszerû cukorforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegben olyan evolvált törzset tenyésztünk, amelyben az lpd gén az. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítésével pontmutációt hordoz, majd ezt követõen kinyerjük a termelt 1,2-propándiolt és adott esetben az acetont, amelyeket ezt követõen megtisztítunk. A találmány szerinti módosított, kiindulási és evolvált mikroorganizmusok lehetnek prokarióták vagy eukarióták, amelyek alkalmasak transzformálásra és tenyésztésre, abból a célból, hogy 1,2-propándiolt és adott esetben acetont állítsanak elõ. Szakember sejtbiológiai és molekuláris biológiai általános ismeretei alapján képes a fenti mikroorganizmusok kiválasztására, valamint adott esetben ezen mikroorganizmusoknak a fent ismertetett E. coli géneknek megfelelõ génjeinek az azonosítására. A leírásban mikroorganizmustörzs kifejezés alatt egyetlen azonos fajba tartozó mikroorganizmusok összességét értjük, amely az adott faj legalább egy mikroorganizmusát tartalmazza. Ennek megfelelõen, a törzsrõl megállapított jellemzõk érvényesek az adott törzs minden mikroorganizmusára. Megfordítva, az adott törzs mikroorganizmusainak bármelyikérõl megállapított jellemzõk érvényesek a mikroorganizmusok azon összességére, amelybe tartozik. A találmány szerinti módosított mikroorganizmusok lehetnek baktériumok, élesztõk és gombák, és elõnyösen az alábbi fajok közül választottak: Aspergillus, Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Gluconobacter, Pseudomonas, Rhodococcus, Saccharomyces, Streptomyces, Xanthomonas és Candida. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a baktériumtörzs Escherichia-törzs, elõnyösen E. coli-törzs. Más megvalósítási mód szerint a baktériumtörzs Corinebacterium-törzs, elõnyösen C. glutamicum-törzs. Egy további megvalósítási mód szerint az élesztõtörzs Saccharomyces-törzs, elõnyösen S. cerevisiae. A találmányt fentebb, az alábbiakban és a példákban E. colira, vonatkoztatva ismertetjük. Ennek megfelelõen a géneket, amelyek a találmány szerint evolvált törzsekben deletálhatók vagy erõsen expresszáltathatók, alapjaiban az E. coli-gének elnevezései alkalmazásával definiáltuk. Az elnevezések alkalmazása azonban általánosabb jelentésû és tartalmazza más mikroorganizmusok megfelelõ génjeit. Valójában, az E. coli GenBank referenciái alkalmazásával, szakember képes meghatározni az E. colitól eltérõ mikroorganizmustörzsekben ekvivalens géneket. Homológ szekvenciák azonosításának és a homológia százalékos meghatározásának a módjai szakember számára jól ismertek, ide sorolva például a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ webhelyen található BLAST programokat, amelyek a honlapon megadott, alapértelmezett paraméterekkel alkalmazhatók. A kapott szekvenciák felhasználhatók (egymáshoz illeszthetõk) például a CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) vagy a MULTALIN (http://prodes.toulouse.infra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl) programok alkalmazásával, a honlapokon megadott, alapértelmezett paraméterekkel. Ismert génekrõl a GenBank adatbázisban megadott referenciák alkalmazásával szakember képes ekvivalens géneket azonosítani más organizmusokban, baktériumtörzsekben, élesztõben, gombában, emlõsökben, növényekben és másokban. Ez a rutinmunka elõnyösen konszenzusszekvenciák alkalmazásával végezhetõ el, amelyek úgy határozhatók meg, hogy szekvencia-összerendezést végzünk más organizmusokból származó génekkel, majd degenerált próbákat tervezünk, amelyek lehetõvé teszik a megfelelõ gén klónozását egy másik organizmusban. Ezek a molekuláris biológiai eljárások szakember számára jól ismertek, és azokat például Sambrook és mtsai. ismertetik [Sambrook és mtsai.: Molecular cloning: a laboratory manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1989)]. A leírásban deléció alatt a deletált gén aktivitásának szuppresszálását értjük. A szuppresszió lehet az érintett gén expressziós termékének arra megfelelõ eljárással történõ inaktiválása, vagy az érintett gén expresszálódásának a gátlása, vagy az érintett gén legalább egy részének a deletálása oly módon, hogy vagy az expresszálódása nem történik meg (például az expresszálódáshoz szükséges promoterrégió egy részének vagy egészének a deletálása révén), vagy az expressziós termék elveszti aktivitását (például az érintett gén kódolórészében történt deléció révén). Elõnyösen, adott gén deletálása tartalmazza a gén lényeges szuppresszálását, valamint adott esetben markergénnel történõ helyettesítését, amely lehetõvé teszi a találmány szerinti evolvált törzsek azonosítását, izolálását és tisztítását. Adott gén inaktiválása elõnyösen homológ rekombinációval végezhetõ [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K 12 using PCR products, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640 664 (00)]. Ilyen eljárás elvét röviden az alábbiakban ismertetjük: a sejtbe in vitro elõállított, lineáris DNS-fragmenst viszünk be, amely fragmens tartalmazza a gén két határoló régióját, valamint a két határolórégió között legalább egy szelekciós gént (általában egy antibiotikumrezisztencia-gént), a lineáris fragmens ezáltal egy inaktív gént képez. Rekombinációs eseményen átesett és a bevitt fragmenst integráló sejteket szelektív tápközegre szélesztéssel szelektáljuk. Ezt követõen kettõs rekombinációs eseményen átesett sejteket szelektálunk, amelyekben a natív gént inaktivált gén helyettesíti. A protokoll javítható pozitív és negatív szelekciós rendszerek alkalmazásával abból a célból, hogy gyorsítsuk a kettõs rekombinációs események detektálását. 4
