II. GYAKORLAT Speciális fénymikroszkópos vizsgálati módszerek I. A fáziskontraszt mikroszkóp A fáziskontraszt mikroszkópia a fénysugarak interferenciáján alapuló eljárás, amely lehetõvé teszi az élõ sejtek egyszerû vizsgálatát. Az elõzõ gyakorlaton bemutatott fénymikroszkópban csak akkor kapunk éles képet a vizsgált objektumról, ha annak részei jól elkülönülnek egymástól. A kép részei akkor tûnnek elõ, ha különbözõ színûek, és/vagy fényelnyelõ képességük különbözik. Gyakran elõfordul, hogy a tárgyak optikailag homogénnek mutatkoznak, egyes részei nem mutatnak különbséget. A csekély fénytörésû és fényelnyelõ tulajdonságú preparátumok közönséges fénymikroszkóppal csak festés után vizsgálhatók. A fáziskontraszt mikroszkóp festés nélkül is lehetõvé teszi az olyan minták vizsgálatát, amelyek a fénymikroszkópban homogénnek tûnnek. A fáziskontraszt mikroszkópban a festetlen, sõt sok élõ minta egyes részletei kontrasztosan tûnnek elõ, vizsgálhatók. A fáziskontraszt mikroszkópot elsõsorban élõ sejtek, szövetek vizsgálatára alkalmazzák. Ahhoz azonban, hogy a mikroszkópban jól látható képet kapjunk, segéd-berendezésre van szükség, amely a csekély fázis-különbségeket (a tárgy egyes részeinek törésmutatóbeli különbségeit) láthatóvá teszi. A fáziskontraszt mikroszkópia elvi alapjait Zernike holland fizikus dolgozta ki 1934-ben. Ritkább közeg szemmel nem érzékelhetõ erõsítés késlekedés nélküli hullám késlekedõ hullám (< /4) Sûrûbb közeg 1. ábra. Az /4-nyi fáziskésés szemmel nem érzékelhetõ amplitúdójú változást eredményez. I.1. A fáziskontraszt mikroszkóp mûködésének optikai elve Ha egy festetlen készítményben eltérõ törésmutatójú alkotók vannak, a rajtuk áthaladó fénysugarak fázisa egymáshoz képest eltolódik (1. ábra). A tárgyon áthaladó fénysugár egyik része - az, amely az optikailag ritkább közegen halad át - késés nélkül folytathatja útját. A másik része, amely optikailag sûrûbb közegen halad át kicsit késik elõzõhöz képest. Lényegében tehát a két fénysugár között fáziseltolódás jön létre. A késés nélkül továbbhaladó, és késést szenvedett fénysugarak között megközelítõleg 1/4 hullámhosszúságú (1/4 ) útkülönbség keletkezik (1. ábra). Az 1/4 -nyi fáziseltolódás szemmel nem érzékelhetõ (1. ábra). Ha viszont az optikailag sûrûbb közegen történõ áthaladás és fénytörés eredményeként létrejött /4-nyi fáziseltolódást további /4-nyival megnövelnénk, az 1/2 -nyi eltolódás jól érzékelhetõ interferenciát okoz. Az eredmény az, hogy a mikroszkópban a tárgy különbözõ törésmutatójú részei egymástól jól elkülönülnek. A fáziskontraszt mikroszkóp elvi alapja 9
tehát az /4-nyi fáziseltolódás további 1/4-nyivel növelése. A kérdés az, hogy miként tudjuk további 1/4-nyi késésre késztetni a késlekedõ fényhullámokat. pozitív fázisgyûrû objektív tárgy Kondenzor negatív fázisgyûrû zöld színszûrõ 2. ábra. A fény útja a fáziskontraszt mikroszkópban I.2. A fáziskontraszt mikroszkóp képalkotása A fáziskontraszt mikroszkópban speciális tartozékok teszik lehetõvé a különleges képalkotást. Az éles kép létrehozásához a tárgyon áthaladó fényhullámok útjába, az objektív hátsó gyújtósíkjában egy fáziskésleltetõ lemezt, ún. pozitív fázislemezt (pozitív fázisgyûrût, közismert nevén fázisgyûrût) helyeznek el (2. ábra). A tárgyon