Mutáció detektáló módszerek

Mutáció detektáló módszerek Molekuláris genetikai vizsgáló módszerek 2014.03.19. Bármilyen eltérés a referencia szekvenciától Lehet Egy bázispárnyi szubsztitúció, deléció, inzerció Kromoszóma deléció, inzerció vagy átrendeződés Szomatikus mutációk: a testi sejtekben jönnek létre és azt a sejtvonalat/ szervezetet érintik(hetik) amelyikben jelen vannak (létrejöttek) Germ-line mutációk: ivarsejtekben lévő mutációk, átörökíthetőek Mutáció gyakoriság = egy populációban az adott mutációnak a gyakorisága Polimorfizmus = egy adott populációban az 1%-nál gyakoribb mutáció Pathogén mutáció = káros fenotípusos változást okozó mutáció A különböző DNS polimorfizmusok a legnagyobb mértékben öröklődő genetikai markerek közé tartoznak polimorfizmus (polymorphism) 1.környezeti polimorfizmus Két vagy több határozottan eltérő alak (morf (változat)) megléte egy növény- vagy állatfajon belül. Ennek egyik jó példája a szociális rovarok kasztrendszere, mely munkásokra, herékre, és a királynőre különül el. Ezt nevezzük környezeti polimorfizmusnak (polifénizmus, azaz a különbségeket inkább környezeti és nem genetikai tényezők okozzák, ebben az esetben a lárvák eltérő tápanyagot kaptak.) A genom bármelyik egyedüli poziciójában létrejövő variáció (például A helyett C) a bázisszekvenciában, ami a populáció több mint 1 %-ában megjelenik. A pontmutációtól csak a nagyobb gyakorisága miatt különbözik. Az SNP-ket a genom minden részén megtalálhatjuk, többek között a strukturális génekben, a szabályozó régiókban, és a nem kódoló szemét DNS szakaszokban. A kutatók szerint az emberi genom teljes hosszában SNP-k milliói fordulnak elő, és így kivételesen jó molekuláris markerekké válnak. Néhányról tudjuk, hogy a betegségeket létrehozó allélekkel kapcsolatosak. Restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) Allélspecifikus PCR Allél-specifikus oligonukleotid hibridizáció (ASO) Oligonukleotid ligációs assay (OLA) Fluoreszcens mutáció detektáló metodikák Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) DNS szekvenálás 1

Olyan módszer, amellyel meghatározzák azt a helyet, ahol a restrikciós Az enzimeknek az a típusa, amely idegen DNS molekulákat tud elhasítani meghatározott szekvenciák foszfodiészter kötéseinél (működésük tehát korlátozott (restricted)) A restrikciós enzimeket sok baktérium termeli, és védelmezi a sejtjüket a behatoló vírusok (bakteriofág) DNS-ével szemben elhasítva és ezzel tönkretéve azt. A saját restrikciós enzimeinek támadásától a baktériumsejt saját DNS-ét az védi, hogy a replikáció során a saját DNS bázisait metilációval módosítja. Ma már a restrikciós endonukleázokat széles körben használják a genetikai vizsgálatok eljárásaiban és technikáiban (DNS-ujjlenyomat, DNS-könyvtár, DNS-szekvenálás, restrikciós térképezés) Az Sma1 restrikciós enzim tompa végeket hoz létre Az EcoR1 restrikciós enzim ragadós végeket hoz létre enzimek hasítják a DNS szakaszokat (pl. egy kromoszómából származót). Az ismeretlen szekvenciájú DNS-t különféle enzimmel hasítják, akár egyedileg, akár kombinációban, és ezután elektroforézissel elemzik a fragmensek számát és méreteit, ennek alapján az eredeti DNS-ben előforduló restrikciós hasítási helyek sorrendjét mutató restrikciós térképre következtethetnek. Ezt ezután kiegészíthetik a hagyományos kapcsoltsági térképpel. A restrikciós hasítási helyek megváltozását előidéző génkieséseket vagy átrendeződéseket a nyert fragmensek mintázatában bekövetkezett változásként észlelik. Alkalmazható például a magzat bizonyos genetikai elváltozásainak diagnosztizálására. A fragmenseket elektroforézissel választják szét, és specifikus génpróbákkal azonosítják, például a Southern blotting módszer során. Az emésztés alá vetett magzati DNS-ben bizonyos fragmensek hiánya jelezheti az ennek megfelelő restrikciós hasítási helyet tartalmazó magzati génben létrejött kóros elváltozást. A restrikciós enzimek hasítási helyei a DNS-ben eltérő helyen jelennek meg egyazon faj különböző egyedeiben. A különböző egyedekből származó DNS-t restrikciós enzimekkel hasítják, és ily módon eltérő restrikciós fragmens készletet kapnak. A már létező restrikciós hasítóhelyek deléciója vagy újak keletkezése, a gének közötti nem kódoló DNS szakaszokban (intronok) létrejövő véletlenszerű bázis változások eredményeként jönnek létre. Az RFLP-k a genetikusok számára egy sor hatékony genetikai markert jelentenek a genom térképezésében (lásd restrikciós térképezés) és adott gének azonosításában (lásd gén követés). 2