Az ilyen géneknek a törzsbe való bevitelére elõnyösen alkalmazott eljárás az elektroporálás, amely szakember számára jól ismert. Az eljárás az alábbiak szerint ismertethetõ röviden: az adott heterológ géneket expressziós vektorba klónozzuk, promoter- és terminátorszekvenciák közé. A vektor tartalmaz továbbá antibiotikumrezisztencia-gént abból a célból, hogy az azt tartalmazó sejtek szelektálhatók legyenek, valamint a gazdatörzsben funkcionálisan mûködõ replikációs origót, hogy a vektor fenn tudja tartani magát. A protokollhoz elektrokompetens gazdasejteket kell elõállítani, amelyeket ezt követõen a vektorral elektroporálással transzformálunk. A találmány szerint, az elektroporálással bevitt gének elõnyösen az adc, ctfa és B, valamint a thl gének, amelyek rendre a Clostridium acetobutylicum acetont természetes úton elõállító anyagcsereútjának acetoacetát-karboxiláz, koenzim-a-transzferáz és tioláz enzimeit kódolják, amely mikroorganizmusról jól ismert, hogy kitûnõ teljesítménnyel állít elõ biológiai úton acetont. A találmány szerinti evolúciós eljárás evolvált mikroorganizmusok elõállítását szolgáló eljárás, amely lehetõvé teszi anyagcsereutak módosítását, és amely eljárás elõnyösen az alábbi lépéseket tartalmazza: a) mikroorganizmus módosítását abból a célból, hogy kiindulási mikroorganizmust kapjunk, oly módon, hogy a kiindulási mikroorganizmust meghatározott tápközegen tenyésztve, gátoljuk olyan metabolit termelõdését vagy fogyasztását, amely egyébként fogyasztásra vagy termelõdésre került volna, b) a fenti, meghatározott tápközegen elõzõleg kapott, módosított mikroorganizmusok tenyésztését abból a célból, hogy evolúciót idézzünk elõ, a meghatározott tápközeg tartalmazhat a evolúcióhoz szükséges koszubsztrátot, c) a módosított mikroorganizmusok azon sejtjeinek szelektálását, amelyek szaporodni képesek a meghatározott tápközegen, adott esetben koszubsztrát hozzáadása mellett. Ilyen evolúciós eljárást ismertet a WO 04/07669 számú nemzetközi közzétételi irat. Az evolúciónak alávetett anyagcsereút elõnyösen az 1,2-propándiol-bioszintézisút, és adott esetben az acetonbioszintézis¹út. A leírásban meghatározott tápközeg kifejezés alatt ismert molekuláris összetételû tápközeget értünk, amelyet az adott mikroorganizmus szaporodásához adaptáltak. A meghatározott tápközegbõl lényegében hiányzik a metabolit, amelynek a termelõdését vagy fogyasztását a módosítás realizálása szuppresszálja. A leírásban koszubsztrát kifejezés alatt a szubsztráttól eltérõ, szerves vagy szervetlen molekulát értünk, amely részt vesz olyan reakcióban, amely során egy vagy több atomot átad a szubsztrátnak a termék elõállításához. A koszubsztrátnak nincs ismert mutagén tulajdonsága. A leírásban szelekció alatt olyan tenyésztési eljárást értünk, amely adott esetben folyamatos, és amelyet növekvõ mértékû hígítás alkalmazásával végzünk 2 3 40 4 0 abból a célból, hogy a tápközegben csak olyan organizmusok maradjanak fenn, amelyek szaporodási üteme azonos vagy nagyobb, mint az alkalmazott hígítás mértéke. Ezt végezve, olyan mikroorganizmusokat tartunk meg, amelyek oly módon fejlõdtek, hogy a véghez vitt módosítás már nem érinti a szaporodásukat. A leírásban evolvált gén kifejezés alatt nukleinsavak egymást követõ sorát értjük, amelyet fázisban lévõ startkodon és stopkodon határol, és amely szelekció után legalább egy nukleinsavban eltér a kiindulási szekvenciától. A leírásban evolvált protein alatt aminosavak egymást követõ sorát (proteinszekvenciát) értünk, amely szelekciót követõen legalább egy aminosavban eltér a kiindulási proteinszekvenciától. A gének és proteinek azonosíthatók primer szekvenciájuk alapján, továbbá szekvenciahomológia vagy szekvencia-összerendezés révén is, amely proteinek csoportját definiálja. A PFAM ( Protein families databasa of alignements and hidden Markov Models ; http://www.sanger.ac.uk/software/pfam/) modellek proteinek szekvencia-összerendezésének nagy gyûjteményét képviselik. Minden egyes PFAM lehetõvé teszi számos összerendezés és proteindomén láttatását, az organizmusok közötti elterjedések értékelését, hozzáférést más adatbázisokhoz, valamint proteinek ismert szerkezetének a láttatását. COG ( Clusters of Orthologous Groups of proteins ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/) klasztereket úgy kapnak, hogy fõ filogenetikai vonalat képviselõ, teljesen megszekvenált 43 genomból származó proteinszekvenciát hasonlítanak össze. Minden egyes COG¹ot legalább három vonalból határoznak meg, ami ezáltal lehetõvé teszi õsi, konzervált domének azonosítását. A leírásban tenyésztés és fermentálás kifejezéseket egyaránt alkalmazzuk baktériumok egyszerû szénforrást tartalmazó, megfelelõ tápközegen történõ szaporodásának a jelölésére. A leírásban egyszerû szénforrás kifejezés alatt szakember által, adott mikroorganizmus, közelebbrõl, adott baktérium szokásos szaporítására alkalmazható szénforrásokat értünk, amelyek lehetnek például arabinóz, fruktóz, galaktóz, laktóz, maltóz, szacharóz és xilóz. Az egyik leginkább elõnyös, egyszerû szénforrás a glikóz. A találmány szerinti mikroorganizmusok tenyésztési körülményei (fermentálás) szakember számára jól ismertek. Közelebbrõl, a baktériumokat C, elõnyösen 2 40 C, elõnyösebben C hõmérsékleten fermentáljuk, még közelebbrõl, a C. glutamicum és S. cerevisiae organizmusokat körülbelül C¹on és az E. coli baktériumot körülbelül C¹on fermentáljuk. A tenyésztést általában fermentorokban végezzük, ismert, meghatározott, ásványi összetételû tápközegben, amelyet az alkalmazott baktériumra adaptáltunk, és amely legalább egy egyszerû szénforrást, és adott esetben a metabolit elõállításához szükséges kofaktort tartalmaz.