lassabban átjutó /4-nyi késést szenvedõ fényhullámok a fázislemezen további /4-nyi fáziseltolódást késnek. Az eredmény 1/2 -nyi fáziseltolódás A hullámtörvényeknek megfelelõen az azonos fázisba kerülõ fényhullámok erõsítik, az ellentétes fázisúak kioltják egymást (3. ábra). Az eredmény szemmel is érzékelhetõ, vagyis a különbözõ törésmutatójú részek láthatóvá válnak. A fáziskontraszt mikroszkópban az objektív közepén keletkezõ direkt geometriai kép és a széli részen áthaladó, fénytörést, és fáziskésést szenvedett fénysugarak által alkotott kép találkozik egymással. (A legszélsõ sugarakat kizárják a képalkotásból, hogy ne zavarják az éles kép létrejöttét.) A különbözõ törésmutatójú részek egymástól élesen elkülönülnek, a kép kontrasztossá válik. A tárgy víznél nagyobb törésmutatójú részleteinek képe a környezeténél sötétebb lesz. A fáziseltolódás észlelését zöld fény hullámhosszára tervezték, mert a szemünk a zöld fényre a legérzékenyebb. Érthetõ, hogy a fáziskontraszt mikroszkóp színszûrõje zöld. A zöld színszûrõ, amely a kb. 550 µm hullámhosszúságú fényt engedi át, biztosítja az azonos hullámhosszúságú fotonokból álló fénynyalábot is. A fáziskontraszt mikroszkóp fényforrását az átlagosnál erõsebbre tervezték, hogy a zöld színszûrõ fényelnyelõ hatását ellensúlyozzák. 10
A B 3. ábra. A fáziskontraszt mikroszkópban bekövetkezõ 1/2 -nyi eltolódás következményei: erõsítés (A), illetve kioltás (B). I.3. A fáziskontraszt mikroszkóp különleges alkotórészei A különleges alkotók a következõk. Fáziskondenzor, fázisobjektívek, zöld színszûrõ (2. ábra), valamint a segédmikroszkóp. A fáziskondenzor elülsõ fókuszsíkjában van a negatív fázisgyûrû. Szerepe az, hogy a fényforrást a pozitív fázislemeznek megfelelõen gyûrû alakban engedje a tárgyra. A kondenzorban egy olyan forgatható tárcsa van, amelynek elforgatásával az adott objektívnek megfelelõ fázisgyûrû állítható az optikai tengelybe. A fáziskontraszt objektívek minden nagyítási fokozatán "Ph" (phasis) jelzés van. A pozitív fázisgyûrû az objektívekben van, és jól látható, ha az objektívbe a csavarmenet felõl belenézünk. A korong alakú fáziskésleltetõt a fázisobjektív hátsó gyújtó síkjában helyezik el. Szerepe az, hogy hozza létre az /4-nyi fáziskésést, pontosabban 1/2 -nyira növelje. A fázisgyûrû olyan átlátszó korong, amelyen egy gyûrû alakú vájat vagy kiemelkedés van, amelynek mérete és alakja megegyezik a kondenzorban elhelyezett fázisgyûrû méretével. A fáziseltoló réteget egy abszorpciós réteggel együtt alkalmazzák, mert az áthaladó fény bizonyos részének abszorpciója a kontraszt fokozódását eredményezi. A fáziskondenzorban lévõ fázisgyûrû az adott objektív fázisgyûrûjéhez méretezett, hogy a fényforrás képe és a fázisgyûrû minél tökélete-sebben fedje egymást. A különbözõ nagyítású objektívekhez más-más fázis-gyûrû tartozik. Mint említettük, a fázisgyûrûk egy forgatható tárcsába vannak beépítve. Minden egyes objektívnek a neki megfelelõ fázisgyûrûvel kell fedésbe kerülnie. A fázisgyûrûk pontos fedésbe igazítását az ún. központosító (centráló) csavarokkal érjük el. A forgatható tárcsán piros ponttal jelzett ablak van, amelyen, számjelzés alapján leolvasható, hogy milyen nagyítású objektívhez tartozó fázisgyûrû áll az optikai tengelyben. Ha a tárcsát "0" jelzésre állítjuk, a fáziskondenzor normál fénymikroszkóp kondenzoraként funkcionál, vagyis a fáziskontraszt mikroszkópot fénymikroszkópként is használhatjuk. I.4. A fáziskontraszt mikroszkóp beállítása és centrálása A fáziskondenzorban lévõ fázisgyûrûk és az objektívben lévõ fázislemez pontos fedésbe állítása a segédmikroszkóppal, valamint a központosító csavarokkal történik. 