Lépései: 1. DNS izolálás 2. PCR reakció összeállítása 3. Agaróz gélelektroforézis (PCR termék ellenőrzése) 4. Emésztés BSi II endonukleázzal 5. Agaróz gélelektroforézis (fragmentumok ellenőrzése) 1 gatttaatcc tatgacaaac taagttggtt ctgcttcac ctgttttggt gaggttgtgt MW VAD HOMO HETERO 61 aagagttggt gtttgctcag gaagagattt aagcatgctt gcttacccag actcagagaa 121 gtctccctgt tctgtcctag ctatgttcct gtgttgtgtg cattcgtctt ttccagagca 181 aaccgcccag agtagaagat ggattggggc acgctgcaga cgatcctggg gggtgaac 241 aaacactcca ccag 207 bp 181 bp BSi II hasítóhely: 5 - CCNN NNNNGG-3 3 - GGNN NNNNCC-5 Családszűrés esetén alkalmazott technika A módszer alapelve a tökéletes, illetve nem tökéletes nukleinsav hibridizáció közti olvadáspont különbség. PCR termékhez allél-specifikus oligonukleotidokat hibridizálunk dot blot ( a PCR terméket blottoljuk a membránon) vagy reverz dot blot (számos különböző oligonukleotid-blot a membránon) módszerrel Alkalmazás: Nylon vagy nitrocellulóz membrán A membránra különböző szekvenciájú oligonukleotid próbák, 15-20 nukleotid hosszúságú, egyszálú DNS láncok vannak felcseppentve és immobilizálva. Egy mutációs helyet két, az adott lehetséges allélre specifikus próba definiál. A PCR reakciót egy, az 5 végén módosított (biotinált) primerrel és egy módosítatlan primerrel végezzük. Minden PCR termék egy szála az 5 végén egy biotin molekulát fog hordozni. A PCR végén denaturálás, és a denaturált PCR terméket a membrán csíkra hibridizáltatjuk. Mivel az adott mutációs helyet 2 próba definiálja, így mindhárom genotípus elkülönítése lehetséges. A hibridizáció és a nem kötődött PCR termékeket eltávolító mosási lépések után a rendszerhez streptavidin-enzim konjugátot adunk (az enzim leggyakrabban alkalikus foszfatáz (AP) vagy torma peroxidáz (HRP)). A megfelelő szubsztrát hozzáadásával kizárólag ott tapasztalunk szín reakciót, ahol történt hibridizáció. Gyors, érzékeny és specifikus módszer az SNP k detektálására. Egy DNS ligáz enzim segítségével két szomszédos oligonukleotid (Capture és Reporter) próbát kötünk össze, miközben ezek a target DNS-hez kapcsolódnak. A Capture próba fluoreszcensen jelölt és specifikus a genotípusra. Általában 2 Capture próbát használnak egy reakcióban, amik az utolsó 3 nukleotidban különböznek egymástól a 3 végen. A Reporter próba komplementer a target DNS azon részével, mely az SNP-t tartalmazza, az 5 végén foszfát módosítást tartalmaz. Az allélek az alapján különböztethetők meg, hogy a DNS ligáznak sikerül-e tökéletesen összekapcsolni a párosított próbákat. A 3 végen lévő mismatch megakadályozza a ligációt. A rendszer nagymértékben multiplexálható, egyidejűleg akár tucatnyi pontmutáció, vagy kis deléció, inzerció vizsgálható. http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop425/0011_1a_molelkularis_diagnoszitka_hu_book/ch14.html Fluoreszcens mutáció detektáló metodikák Szekvencia specifikus módszerek: Hidrolízis (TaqMan) próbák Molecular Beacon Skorpió próbák SimpleProbe Hibridizációs próbák Nem szekvencia specifikus módszer: High Resolution Melting 3