Közelebbrõl, E. coli tenyésztésére a tápközeg lehet például az M9 tápközeggel azonos vagy ahhoz hasonló, ásványi tápközeg [Anderson: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32, 1 128 (1946)], M63 tápközeg [Miller: A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992)], vagy Schaefer és mtsai. által ismertetett tápközeg [Anal. Biochem. 270, 88 96 (1999)], és különösen az alábbi tápközeg: K 2 HPO 4 N.T.A. Nyomelemoldat* (NH 4 ) 2 SO 4 NaCl NaHCO 3 MgSO 4 Glükóz Nátrium-nitrát Tiamin FeSO 4 Élesztõkivonat Spektinomicin 1,g/l 0,2 g/l,ml/l 1,g/l 0,2 g/l 0,2 g/l 0,2 g/l 0 g/l 0,424 g/l,mg/l 0,mg/l 4,g/l 0,mg/l A közeg ph¹ját nátronlúggal 7,4 értékre állítjuk. *nyomelemoldat: citromsav (4 g/l), MnSO 4 (3 g/l), NaCl (1 g/l), CoCl 2 (0,1 g/l), ZnSO 4 (0, g/l), CuSO 4 ( mg/l), H 3 BO 3 ( mg/l) és NaMoO 4 ( mg/l). Hasonlóképpen, a C. glutamicum esetében az ásványi tápközeg lehet például a BMCG tápközeggel azonos vagy hasonló összetételû tápközeg [Liebl és mtsai.: Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 2 (1989)], vagy Riedel és mtsai. által ismertetett tápközeggel azonos vagy hasonló összetételû tápközeg [J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 73 83 (01)]. A fermentálást elõnyösen anaerob körülmények mellett végeztük és kemosztátban, azaz folyamatos táplálás és állandó hígítási ráta mellett, a fenti minimáltápközegben a szénforrás koncentrációját állandó értéken tartottuk és a kemosztátot nitrogénnel gáztalanítottuk. A fermentációs tápközegben a szénforrás koncentrációját csak addig emeltük, amíg a reziduális szénforrás koncentrációja által limitált folyamatos üzemmódot elértük, és az több napon át stabil maradt. A kemosztátban végzett tenyésztési eljárás bizonyult elõnyös eljárásnak, mivel az kedvez a módosított törzs szaporodási és 1,2-propándiolt elõállító teljesítménye javításának, valamint lehetõvé teszi az evolvált mikroorganizmusok izolálását. A leírásban javított 1,2-propándiol-szintetáz -aktivitás alatt DHAP-nak 1,2-propándiollá történõ konvertálásának anyagcsereútjában részt vevõ, javított enzimaktivitások összességét értjük. Az evolvált mikroorganizmusban a javított enzimaktivitás az evolvált mikroorganizmus által elõállított 1,2-propándiol mennyiségének a növelését eredményezi, szemben a megfelelõ, 2 3 40 4 0 kiindulási mikroorganizmus által termelt mennyiséggel, azonos tenyésztési körülmények mellett. A leírásban javított aceton-szintetáz -aktivitás alatt acetátnak és acetil-coa-nak acetonná történõ konvertálási anyagcsereútjában részt vevõ, javított enzimaktivitások összességét értjük. A második generációs evolvált mikroorganizmusban a javított enzimaktivitás a második generációs evolvált mikroorganizmus által elõállított aceton mennyiségének a növelését eredményezi, szemben a megfelelõ, transzformált, evolvált kiindulási mikroorganizmus által termelt mennyiséggel, azonos tenyésztési körülmények mellett. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti eljárással elõállított, evolvált törzsekben evolvált gének, valamint ezen evolvált gének által kódolt, evolvált proteinek izolálása és karakterizálása. A evolvált gének ezt követõen megfelelõ regulálóelemek szabályozása alatt bevihetõk gazdaorganizmusba abból a célból, hogy a gazdaorganizmusban expresszálódjanak és lehetõvé váljon a megfelelõ evolvált protein elõállítása. A módosított mikroorganizmusok, közelebbrõl az E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb teljesítményének a javulása a kemosztátban történõ tenyésztés során arra utal, hogy ezek a tenyésztési körülmények lehetõvé teszik funkcionális endogén piruvát-dehidrogenáz komplex szelektálását anaerob körülmények mellett, amely körülmények NADH bõséges termelõdésének kedveznek. Valójában ismert, hogy a piruvát-dehidrogenáz komplex, amely piruvát átalakulását katalizálja acetil-coa¹vá, NADH felszabadulása mellett, csak aerob körülmények mellett funkcionál, míg anaerob körülmények mellett a piruvát-formát-liáz funkcionál és katalizálja piruvát átalakulását acetil-coa¹vá és formáttá [Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A., Teixeira de Mattos M. J. és Neijssel O. M. (1993)]. Tehát az 1,2- propándiol termelése céljából konstruált, módosított E. coli-törzsön végzett módosítások egyike a piruvát-formát-liáz-aktivitást kódoló pfla és pflb gének deletálása. A módosított sejt számára egyetlen lehetõség a piruvátnak acetil-coa¹vá történõ metabolizálása piruvátdehidrogenáz által, egy NADH elõállítása mellett. Jellemeztük a módosított, evolvált törzs piruvát-dehidrogenáz komplexét, és az kevésbé érzékenynek bizonyult NADH¹ra, mint a vad törzs piruvát-dehidrogenáz komplexe. A találmány anaerob körülmények mellett mûködõképes piruvát-dehidrogenáz komplexre történõ szelektálást eredményez, amely lehetõvé teszi két NADH elõállítását gliceraldehid-3-foszfátnak acetáttá történõ oxidálása révén, a NADH nem reoxidálódhat másképp, mint dihidroxi-aceton-foszfátnak 1,2-propándiollá történõ redukálása révén. NADH¹ra kevésbé érzékeny enzimkomplexre történõ szelektálás kedvezõ hatással van az 1,2-propándiol elõállításának a sebességére. A találmány elõnyösen a piruvát-dehidrogenáz komplexbe tartozó lipoamid-dehidrogenázt kódoló lpd gén [amelynek a vad típusú szekvenciája ismert (http://genolist.pasteur.fr/colibri)] mutációinak a szelek- 6
tálásához vezet. Közelebbrõl, azonosítottuk egy pontmutáció jelenlétét, amely az. pozícióban levõ alaninnak valinnal történõ helyettesítését tartalmazta. Errõl az enzimrõl ismert, hogy a piruvát-dehidrogenáz NADH általi gátlásáért felelõs. Ez a módosított enzim szintén a találmány tárgyát képezi. A találmány lehetõvé teszi módosított mikroorganizmusok, közelebbrõl az E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb teljesítményének a javítását, kemosztátban, anaerob körülmények mellett végzett tenyésztés során, DHAP-nak 1,2-propándiollá konvertálásának az anyagcsereútjában részt vevõ enzimek evolúciója révén. Az enzimek evolúciójának a következménye a szaporodási ráta fokozódása és 1,2-propándiol végkoncentrációjának az emelkedése. A találmány elõnyös megvalósítási módja szerint, az evolvált törzs nem tartalmazza a glda gén evolúcióját. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint, az evolvált törzs aglda gén delécióját hordozza. Az ábrák ismertetése 1. ábra: A találmány szerinti, 1,2-propándiol és aceton elõállítása céljára módosított E. colitörzs anyagcseréjének a vázlata. Jelmagyarázat: LDH: laktát-dehidrogenáz ADH: aldehid-alkohol-dehidrogenáz PFL: piruvát-formát-liáz PDHc: piruvát-dehidrogenáz komplex 2. ábra: Az E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs evolúciója glükózon, kemosztátban tenyésztve: glükóz (2A. ábra) és más termékek (2B. ábra) koncentrációja. 3. ábra: A vad törzs és a találmány szerinti evolvált törzs piruvát-dehidrogenáz komplexe enzimaktivitásának az összehasonlítása, növekvõ NADH-koncentrációk mellett. A találmány megvalósításának az alábbiakban ismertetett példái a találmányt a korlátozás szándéka nélkül illusztrálják. 