1. A fáziskondenzorral, fázis-objektívvel és zöld színszûrõvel ellátott mikroszkóp kondenzorán a "0" jelzést a ponttal jelölt ablakhoz állítjuk. (A mikroszkóp látóterét a preparátum olyan részére állítjuk, amely üres.) 2. A fáziskontraszt mikroszkóp 10-szeres, vagy 40-szeres nagyítású objektívjét a revolver szerkezettel a mikroszkóp optikai tengelyébe forgatjuk. A fényforrás fényét az optikai tengelyre vetítjük és a mikroszkópot a makro- és mikrométer csavarral élesre állítjuk. 3. Az okulárt kiemeljük a tubusból, és helyébe a segédmikroszkópot helyezzük be. 4. A segédmikroszkóp lencséjét addig húzzuk kifelé a tubusból, amíg a fázisgyûrû (negatív fázislemez) és az objektív fázislemezének gyûrû alakú képe élesen elõ nem tûnik (4. ábra). A segédmikroszkóp okulárját az éles képet adó helyzetben rögzítõcsavarral rögzítjük. Ügyeljünk arra, hogy a beállítás után a makro- és mikrométer csavarok ne mozduljanak el. 5. A fázislemezek gyûrû alakú képét a fáziskondenzor 11
központosító kulcsával pontosan fedésbe hozzuk (4. ábra). A mûveletet centrálásnak nevezzük. 6. A centrálás után a segédmikroszkópot kiemeljük a tubusból, és helyébe visszatesszük a mikroszkóp eredeti okulárját. A mikroszkóp most már használatra kész. A B 4. ábra. A fázisgyûrû centrálása. A fázisgyûrû (negatív fázislemez) és fázislemez egymáshoz viszonyított helyzete centrálás elõtt (A), és centrálás után (B). Natív készítmények vizsgálata Natív készítménynek nevezzük a minta anyagából (baktériumok, sejtek) közvetlenül, különösebb elõkészítés nélkül vizsgált preparátumokat. A fáziskontrasztmikroszkópia elõnye az, hogy a vizsgálat gyorsan elvégezhetõ, hiszen nem alkalmazunk hosszantartó fixálási, és festési eljárásokat. Minthogy a vizsgált sejt, élõlény él, alkalmunk van élõ sejtek, szövetek tanulmányozására. A sejtek eredeti méretben és alakban láthatók. Ugyanakkor a natív készítmények hátránya, hogy csak rövid ideig maradnak életben, gyorsan beszáradhatnak, elpusztulhatnak. Festett készítmények A sejtek morfológiáját leggyakrabban festett készítményekben vizsgáljuk. A preparátumok festést megelõzõ fixálása általában a sejtek pusztulását eredményezi. A fixálás és a festés fõ elõnye, hogy a megfestett sejtek erõsen elütnek a környezetüktõl, alaki tulajdonságaik jól meghatározhatók. A fixálási (rögzítési) eljárások alkalmazásával a preparátumok hosszú ideig eltarthatók. További elõny, hogy bizonyos festési eljárásokkal a sejtalkotók speciálisan is kimutathatók. Hátrányuk, hogy a fixálás és a festés során az eredeti méretek változhatnak, és természetesen a sejtek mozgása sem vizsgálható. Preparátumok készítése Az alkalmazott festékek szerves anyagok, és a specifikus celluláris anyagokhoz nagy affinitással kötõdnek. Például sok használatban lévõ festék pozitívan töltött (kationos) és erõsen kötõdik negatívan töltött sejtalkotókhoz, mint