A reakcióhoz 2 hagyományos primer és a kettő között lévő TaqMan próba szükséges. A hidrolízis próba egy fluorokrómot (FAM, VIC, NED, CY5, stb) és egy quenchert (TAMRA, stb) tartalmaz, a PCR reakcióban hozzátapad az egyszálúsított DNS-hez. A Taq polimeráz 5-3 exonukleáz aktivitásával a próbát hidrolizálja. Az oldatba kerülő szabad fluorofór emissziója arányos a képződött PCR termék mennyiségével. Általában a Q-PCR vizsgálatokhoz használják, de genotipizálásra is alkalmas. TaqMan próbák 20-30 bp hosszú 8-10 C-kal magasabb Tm, mint a primereké Ideális esetben nem fluoreszkál a riporter festék Minél rövidebb, annál jobb a kioltás, DE annál alacsonyabb az olvadáspont MGB (minor grove binder) próbák 12-18 bp hosszú 3 végi módosítás, kisárokhoz (is) kötődik, megemeli a Tm-et kb. 8-10 C-kal http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dna-probes/product-lines/dual-labeled-probes.html LightCycler reakció lépései 1. Denaturáció A kettősszálú DNS denaturációja és a Taq enzim aktiválása Zöld - vad genotípus Kék heterozigóta Piros homozigóta mutáns 2. PCR 25-40 ciklus, a vizsgált szakasz amplifikálása. 3. Végpont analízis 4. Eredmény Az adatok kiértékelése. A Q-PCR reakció kezdetén a DNS polimeráz a PCR primerek segítségével megszintetizálja a komplementer szálat. A következő ciklusban a hajtű-hurok szétbomlik és a próba hurok régiója hozzákötődik az újonnan szintetizált target szekvenciához. Így a Riporter és a Quencher eltávolodik egymástól, fluoreszcencia emisszióra kerülhet sor. A Q-PCR készülék érzékeli a fluoreszcens jelet, ami egyenes arányban áll a target-szekvencia mennyiségével. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dna-probes/product-lines/fluorescent-probes/scorpions-probes.html 4

SimpleProbe próbák: SNP-k és mutációk detektálására alkalmas Egy fluorofórral (fluoreszcein) jelzett hibridizációs próba szükséges hozzá, ami szekvencia specifikus és a vizsgálandó eltérésre tervezzük. A próba a target szekvenciához való hibridizációt követően magasabb fluoreszcencia jelet emittál, mint szabad formában. Minél magasabb a hibridizáció, annál magasabb az olvadási hőmérséklet. Az SNP-k/mutációk gyengítik SimpleProbe kötődés stabilitását. http://www.roche-applied-science.com http://www.roche-applied-science.com A jelzett oligonukleotid komplementer a vad típusú egyének DNS szekvenciájával. Ha mutáció van jelen, akkor a próba kötődése gyengébb ehhez a szakaszhoz, mint a vad típus esetén. A jelzett oligonukleotid Tm-je a mutációt hordozók minták esetén alacsonyabb, mint a vad típusú egyének mintái esetén. Olvadáspont analízis. A DNS olvadáspontja az a specifikus hőmérséklet, amelyen a DNS 50%-a egyszálú, 50 %-a kétszálú állapotban van. Amint eléri az olvadáspontot -> nagyfokú csökkenés következik be a fluoreszcencia intenzitásban. Zöld színnel a donor fluorofor, pirossal az akceptor van jelölve. A FRET (Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer) során az oligonukleotidhoz kapcsolt fluorofor (pl.fam) a megfelelő közelségben lévő (hibridizált) másik fluoreszcens molekulát gerjeszti, aminek következtében (a gerjesztőre jellemző emisszió mellett) megjelenik a második molekulára jellemző emisszió is. A módszer alkalmas a PCR reakció valós idejű követésére. Amennyiben az egyik próba a mutációs hely fölé van tervezve, akkor a rendszerrel pontmutációkat tudunk kimutatni. Ekkor a PCR reakció kivitelezése után lassú hevítéssel és a fluoreszcens jel folyamatos követésével a tökéletes komplementaritást mutató próba vad típusú templát hibrid, illetve a nem tökéletes komplementaritást mutató próba mutáns templát hibrid közti olvadáspont különbséget a fluoreszcencia jel különböző hőmérsékleteken bekövetkező csökkenése mutatja meg. 5