1. példa: Glükóz fermentálásával kizárólag 1,2- propándiol és acetát elõállítására képes, módosított E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs elõállítása a) E. coli MG16 tpia :: cm módosított törzs elõállítása A tpia gén inaktiválását úgy végeztük, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén nagyobb részét deletáltuk. Az alkalmazott eljárást Datsenko K. A. és Wanner B. L. ismertették [ One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640 664 (00)]. A tpia gén helyettesítéséhez két oligonukleotidot alkalmaztunk: DtpiAr oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmaz (SEQ ID NO 1.): 2 3 40 4 0 atgcgacatcctttagtgatgggtaactggaaactgaacggcagccgccacatggttcacgagctggtttctaacctgcgt acatatgaatatcctccttag az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a tpia gén (483 49087 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 49007 49087 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko K. A. és Wanner B. L.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640 664 (00)]. DtpiAf oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmaz (SEQ ID NO 2): cttaagcctgtttagccgcttctgcagctttaacgattactgcgaaggcgtcagctttcagagaagcaccaccaaccag ctgtaggctggagctgcttcg az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a tpia gén 483 48400 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és a másik régió (nagybetûvel szedve) a pkd3 plazmid által hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazettát amplifikálja. A DtpiAr és DtpiAf oligonukleotidokat alkalmaztuk a kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására a pkd3 plazmidból. Ezt követõen, a kapott PCR-terméket elektroporálással vittük be az MG16 (pkd46) törzsbe, amelyben az expresszált Red (,, exo) rendszer nagymértékben kedvez a homológ rekombinációnak. Ezt követõen, az antibiotikumrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-eljárással, cdh és YIIQ oligonukleotidok alkalmazásával ellenõriztük. cdh oligonukleotid (SEQ ID NO 3): ggtgatgatagttatcgccg (homológ a 4736 47 szekvenciával), YllQ oligonukleotid (SEQ ID NO 4): cgtgccatcgacagcagtcc (homológ a 4999 4980 szekvenciával). Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pcp-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe [Cheperanov P. P. és Wackernagel W,: Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant, Gene 8, 9 14 (199)]. Sorozatos, 42 C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, ugyanazon oligonukleotidokkal, mint amelyeket elõzõleg alkalmaztunk. b) E. coli MG16 plfab :: cm módosított törzs elõállítása A plfa és plfb gének inaktiválását úgy végeztük, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát 7
inszertáltunk és az érintett gének nagyobb részét deletáltuk. Az alkalmazott eljárást Datsenko K. A. és Wanner B. L. ismertették (00). A plfa és plfb gének helyettesítéséhez két oligonukleotidot alkalmaztunk: DplfB r oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO ): ccggacatcctgcgttgccgtaaatctggtgttctgaccggtctgccagatgcatatggccgtg az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a plfb gén (9049 92777 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 9223 923 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko K. A. és Wanner B. L.: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640 664 (00)]. DplfAf oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 6): gatgcactataagatgtgttaaaaacgctgtagcagaatgaagcgcggaataaaaaagcggcaactcaataaagttgc cgctggagctgcttcg az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a pfla gén (94963 903 szekvencia) fölött elhelyezkedõ (949470 9490 koordinátájú) szekvenciával, és által hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazettát amplifikálja. A pflab1 és pflab2 oligonukleotidokat alkalmaztuk a kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására a pkd3 plazmidból. Ezt követõen, a kapott PCR-terméket elektroporálással vittük be az MG16 (pkd46) törzsbe, amelyben az expresszált Red rekombináz lehetõvé teszi a homológ rekombinációt. Ezt követõen, az antibiotikumrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-eljárással, pflab1 és pflab2 oligonukleotidok alkalmazásával ellenõriztük. pflab1 oligonukleotid (SEQ ID NO 7): agacattaaaaatatacgtgcagctacccg (homológ a 948462 948491 szekvenciával), pflab2 oligonukleotid (SEQ ID NO 8): gtgaaagctgacaacccttttgatctttta (homológ a 936 983689 szekvenciával). c) E. coli MG16 tpia, plfab módosított törzs elõállítása A pfla és pflb gének deletálását és kloramfenikolrezisztencia-kazettával történõ helyettesítését P1 fággal végzett transzdukciós eljárással végeztük. A protokoll két lépésbõl állt, elõször fáglizátumot állítottunk elõ az MG16 plfab:: cm törzsbõl, majd az MG16 tpia törzset transzdukáltuk a fáglizátummal. 2 3 40 4 0 Fáglizátum elõállítása MG16 ( plfab:: cm) törzs éjszakán át tenyésztett kultúrájának 0 l-ének leoltása ml LB¹tápközegbe, amely g/ml kloramfenikolt, 0,2% glükózt és mmol/l CaCl 2 ¹ot tartalmazott. Inkubálás percen át, 37 C¹on, rázatás mellett. Vad MG16 törzsön elõállított P1 lizátum 0 lének a hozzáadása (körülbelül 9 fág/ml). Rázatás 3 órán át, 37 C¹on, a sejtek teljes líziséig. 0 l kloroform hozzáadása és vortexelés. Centrifugálás percen át, 400 g mellett, a sejttörmelék eliminálása céljából. Felülúszó átmérése steril csõbe és 0 l kloroform hozzáadása. A lizátum tárolása 4 c¹on. Transzdukció MG16 ( tpia) törzs LB¹tápközegben, éjszakán át tenyésztett kultúrája ml¹ének centrifugálása percen át, 00 g mellett. A sejtüledék szuszpendálása mmol/l MgSO 4 és mmol/l CaCl 2 oldatának 2, ml¹ében. Kontrollcsövek: 0 l sejt és MG16 ( plfab:: cm) törzsbõl származó P1 fág 0 l¹e. Tesztcsõ: 0 l sejt és MG16 ( plfab:: cm) törzsbõl származó P1 fágból 0 l. Inkubálás percen át, C¹on, rázatás nélkül. 1 mol/l nátrium-citrát 0 l-ének a hozzáadása, majd vortexelés. 1 ml LB hozzáadása. Inkubálás 1 órán át, 37 C¹on, rázatás mellett. 3 percen át, 7000 rpm mellett történõ centrifugálást követõen, szélesztés g kloramfenikolt tartalmazó LB¹lemezekre. Inkubálás 37 C¹on, éjszakán át. A törzs ellenõrzése Ezt követõen, az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a pflab:: cm szekvenciát tartalmazó régió inszertálódását PCR-eljárással erõsítettük meg, egyrészt pflab1 és pflab2 oligonukleotidokat alkalmazva, másrészt cdh és YllQ oligonukleotidokat alkalmazva abból a célból, hogy ellenõrizzük a tpia gén delécióját a plfab:: cm törzsben. Az elõállított törzset MG16 (plfab:: cm, tpia) törzsnek neveztük el. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazettát a fent ismertetettek szerint eltávolítottuk. A kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyeinél ható FLP rekombinázt hordozó pcp-plazmidot ezután elektroporálással bejuttattuk a rekombináns törzsekbe. Ezt követõen, 42 C¹on végzett, sorozatos tenyésztés után, PCR-eljárással ellenõriztük az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését, a fentiek szerinti oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG16 tpia, plfab törzsnek neveztük el. d) E. coli MG16 adhe:: cm módosított törzs elõállítása Az adhe gén inaktiválását ezúttal is úgy végeztük, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát 8