pl. nukleinsavak, savanyú poliszacharidák. Kationos festék pl. a metilénkék, a kristályibolya vagy a szafranin. Mivel a sejtfelszínek általában negatív töltésûek, a kationos festékek a sejtek felszíni struktúráihoz jól kötõdve kiváló általános festékeként szolgálnak. Más festékek, pl. eozin, savanyú fukszin, kongóvörös, negatív töltésûek (anionos) és olyan pozitívan töltött sejtkomponensekhez kötõdnek, mint például a fehérjék. A festési eljárásokat szárított, fixált keneteken végezzük. A festékoldatot úgy öntjük a kenetre, hogy a tárgylemez egész felszínét borítsa. A készítményeket festés után tárgylemez csipeszbe fogva kenettel lefelé folyóvízzel öblítjük, majd itatós között szárítjuk Érdemes megemlíteni, hogy a fáziskondenzor, a fázisobjektívek, a zöld színszûrõ és a segédmikroszkóp felhasználásával csaknem valamennyi normál fénymikroszkóp átalakítható fáziskontraszt mikroszkóppá. 12
I.5. Gyakorlati feladatok Vöröshagyma epidermisz nyúzat vizsgálata Vöröshagyma belsõ alleveleinek epidermiszébõl nyúzatot készítünk. Egy szikével, vagy egy pengével az allevél homorú oldaláról az epidermiszt lehúzzuk. Az epidermisz kisebb darabkáját tárgylemezre tesszük úgy, hogy a tárgylemezre elõbb vizet cseppentünk, majd a készítményt fedõlemezzel lefedjük. Vizsgáljuk meg a natív készítményt 10-szeres, 20-szoros, és 40-szeres nagyítású objektívekkel. Kontrollvizsgálatként minden nagyítási fokozat után iktassuk ki a zöld színszûrõt. A fáziskondenzor piros ponttal jelzett ablakához állítsuk a "0" számjelzést, hogy normál fénymikroszkópos képet kapjunk. Hasonlítsuk össze a látottakat! Rajzoljuk le a 20-szoros nagyítású objektívvel látott fáziskontrasztos képet és a zöld színszûrõ nélküli "0" fáziskondenzor állás mellett látott képet. Baktériumok, egysejtûek mozgásának megfigyelése Egysejtû élõlények cseppentsünk a tenyészetbõl tárgylemezre egy cseppet. Fedjük le a cseppet fedõlemezzel. A natív készítményt fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgáljuk meg és a sejtek mozgásából következtessünk mozgásszervecske jelenlétére, és fajtájára (flagellum, csilló). II. A polarizációs mikroszkóp 1. A polarizációs mikroszkóp mûködése A közönséges fény a tér minden síkjában rezgõ (sok síkban poláros) fényhullámok keveréke. Sarkítottnak vagy polárosnak mondjuk az olyan fényt, amely egyetlen rezgéssíkkal jellemezhetõ (5. ábra). A polarizációs mikroszkóppal a poláros fény adta lehetõségeket használja fel a mikroszkópos vizsgálatban. A fény eredetileg térbeli rezgés, de polarizáló szûrõn áteresztve már csak egy síkban, vagy egy vonal mentén rezeg. A polarizált fény alkalmas anizotróp, kettõs fénytörõ anyagok vizsgálatára. A A B B 5. ábra. A természetes (A) és a polarizált (B) fény rezgéssíkja. Amikor a fény speciális kristályszerkezeten halad keresztül két síkban rezgõ komponensre válik szét. Az egyik: egy a kristályba hatoló nyaláb, ami a fent említett szabályos fénytörést szenvedi el. A másik nem a fénytörési szabályok szerint megy át a kristályon, hanem teljesen szabálytalanul. A végeredményként két fénynyaláb eltérõ fázisban lesz, és a rezgési síkjuk is eltérõ lesz. A jelenség jól látható polarizációs mikroszkópban. A polarizációs mikroszkóp egy polarizátorral síkban rezgõ fényt állít elõ. A polarizált fény áthalad a tárgyon, az objektíven és utána az ún. analizátoron. Az analizátor megfelelõ állásban (merõlegesen a fény rezgõsíkjára) éppen lezárja a síkban rezgõ fényt. Alaphelyzetben a mikroszkóp látóterében teljesen sötét van. De ha anizotróp tárgy kerül a látótérbe (mint pl. kikristályosodott koleszterin az érfalban), akkor az analizátor a vizsgált szerkezettõl függõen bizonyos sugarakat átereszt, 13