LightCycler reakció lépései Az energiatranszfer hatékonysága távolságfüggő, így csak a donor és az akceptor között lévő kis távolság esetén eredményezi az akceptor emisszióját. 1. Denaturáció A kettősszálú DNS denaturációja és a Taq enzim aktiválása. 2. PCR 25-40 ciklus, a vizsgált szakasz amplifikálása. 3. Olvadáspont analízis A hőmérséklet emelésével csökken az emisszió. 4. Eredmény Az adatok kiértékelése. Az Antitrombin III Budapest 3 mutáció detektálása LightCycler 480 készüléken A Real-time PCR technika alapja, hogy a PCR termék képződésével arányos intenzitású fluoreszcens jel keletkezik, amit a készülék folyamatosan, valós időben detektál. A jel intenzitása az exponenciális fázisban arányos a kiindulási DNS mennyiségével, így a megfelelő kontrollokkal összehasonlításban a genomban többször előforduló gének megszámolhatóak. A technológia sikeresen alkalmazható a génexpresszió vizsgálatában, SNP-k kimutatásában, valamint új polimorfizmusok kimutatásában. Telítő fluoreszcens festék Specifikus olvadáspont kalibrálók Rövid amplikonok Módosított, farkas primerek Előnyök: Multiplexálhatóság Specifikus próbák nem szükségesek Érdekes Hátrányok: Szerencsefüggő az alkalmazhatósága Az egyes amplikonok olvadáspontja gyengén jósolható Drága készülék Nincs szükség jelzett oligókra. A fluoreszcens festék a kettősszálú DNS-hez kötődik. Az emisszió mértéke egyenesen arányos a dsdns mennyiségével. Nem specifikus a vizsgált szakaszon bárhol lehet eltérés. https://www.roche-applied-science.com 6

A fluoreszcens festék a kettősszálú DNS-hez kötődik. Denaturáció esetén megszűnik a kettős kötés -> a festék disszociál -> a fluoreszcencia csökken. Egy nukleotidnyi eltérés már megváltoztatja a termék T m -ét. Nagyon érzékeny. LightCycler reakció lépései 1. Denaturáció A kettősszálú DNS denaturációja és a Taq enzim aktiválása. 2. PCR 25-40 ciklus, a vizsgált szakasz amplifikálása. 3. Olvadáspont analízis A hőmérséklet emelésével csökken az emisszió. 4. Eredmény Az adatok kiértékelése. https://www.roche-applied-science.com Aberráns kópiaszámmal járó genomi elváltozások kimutatása (aneuploidiák, deléciók, duplikációk) Genotipizálásra alkalmas, metiláció specifikus vizsgálat Olyan oligonukleotidokat amplifikálunk, melyek a genomiális DNS templátra hibridizálva előzőleg összeligálódtak. 1 vizsgálat: 20-500 ng DNS, 20-50 termék Rövid amplikonok -> részlegesen degradált minták vizsgálata lehetséges: paraffinba ágyazott, formalin fixált, régi DNS Fragment analízis (gél, kapilláris alapú) https://www.roche-applied-science.com 1. Denaturáció 2. Hibridizáció 3. Ligáció 4. Amplifikáció 7

Mennyiségi és minőségi analízis kapilláris elektroforézis segítségével Minden csúcs egy specifikus lokusz amplifikációjából származik Kontroll mintához hasonlítjuk a hosszat, csúcsmagasságot A különbségek a kópiaszámbeli eltéréseket jelölik A DNS nukleotid sorrendjének megállapítása A módszer kifejlesztése Frederick Sanger nevéhez fűződik (1958-Nobel-díj) Módszerek: Fluoreszcens láncterminálás (Sanger-féle) Pyroszekvenálás Újgenerációs szekvenálás MPSS Anód Katód Jelenlegi legnagyobb teljesítőképesség Könnyű automatizálhatóság Minimális mintamennyiség (1-10 µl) Rövid analízisidő Jól tervezhető körülmények az optimális elválasztáshoz 8