inszertáltunk és az érintett gének nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárással (00). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: DadhE r oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 9): atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaa aaagcccagcgtgaatatgccagtttcactcatatgaatatcct CCTTAG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az adhe gén (1294669 1297344 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 1297263 1297343 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. DadhEf oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO ): caataacgaatgatagcaattttaagtagttaggaggtgaaaaatgctgtc aaaaggcgtattgtcagcgcgtcttttcatgtaggctggagctg CTTCG az egyik régió homológ az adhe gén 1294694 1294774 koordinátájú szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja. A DadhEr és DadhEf oligonukleotidokat alkalmaztuk a kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására a pkd3 plazmidból. Ezt követõen, a kapott PCR-terméket elektroporálással vittük be az MG16- (pkd46) törzsbe, amelyben az expresszált Red rekombináz lehetõvé teszi a homológ rekombinációt. Ezt követõen, az antibiotikumrezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-eljárással, ychgf és adhecr oligonukleotidok alkalmazásával ellenõriztük. ychgf oligonukleotid (SEQ ID NO 11): ggctcattgcaccaccatccag (homológ a 129437 1294378 szekvenciával), adhecr oligonukleotid (SEQ ID NO 121) gaaaagacgcgctgacaatacgcc (homológ a 1297772 1297749 szekvenciával). e) E. coli MG16 tpia, pflab, adhe törzs elõállítása Az MG16 tpia, pflab törzsben az adhe gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fáglizátumot MG16 adhe:: cm törzsön állítottuk elõ, majd az MG16 tpia, pflab törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat ychcf és adhecr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy megerõsítsük az adhe gén mutációját, továbbá egyrészt a pflab1 és pflab2 oligonukleotidokkal, másrészt a cdh és YllQ oligonukleotidokkal abból a célból, hogy megerõsítsük mind a pfla és pflb, mind a tpia gének delécióját a adhe:: cm törzsben. 2 3 40 4 0 A fentebb ismertetettek szerint, ezután eltávolítottuk kloramfenikolrezisztencia-kazettát. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pcp-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCReljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG16 tpia, pflab, adhe törzsnek neveztük el. f) E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana módosított törzs elõállítása Az MG16 tpia, pflab, adhe törzsben az ldha gén (1439878 1440867 koordináták) inaktiválását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumát E. coli K12 NZN11 plf:: cam, ldha:: kana törzsön állítottuk elõ, amelyet Clark D. P. szolgáltatott [Bunch P. K., MatJan F. és Clark D. P.: The ldha gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli Microbiology 143, 187 19 (1997)]. Az MG16 tpia, pflab, adhe törzs transzdukcióját az E. coli K12 NZN11 plf:: cam, ldha:: kana törzs lizátumával végeztük. A transzduktánsokat kanamicinnel szelektáltuk és a kanamicinkazetta inszertálódását az ldha génbe hsljc és ldhac2 oligonukleotidokkal ellenõriztük. hsljc oligonukleotid (SEQ ID NO 13): gccatcagcaggcttagccg (homológ a 143934 1439767 szekvenciával), ldhac2 oligonukleotid (SEQ ID NO 14): gggtattgtggcatgtttaaccg (homológ a 14407 14429 szekvenciával). Az elõállított törzset E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana törzsnek neveztük el. g) E. coli MG16 gloa:: cm módosított törzs elõállítása A gloa gén inaktiválását a fentebb ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárás szerint (00). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. GLOADf oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO ): atgcgtcttcttcataccatgctgcgcgttggcgatttgcaacgctccatcga tttttataccaaagtgctgggcatgaagtgtaggctggagctg CTTCG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a gloa gén (172861 1726268 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 172861 172941 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. 9
GLOADr oligonukleotidot (16. SEQ ID NO) ttagttgcccagaccgcgaccggcgtctttctcttcgattaactcaattttgta accgtccggatcttccacaaacgcgacatatgaatatcctcct TAG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az gloa gén (172861 1726268 koordináták) 1726188 1726268 koordinátájú szekvenciájával és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja. A GLOADr és GLOADf oligonukleotidokat alkalmaztuk a pkd3 plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCRterméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG16 (pkd46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, NemAQd és Rnt Cr oligonukleotidok alkalmazásával. NemAQd oligonukleotid (SEQ ID NO 17): gaagtggtcgatgccgggattgaagaatggg (homológ a 172331 172361 szekvenciával), Rnt Cr oligonukleotid (SEQ ID NO 18): gggttacgtttcagtgaggcgcgttctgcgg (homológ a 172676 172679 szekvenciával). h) E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa módosított törzs elõállítása Az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana törzsben a gloa gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumot MG16 gloa:: cm törzsön állítottuk elõ, majd az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat NemAQd és Rnt Cr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy ellenõrizzük a gloa gén mutációját, továbbá a pflab1 és pflab2, cdh és YllQ, ychcf és adhecr, valamint a hsljc és ldhac2 oligonukleotidokkal, abból a célból, hogy rendre ellenõrizzük a pfla és pflb, tpia, adhe, valamint az ldha gének delécióját a gloa:: cm törzsben. A korábbiak szerint, a kloramfenikolrezisztenciakazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pcp-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa törzsnek neveztük el. i) E. coli MG16 alda:: cm módosított törzs elõállítása Az alda gén inaktiválását a fentebb ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén 2 3 40 4 0 nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárás szerint (00). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. AldA D f oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 19): atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctg gcgtggagacgcatggattgatgtggtagtgtaggctggagct GCTTCG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az alda gén (148626 148769 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 148626 1486336 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. 2. aldad r oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO ): ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatg tttaccatctgcgccgccaataccggatttcatatgaatatcctc CTTAG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az alda gén (148626 148769 koordináták) 14876 148769 koordinátájú szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. AzAldADrésaldAD f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pkd3-plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCR-terméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG16 (pkd46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, Ydc F Cf és gapccr oligonukleotidok alkalmazásával. Ydc F Cf oligonukleotid (SEQ ID NO 21): tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg (homológ a 148722 14872 koordinátájú szekvenciával), gapccr oligonukleotid (SEQ ID NO 22): cacgatgacgaccattcatgcctatactggc (homológ a 148819 148822 koordinátájú szekvenciával). j) E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda módosított törzs elõállítása Az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa törzsben az alda gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumát MG16 alda:: cm törzsön állítottuk elõ, és az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat Ydc F Cf és gapccr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy ellenõrizzük az alda gén mutációját, továbbá a NemAQd és Rnt Cr, pflab1 és pflab2, cdh és YllQ, ychcf és