azaz a kettõs fénytörés miatt az egyik tört hullámot az analizátor nem zárja ki. Az, hogy a polarizációs minta milyen színben tûnik elõ, függ az alkalmazott festéstõl és elõkészítéstõl. Poláros fény elõállítására alkalmas pl. a mészpát kristály. Ha mészpát kristályon természetes fényt bocsátunk át, a fény két sugárra bomlik. Egyikük, a rendes vagy ordinárius sugár, követi a Snellius-Descartes törvényt, és a beesési síkban halad. A másik, a rendellenes vagy extraordinárius sugár nem követi a Snellius-Descartes törvényt, és kilép a beesési síkból (6. ábra). Az ordinárius sugár rezgési síkja a kristály fõmetszetével párhuzamos, az extraordináriusé merõleges a kristály fõmetszetére. Polarizációs vizsgálatnál a két sugár zavarja egymást, az egyik sugarat el kell távolítani. Nicol angol fizikus egy olyan prizmát készített, melyben az ordinárius fénysugár teljes visszaverõdést szenved, az extraordinárius fénysugár viszont áthalad a kristályon és mint poláros fény lép ki (6. ábra). o eo P A 6. ábra A Nicol-féle prizma. A jelölések a következõk: o: ordinárius sugár; eo: extraordinárius sugár; P: polarizátor; A: analizátor. Régebben Nicol prizmákat alkalmaztak a polarizációs mikroszkópokban, újabban úgynevezett polarizációs szûrõket építenek be. A polarizációs szûrõ két üveglemez közé ragasztott nagyon vékony hártya, amelyben tû alakú párhuzamos fõtengelyû kristályok helyezkednek el sûrûn egymás mellett. A lemez csak a kristályok tengelyével párhuzamos fénysugarakat engedi át, tehát éppen úgy polarizál, mint a Nicol-féle prizma. Könnyen kezelhetõ és bármilyen nagyságban elkészíthetõ. A polarizációs mikroszkópok speciális alkatrészei 1. Polarizátor, amellyel a polarizált fényt állítjuk elõ 2. Analizátor, amellyel a poláros fényt vizsgáljuk 3. Kerek, fokbeosztással ellátott forgatható tárgyasztal A mikroszkópban a polarizátor a tükör és a kondenzor között foglal helyet. Az analizátor a tubusban vagy az okulárban van. Ha az okulárt a rajta lévõ analizátorral együtt 360 fokkal körbeforgatjuk, akkor azt tapasztaljuk, hogy a látótér kétszer megvilágosodik, kétszer elsötétül. A jelenség magyarázata az, hogy ha a polarizátor és az analizátor úgy helyezkedik el, hogy rezgési síkjuk egymásra kétszer lesz merõleges - keresztezett állás - akkor rajtuk nem jut át fény. A polarizátorral elõállított poláros fényt a keresztezett állású analizátor nem engedi át. Ha a polarizátor és az analizátor rezgési síkja párhuzamos, akkor a fény áthalad az analizátoron is. Az anyagokat fénytörésük alapján két nagy csoportra lehet osztani. (1) Az ún. izotróp anyagok a fényt egyszeresen törik. Bennük a fény minden irányban egyforma sebességgel terjed és a közeg egyetlen törésmutatóval jellemezhetõ. Amorf, rendezetlen szerkezetûek. Izotróp a legtöbb gáz és folyadék, valamint számos szilárd, de nem kristályos anyag (például az üveg). (2) Az ún. anizotróp anyagok a fényt kettõsen törik. Bennük a beesõ fény két, egymásra merõlegesen polarizált fénysugárra bomlik, amelyek a polarizációs mikroszkópban vizsgálhatók. Az anizotróp anyagok jellegzetes képviselõi a kõzetek, a növényi rostok, 14
