Genetikai panel kialakítása a hazai tejhasznú szarvasmarha állományok hasznos élettartamának növelésére Dr. Czeglédi Levente Dr. Béri Béla Kutatás-fejlesztés támogatása a megújuló energiaforrások és agrár innováció területén 211. Március 25.
A téma jelentősége, aktualitása a hazai szarvasmarha állomány 72%-a tejhasznosítású ezen belül a holstein-fríz fajta aránya 98% hazai éves tejtermelés 1,5-1,6 milliárd liter a magyar holstein-fríz életteljesítménye <2,3 laktáció ok: szaporodásbiológia, tejtermelés, lábhiba, tőgyhiba, anyagcserezavar.. Következmény: a két évig tartó felnevelési költségnek igen rövid idő alatt kell megtérülnie
Célkitűzés Vizsgálati panel kialakítása olyan génekre, melyek befolyásolják a holstein-fríz szarvasmarha hosszú hasznos élettartamát
Módszer biológiai markerek azonosítása molekuláris biológiai módszerekkel: GENETIKA - PROTEOMIKA
Vizsgálati állomány Projekt 1.: Hosszú hasznos élettartamú tehenek (termelés > 8. l tej) Kontroll (első/második laktációs selejtezett tehenek) Projekt 2.: Hosszú hasznos élettartamú tehenek (termelés > 8. l tej) Kontroll 1. csoport (kis tejtermelésű tehenek) Kontroll 2. csoport (nehezen vemhesülő tehenek) Egyedszám: 45 tehén
A három csoport átlagos termelési paraméterei Laktációs tejtermelés (kg, 35 nap) Zsír (kg) Fehérje (kg) 1. laktációs szap.biol. selejt 111 347 321 1. laktációs termelési selejt 678 25 228 hosszú hasznos élettartamú 895 312 28
Vizsgált gének: - calpastatin gén (CAST) - proteáz inhibítor gén (PI) - lactoferrin gén - leptin gén - méh tej protein gén (UTMP) - fibroblast növekedési faktor 2 gén (FGF2) - agyalapi mirigy specifikus pozitív transzkripciós faktor 1 gén (POU1F1) Vizsgálat proteinek: a biológiai mintában expresszálódó összes fehérje
Metodika: genetikai vizsgálatok Genomi DNS: szőrhagymából, vérből (lízis puffer + proteináz) Genotipizálás: oligo explorer grádiens PCR, touchdown PCR restrikciós emésztés, SSCP agaróz gélelektroforézis, gelred festés detektálás: UV, uvipro platinum TaqMan próba Értékelés: SAS PROC GLM, ANOVA PSMC1 grádiens PCR 56-66 C
A specifikusan amplifikált DNS fragmentek
Metodika: proteomikai vizsgálatok Minta: vérplazma, tej Gél alapú technika: fehérjék izolálása nagy gyakoriságú fehérjék koncentrációjának csökkentése prefrakcionálás: pi, méret egy dimenziós poliakrilamid gélelektroforézis két dimenziós poliakrilamid gélelektroforézis
Metodika: proteomikai vizsgálatok Festés: coomassie, ezüst-nitrát, fluoreszcens Értékelés: PDQuest software Nem gél alapú technika: MALDI - TOF/TOF nanolc-iontrap MS Mascot adatbázis-kereső
tejzsírcsepp proteinek = tőgyepithel sejt membrán+citoplazma proteinek
Eredmények
A csoportok közötti különbség statisztikailag nem szignifikáns
A csoportok közötti különbség statisztikailag nem szignifikáns
A csoportok közötti különbség statisztikailag nem szignifikáns
A csoportok közötti különbség statisztikailag szignifikáns
Vérplazma és MFGM proteomjának elemzése Vérplazma Tőgyepithel sejt membrán Termelt tej>1. liter Kontroll marker fehérje
MALDI TOF/TOF és nanolc-iontrap tömegspektrometria hosszú hasznos élettartam kis tejtermelés Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] 2 1 1 5 2 1 1 5 8641.911 8757.175 9182.31 8753.115 8712.313 9177.18 945.4 H8165kek\_P22\1\1SLin 9453.719 9449.455 9456.78 9441.422 C89piros\_P1\1\1SLin A614\_P7\1\1SLin A144piros\_P14\1\1SLin A3321\_P17\1\1SLin 86 88 9 92 94 96 98 m/z Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] 4 2 4 2 2 1 1 1 2 1 1 5 9178.46 G79\_P16\1\1SLin 8752.446 G162\_P1\1\1SLin 8755.867 G314fekete\_P6\1\1SLin 8753.893 G314piros\_P15\1\1SLin 8755.236 G53\_P5\1\1SLin 8755.323 H156\_P9\1\1SLin 8756.11 H547\_P2\1\1SLin 86 88 9 92 94 96 98 nehezen vemhesülő m/z Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] 5 4 3 2 1 5 4 3 2 1 3351.593 3351.593 4236.21 3718.85 4643.426 4236.21 3718.85 4643.426 H8165kekF\_O4\1\1SRef 522.434 H8165kekF\_O4\1\1SRef 522.434 325 35 375 4 425 45 475 5 525 m/z Intens. Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] [a.u.] x1 4 4 2 4 2 2 2 x1 4 4 2 4 2 4 2 8713.828 1123kek\_P3\1\1SLin 9142.435 9142.81 8712.91 9134.274 G167\_P13\1\1SLin G179\_P12\1\1SLin 9178.766 G179\_P19\1\1SLin 9181.798 H771\_P18\1\1SLin 9141.929 G613\_P8\1\1SLin G958\_P11\1\1SLin 9141.165 G958\_P2\1\1SLin 9181.34 G1428\_P21\1\1SLin 86 87 88 89 9 91 92 93 94 95 m/z
KÖSZÖNÖM A MEGTISZTELŐ FIGYELMET!
Protein name NCBI Accession number Match ed peptid es Theoretic al MW (kda) Masc ot score Sequence coverage (%) Lamin A/C gi:774418 2 1 65.1 62 22.2 Tuftelin interacting protein gi:889541 3 11 96.1 55 17.6 Zeta-chain (TCR) associated protein kinase isoform 2 gi:7662866 9 8 69.8 5 17.5 Fibronectin type III domain containing 3A isoform 1 gi:1946719 78 9 125.2 49 7.9 Similar to stomatin gi:1946692 13 4 41.1 44 9.1 Zinc finger protein 52 gi:1567181 32 11 62.6 75 28.8 2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial precursor gi:1154967 42 14 115.7 89 15.4 SLC25A3 protein gi:151556 64 7 4. 54 17.7 Phosphate carrier protein, mitochondrial precursor gi:278718 5 7 4.1 54 17.7 Similar to serine/threonine-protein kinase Nek5 gi:1946718 56 5 79.3 44 1.9 Bovine F1-Atpase gi:366252 17 51.4 177 56.3 Bovine F1-Atpase gi:1584289 82 14 55.2 124 36.3 Mitochrondrial ATP synthase beta subunit precursor gi:2846122 1 17 56.2 171 51.1 NADH:ubiquinone oxidoreductase gi:833783 13 48.9 15 49.3 NADH dehydrogenase Fe-S protein 2 precursor gi:1154957 21 13 52.5 11 45.8 Cytochrome b-c1 complex subunit 2 gi:278714 3 1 48.1 71 3.2 Canopy 2 homolog gi:1154972 94 6 2.7 55 44.5 Zinc finger protein 184 gi:1541521 19 11 86. 54 2.6