adhecr, valamint a hsljc és ldhac2 oligonukleotidokkal abból a célból, hogy rendre ellenõrizzük a gloa, pfla és B, tpia és adhe gének delécióját a alda:: cm törzsben. A korábbiak szerint, a kloramfenikolrezisztenciakazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pcp-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda törzsnek neveztük el. k) E. coli MG16 aldb:: cm módosított törzs elõállítása Az alda gén inaktiválását a fentebb ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk és az érintett gén nagyobb részét deletáltuk, Datsenko K. A. és Wanner B. L. által ismertetett eljárás szerint (00). A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. AldB D f oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 23): tcagaacagccccaacggtttatccgagtagctcaccagcaggcacttg gtttgctggtaatgctccagcatcatcttgtgtgtaggctggagct GCTTCG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az aldb gén (3723 374141 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 3723 372683 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. 2. AldBD r oligonukleotidot, amely 0 bázist tartalmazott (SEQ ID NO 24): atgaccaataatcccccttcagcacagattaagcccggcgagtatggtttc cccctcaagttaaaagcccgctatgacaacatatgaatatcctc CTTAG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az aldb gén (3723 374141 koordináták) 374061 374141 koordinátájú szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. Az AldB D r és aldb D f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pkd3-plazmidon hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCRterméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG16 (pkd46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, aldb C f és YiaYCr oligonukleotidok alkalmazásával. 2 3 40 4 0 aldb C f oligonukleotid (SEQ ID NO 2): catatttccctcaaagaatataaaaaagaacaattaacgc (homológ a 377 379 szekvenciával), YiaYCr oligonukleotid (SEQ ID NO 26): tatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcg (homológ a 374644 374674 szekvenciával) 1) E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb módosított törzs elõállítása Az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda törzsben az aldb gén deletálását a fentiek szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumot MG16 aldb:: cm törzsön állítottuk elõ, és az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat aldbcfésyiaycr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy megerõsítsük az aldb gén mutációját, továbbá a NemAQd és Rnt Cr, pflab1 és pflab2, cdh és YllQ, ychcf és adhecr, hsljc és ldhac2, valamint Ydc F Cf és gapccr oligonukleotidokkal abból a célból, hogy rendre ellenõrizzük a gloa, pfla és B, tpia, adhe és alda gének delécióját a aldb:: cm törzsben. A korábbiak szerint, a kloramfenikolrezisztencia-kazettát eltávolítottuk. Ezt követõen, a kloramfenikolrezisztencia-kazetta FRT-helyein ható FLP rekombinázt hordozó pcp-plazmidot vittünk be elektroporálással a rekombináns törzsekbe. Sorozatos, 42 C¹on történõ tenyésztést követõen, az antibiotikumrezisztencia-kazetta elvesztését PCR-eljárással ellenõriztük, a fentebb ismertetett, ugyanazon oligonukleotidok alkalmazásával. Az elõállított törzset MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsnek neveztük el. 2. példa: E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb módosított törzs tenyésztése és evolúciója kemosztátban Abból a célból, hogy optimalizáljuk az E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs glükózból történõ 1,2-propándiol termelését, a törzset kemosztátban, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített minimáltápközegben tenyésztettük több héten át, anaerob körülmények mellett. A tenyésztés elején a glükóz kiindulási koncentrációja a tenyészet táplálótankjában g/l volt, a hígítás mértéke 0,04 óra 1 volt, és nitrogén folyamatos áramoltatásával anaerob körülményeket biztosítottunk. A sejtek száma alacsony, és az 1,2-propándiol és acetát termelõdése gyenge volt. Több hetes tenyésztést követõen, a sejtek szaporodása fokozódott, a termékek koncentrációja emelkedett, folyamatos üzemmódot értünk el, amelyet reziduális glükóz adott koncentrációja és a termékek állandó koncentrációi jellemeztek (2. ábra). 11
3. példa: NADH¹ra kevésbé érzékeny, evolvált piruvát-dehidrogenáz komplex jellemzése Piruvát-dehidrogenáz komplex (PDHc) fejlõdését mutattuk ki NADH¹ra kevésbé érzékeny PDHc irányába, az evolvált enzim aktivitásának in vitro mérésével, valamint az evolvált PDHc lipoamid-dehidrogenázát kódoló egyik gén (lpd) szekvenciájának a natív PDHc génjével történõ összehasonlításával. a) Piruvát-dehidrogenáz enzim aktivitásának mérése: Az E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsben a PDHc enzim aktivitásának in vitro mérését Schwartz és Reed által ismertetett eljárással végeztük [Schwartz E. R. és Reed L. J.: Regulation of the activity of the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli Biochemistry 6, 1434 1439 (1970)]. A kemosztátból 0 ml térfogatnyi sejtkultúrát helyeztünk át anaerob fülkében tartott, elõzõleg gáztalanított csövekbe. A sejteket percen át, 00 rpm mellett centrifugáltuk. A sejtüledéket 0 mmol/l káliumfoszfátot (ph=7,9) és 0, mmol/l tiamin-pirofoszfátot tartalmazó oldat körülbelül 0 ml¹ében szuszpendáltuk, majd ismét centrifugáltuk percen át, 00 rpm mellett. A mosást még egyszer elvégeztük, azonos körülmények mellett. A sejtüledéket 800 l pufferben szuszpendáltuk. A sejtszuszpenziót ultrahang-berendezéssel roncsoltuk, 4 kezelési ciklus alatt ( mp idõtartam és % energia mellett), 2 perces, jeges fürdõben töltött szünetekkel megszakítva. A sejttörmeléket percen át, 13400 rpm mellett végzett centrifugálással távolítottuk el, a felülúszó volt a kiindulási sejtmentes kivonat. A sejtmentes kivonatban jelen levõ sókat, amelyek zavarhatják az enzimaktivitás mérését, úgy távolítottuk el, hogy a kivonatot 0, mmol/l tiamin-pirofoszfátot és kálium-foszfátot tartalmazó pufferrel (ph=7,9) ekvilibrált PD oszlopon engedtük át. A kivonatot ugyanezen puffer 3, ml¹ével eluáltuk. Az összegyûjtött eluátum volt a kiindulási sejtmentes kivonat. Az enzimaktivitást elõször NADH jelenléte nélkül, majd NADH 0,14 2,7 mmol/l emelkedõ koncentrációi jelenlétében mértük. A kapott eredményeket a vad típusú E. colira vonatkozó, szakirodalomban ismertetett értékekhez hasonlítottuk (3. ábra) [Snoep J. L., De Graef M. R., Westphal A. H., De Kok A., Teixeira de Mattos M. J. és Neijssel O. M.: Differences in sensitivity to NADH of purified piruvate dehydrogenase complexes of Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis, Azetobacter vinelandii and Escherichia coli: implications for their activity in vivo FEMS Microbiology Letters 114, 279 284 (1993)]. A kapott eredmények arra utaltak, hogy az evolvált, módosított E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs kevésbé érzékeny NADH¹ra, mint a vad típusú E. coli. [NAD+]/[NADH] 33 arány mellett a vad törzs a PHDc-aktivitás teljes gátlását észleltük, míg az evolvált PDHc aktivitásának a 80%¹át mértük. 2 3 40 4 0 b) Az evolvált MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs piruvátdehidrogenáz komplexének lipoamiddehidrogenázát kódoló lpd gén szekvenciájának a meghatározása: Az E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs kromoszomális DNS¹ét LB¹tápközegben, éjszakán át tenyésztett kultúrájának 1 ml¹ébõl vontuk ki. Centrifugálást követõen, a sejteket steril vízzel mostuk, majd 94 C¹on, percen át alkalmazott hõsokkal roncsoltuk. Centrifugálást követõen a kromoszomális DNS¹t összegyûjtöttük a felülúszóból. A piruvát-dehidrogenáz komplex lipoamid-dehidrogenázát (E3) kódoló lpd gént (127912 129336 szekvencia) PCR-eljárással amplifikáltuk, az alábbi két oligonukleotid alkalmazásával: AceEf oligonukleotid (SEQ ID NO 27) cgcgtgatcgacggtgctgatggtgcccg (homológ a 12704 12732 szekvenciával), YacH r oligonukleotid (SEQ ID NO 28) Aagttcaggagagccgccc (homológ a 12713 12931 szekvenciával). Az lpd génnek megfelelõ, 00 bázispárból álló terméket kaptunk, amelyet szekvenáltunk. A kapott eredmények pontmutáció jelenlétét mutatták ki, ahol az. pozícióban levõ alanint valin helyettesíti. 4. példa: A módosított, evolvált E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs metil-glioxált 1,2-propándiollá konvertáló anyagcsereútjában nem vesz részt glicerol-dehidrogenáz Annak kimutatása céljából, hogy a módosított, evolvált E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb teljesítményének a javulása nem a glda gén által kódolt glicerol-dehidrogenáz fejlõdésének tulajdonítható, olyan evolvált E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzset állítottunk elõ, amelybõl aglda gént deletáltuk. a) MG16 glda:: cm módosított törzs elõállítása A glda gén inaktiválását az 1. példában ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk, és az érintett gén nagyobb részét Datsenko K. A. és Wanner B. L. (00) által ismertetett eljárással deletáltuk. A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: glda D f oligonukleotidot, amely 0 bázisból állt (SEQ ID NO 29) gttattcccactcttgcaggaaacgctgaccgtactggtcggctaccagca gagcggcgtaaacctgatctggcgtcgcggtgtaggctggag CTGCTTCG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a glda gén (41312 41366 koordináták), a http://genolist.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 41312 41392 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és 12
2 3 kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. glda D r oligonukleotidot, amely 0 bázisból állt (. SEQ ID NO): atggaccgcattattcaatcaccgggtaaatacatccagggcgctgatgt gattaatcgtctgggcgaatacctgaagcccatatgaatatcct CCTTAG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ a glda gén (41312 41366 koordináták) 41363 41366 koordinátájú szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. Az glda D r és glda D f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pkd3-plazmidban hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCRterméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG16 (pkd46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, YijF D és TalCr oligonukleotidok alkalmazásával. YijF D oligonukleotid (SEQ ID NO 31): gcctggatttgtaccacggttggtggaacggcggg (homológ a 413140 413174 szekvenciával), TalCr oligonukleotid (SEQ ID NO 32): cacgcatattccccattgccgggg (homológ a 4137216 4137239 szekvenciával). Egy bp méretû terméket kaptunk mind a vad gén esetében, mind a kloramfenikolrezisztencia-génnel deletált és helyettesített gén esetében. Ráadásul, a kapott PCR-termékeket ezt követõen SalI restrikciós enzimmel emésztettük. A vad PCR-termék esetében két, körülbelül 00 bp méretû fragmenst kaptunk, míg a kloramfenikolrezisztencia-gént tartalmazó PCR-termék nem volt hasítható. b) Módosított, evolvált MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, glda:: cm törzs elõállítása Az evolvált MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsben a glda gén deletálását az 1. példa szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fáglizátumot MG16 glda:: cm törzsön állítottuk elõ, majd az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat YijF D és TalCr oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy meggyõzõdjünk a glda gén mutációjáról. c) Módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, glda:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsek tenyésztése A módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, glda:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzseket nem szabályozott ph mellett, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített, minimál tápközegben tenyésztettük, napon át, g/l kiindulási glükózkoncentráció és anaerob körülmények mellett. A kapott fermentációs termékek profilja azt mutatta, hogy a glda gén deletálása nem okozza az 1,2-propándiol termelésének a csökkenését (1. táblázat). 1. táblázat Szubsztrát és fermentációs termékek koncentrációinak az összehasonlítása módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, glda:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsek napon át tartó tenyésztése után Törzs Optikai denzitás Glükózfogyasztás (g/l) Metil-glioxál (g/l) Ecetsav (g/l) 1,2-Propándiol (g/l) E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, glda:: cm E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb 1, 7,3 1,2 2,1 1,7 1,9 9,6 1,4 1,9 1,2. példa: Glükóznak 1,2-propándiollá konvertálódása hatásfokának a javítása a 6¹foszfo-glukonát-dehidratázt kódoló edd gén deletálásával az E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsben a) Módosított MG16 edd:: cm törzs elõállítása Az edd gén inaktiválását az 1. példában ismertetettek szerint végeztük úgy, hogy kloramfenikol antibiotikumrezisztencia-kazettát inszertáltunk, és az érintett 0 gén nagyobb részét Datsenko K. A. és Wanner B. L. (00) által ismertetett eljárással deletáltuk. A deletáláshoz két oligonukleotidot alkalmaztunk: 1. edd D f oligonukleotidot, amely 0 bázisból állt (SEQ ID NO 33) ttaaaaagtgatacaggttgcgccctgttcggcaccggacagtttttcacgc aaggcgctgaataattcacgtcctgttcgtgtaggctggagct GCTTCG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az edd gén (19817 1932628 koordináták), a http://geno- 13
list.pasteur.fr/colibri/ webhely szerinti referenciaszekvencia 19817 19897 koordinátáknak megfelelõ szekvenciájával, és kloramfenikolrezisztencia-kazettáját amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. 2. edd D r oligonukleotidot, amely 0 bázisból állt (SEQ ID NO 34): atgaatccacaattgttacgcgtaacaaatcgaatcattgaacgttcgcgc gagactcgctctgcttatctcgcccggatcatatgaatatcctcc TTAG az egyik régió (kisbetûvel szedve) homológ az edd gén (19817 1932628 koordináták) 193248 1932628 koordinátájú szekvenciájával, és on hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazettát amplifikálja [Datsenko, K. A. és Wanner, B. L. (00)]. Az edd D R és edd D f oligonukleotidokat alkalmaztuk a pkd3-plazmidban hordozott kloramfenikolrezisztencia-kazetta amplifikálására. Az elõállított PCR-terméket ezt követõen elektroporálással bevittük az MG16- (pkd46) törzsbe, amelyben a Red rekombináz enzim lehetõvé tette a homológ rekombinációt. Az antibiotikumra rezisztens transzformánsokat szelektáltuk és a rezisztenciakazetta inszertálódását PCR-vizsgálattal ellenõriztük, eda d és zwf r oligonukleotidok alkalmazásával: eda d oligonukleotid (SEQ ID NO 3): CCCCGGMTCAGAGGMTAGTCCC (homológ a 19439 19462 szekvenciával), zwf r oligonukleotid (SEQ ID NO 36): GGGTAGACTCCATTACTGAGGCGTGGGCG (homológ a 1932968 1932996 szekvenciával). 2 b) Módosított, evolvált E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd elõállítása Az evolvált E. coli MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsben az edd gén inaktiválását az 1. példa szerinti P1 fág transzdukciós eljárással végeztük [lásd a protokoll c) pontját]. A P1 fág lizátumát MG16 glda:: cm törzsön állítottuk elõ, és az MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzs transzdukcióját ezzel a lizátummal végeztük. A kloramfenikolra rezisztens transzduktánsokat eda d és zwf r oligonukleotidokkal ellenõriztük abból a célból, hogy meggyõzõdjünk az edd gén mutációjáról. c) A módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm és az evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsek tenyésztése A módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzseket nem szabályozott ph mellett, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített, minimál tápközegben tenyésztettük, napon át, g/l kiindulási glükózkoncentráció és anaerob körülmények mellett. A kapott fermentációs termékek profilja azt mutatta, hogy a edd gén deletálása 0,13 g/g¹ról 0,3 g/g¹ra emelte glükóznak 1,2-propándiollá konvertálódásának a hatásfokát (2. táblázat). Az edd gén deletálása az evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsben tehát lehetõvé teszi a törzs teljesítményének a javítását. 2. táblázat Szubsztrát és fermentációs termékek koncentrációinak az összehasonlítása módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb törzsek napon át tartó tenyésztését követõen Törzs Optikai denzitás Glükózfogyasztás (g/l) Metil-glioxál (g/l) Ecetsav (g/l) 1,2-Propándiol (g/l) Y 1,2 Pdiol/ glükóz (g/g) E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb 1,2 0,2 1, 1,8 0,3 1,9 9,6 1,4 1,9 1,2 0,13 6. példa: 1,2-Propándiol és aceton elõállítására képes, módosított E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm (psos9t) törzs elõállítása A psos9t plazmid ingázó expressziós vektor az Escherichia coli/clostridium acetobutylicum organizmusokban, amely a Clostridium acetobutylicum aceton operonját alkotó négy gént hordozza, az adc, ctfab és thl géneket, amelyek rendre az acetoacetát-karboxiláz, koenzim-a-transzferáz és tioláz enzimeket kódolják, a tioláz promoter szabályozása alatt. Ez a három enzim katalizálja az acetil-coa és acetát átalakulását acetonná és szén-dioxiddá. A psos9t plazmidot úgy állítottuk elõ, hogy a psos9 plazmidba (Gene bank nyilvántartási száma AY187686) a C. acetobutilicum tiolázt kódoló thl génjét inszertáltuk, a tioláz promoter és a ctfa gén között elhelyezkedõ BamHI hasítási helynél. A psos9t plazmidot elektroporálással bevittük az evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm törzsbe. 14
E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm törzs éjszakán át, LB¹tápközegben tenyésztett kultúrájából elektrokompetens sejteket állítottunk elõ. Az éjszakán át tenyésztett kultúrából Erlenmeyer-lombikban 1:0 hígítású, ml¹es kultúrát oltottunk le LB¹tápközegbe, amelyet 37 C¹on inkubáltunk. Amint az 0 nm hullámhosszon mért optikai denzitás elérte a 0,4 0,6 értéket, a tenyészet 1 ml¹ét lecentrifugáltuk. A sejteket vízzel, majd %¹os glicerinoldattal mostuk, majd 0,0 ml %¹os glicerinoldatban szuszpendáltuk. A sejteket azonnal elektroporáltuk l (2 F, 0, 2, kv; Gene pulser, Biorad) psos9t (Qiagen, Hilden, Németország) plazmidkészítménnyel. SOC tápközegben, 1 órán át tartó, 37 C¹on lezajló fenotípusos expresszálódást követõen [Sambrook J., Fristch E. F. és maniatis T.: Molecular cloning: a laboratory manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.], a transzformánsokat gél (agar) tápközegen szelektáltuk, 37 C¹on, 0 g/ml karbenicillin alkalmazásával. A transzformánsokat egy éjszakára folyadék tápközegbe helyeztük karbenicillin jelenlétében abból a célból, hogy plazmid-dns¹t vonjunk ki (Qiagen, Hilden, Németország) és ellenõrizzük a psos9t plazmid jelenlétét és enzimatikus hasítással meggyõzõdjünk helyességérõl. 7. példa: A módosított, evolvált, 1,2-propándiol és aceton elõállítására képes E. coli * MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm (psos9t) törzs tenyésztése A módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb edd:: cm (psos9t) törzset nem szabályozott ph mellett, nátrium-nitráttal és élesztõkivonattal kiegészített, minimál tápközegben tenyésztettük napon át, g/l kiindulási glükózkoncentráció és anaerob körülmények mellett (3. táblázat) A fermentációs termékek mérése azt mutatta, hogy az evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb edd:: cm (psos9t) törzs 1,2-propándiol, acetát és aceton elegyét állítja elõ. 3. táblázat Szubsztrát és fermentációs termékek koncentrációinak az összehasonlítása módosított, evolvált E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm (psos9t) és E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm törzsek napon át tartó tenyésztését követõen Törzs Optikai denzitás Glükózfogyasztás (g/l) Metil-glioxál (g/l) Ecetsav (g/l) 1,2-Propándiol (g/l) Aceton (g/l) E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm (psos9t) E. coli *MG16 tpia, pflab, adhe, ldha:: kana, gloa, alda, aldb, edd:: cm 1,4 4,8 0,3 1,3 1,6 0,1 1,2 0,2 1, 1,8 Szekvencialista <1> Metabolic Explorer <1> Evolved micro-organism for the Production of 1,2-propanediol <1> 347276 <0> FR 0400214 <1> 04 01 12 <1> 36 <170> PatentIn version 3.1 <2> 1 <211> 2
HU 006 471 T2 <400> 1 atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggttcac gagctggttt ctaacctgcg tacatatgaa tatcctcctt ag 2 <2> 2 <211> 0 <400> 2 cttaagcctg tttagccgct tctgcagctt taacgattac tgcgaaggcg tcagctttca gagaagcacc accaaccagc tgtaggctgg agctgcttcg 0 <2> 3 <211> <400> 3 ggtgatgata gttatcgccg <2> 4 <211> <400> 4 cgtgccatcg acagcagtcc <2> <211> 0 <400> ccggacatcc tgcgttgccg taaatctggt gttctgaccg gtctgccaga tgcatatggc cgtggccgta tcatcggtga catatgaata tcctccttag 0 <2> 6 <211> 94 16
HU 006 471 T2 <400> 6 gatgcactat aagatgtgtt aaaaacgctg tagcagaatg aagcgcggaa taaaaaagcg gcaactcaat aaagttgccg ctggagctgc ttcg 94 <2> 7 <211> <400> 7 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg <2> 8 <211> <400> 8 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta <2> 9 <211> 1 <400> 9 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag cgtgaatatg ccagtttcac tcatatgaat atcctcctta g 1 <2> <211> 0 <400> caataacgaa tgatagcaat tttaagtagt taggaggtga aaaatgctgt caaaaggcgt attgtcagcg cgtcttttca tgtaggctgg agctgcttcg 0 17
HU 006 471 T2 <2> 11 <211> 22 <400> 11 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <2> 12 <211> 24 <400> 12 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <2> 13 <211> <400> 13 gccatcagca ggcttagccg <2> 14 <211> 23 <400> 14 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <2> <211> 1 <400> atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 1 18
HU 006 471 T2 <2> 16 <211> 0 <400> 16 ttagttgccc agaccgcgac cggcgtcttt ctcttcgatt aactcaattt tgtaaccgtc cggatcttcc acaaacgcga catatgaata tcctccttag 0 <2> 17 <211> 31 <400> 17 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31 <2> 18 <211> 31 <400> 18 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g 31 <2> 19 <211> 2 <400> 19 atgtcagtac ccgttcaaca tcctatgtat atcgatggac agtttgttac ctggcgtgga gacgcatgga ttgatgtggt agtgtaggct ggagctgctt cg 2 <2> <211> 1 19
HU 006 471 T2 <400> ttaagactgt aaataaacca cctgggtctg cagatattca tgcaagccat gtttaccatc tgcgccgcca ataccggatt tcatatgaat atcctcctta g 1 <2> 21 <211> 31 <400> 21 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31 <2> 22 <211> 31 <400> 22 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31 <2> 23 <211> 1 <400> 23 tcagaacagc cccaacggtt tatccgagta gctcaccagc aggcacttgg tttgctggta atgctccagc atcatcttgt gtgtaggctg gagctgcttc g 1 <2> 24 <211> 0 <400> 24 atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag ttaaaagccc gctatgacaa catatgaata tcctccttag 0 <2> 2 <211> 40