keményítõ-szemcsék, valamint a rendezett struktúrát mutató biológiai rendszerek, mint pl. a lipoproteid membránok. Polarizációs optikával való vizsgálatra csak az anizotróp anyagok alkalmasak (7. ábra) 7. ábra. Példák a polarizációs mikroszkóppal vizsgált anizotrópiát mutató tárgyakra Ha a tárgyban lévõ nagyobb törésmutatójú alkotórészek hosszúkás alakúak és hosszanti tengelyükkel a tárgy hossztengelyével párhuzamosan rendezõdnek, akkor a kettõstörést pozitívnak nevezzük. Elõfordul például a kollagén rostok esetében. A negatív kettõstörés nem a kettõstörés hiányát jelzi, hanem olyan tárgyban keletkezett kettõstörést, melyben a nagyobb törésmutatójú alkotórészek a tárgy hossztengelyére merõlegesen rendezõdnek, Példának említhetõk a lamelláris struktúrák. Dikroizmus Dikroizmusról beszélünk, ha a jobbra és balra cirkulárisan haladó poláros fényre nézve az anyag elnyelõ képessége különbözik. Dikroizmus esetében a fény rezgésének amplitúdója és rezgési síkja is változik. Festetlen biológiai készítmények esetén ritkán találkozunk dichroizmussal. Kivételt például a burgonya keményítõ szemcséi (8. ábra). Elõidézhetõ viszont a szövetekben egyes festési eljárásokkal. Például egyes szerves festékek - pl. a kongóvörös, bizonyos struktúrákban dichroizmust okoznak a festékmolekulák speciális orientációja révén. Az eredetileg pozitív kettõstörésû tárgyaknak negatívvá válhat a kettõstörése, ha hosszanti lefutású részecskéire merõlegesen olyan struktúra orientálódik, amely a tárgy eredeti kettõstörésénél erõsebbet hoz létre. 8. ábra. A dichroizmust mutató keményítõ szemcse szerkezete 15
2. A polarizációs mikroszkóp jelentõsége A polarizációs mikroszkóp anizotrop struktúrák rendkívül finom elemzésére alkalmas, mivel a vizsgált anyagok gyakran még elektronmikroszkóppal sem követhetõ molekuláris változásait fényjelenségek formájában követi. Segítségével például a kollagén rost elkülöníthetõ más rostelemektõl. Korábban, amikor még jó felbontóképességû elektronmikroszkóp sem állt a kutatók rendelkezésére, a polarizációs mikroszkóppal állapították meg, hogy a sejtmembránt bimolekuláris lipidréteg építi fel. A technikával tisztázták az izom, porc és csontszövet és keményítõ szubmikroszkópikus szerkezetét. Hazai kutatók polarizációs mikroszkópos technikával ismerték meg a kollagén és az elasztikus rostok szerkezetét. A polarizációs mikroszkóp diagnosztikai célokra is használatos. Bizonyos foglalkozási betegségekben pl. szilikózis, a belélegzett káros anyagok (porok) kimutatását a polarizációs mikroszkóp jelentõsen megkönnyíti. A polarizációs mikroszkóp megalkotásával olyan eszköz áll rendelkezésünkre, amely a fénymikroszkóp lehetõségein túllépve, a rendezett szerkezetû mikroszkópikus szerkezetek tanulmányozását teszi lehetõvé. 3. Gyakorlati feladatok Ca-oxalát kristályok vizsgálata A vöröshagyma (Allium cepa) külsõ, száraz burokpikkely leveleit apró darabokra vágjuk és 5 percre 50%-os alkoholba helyezzük. Az alkohol a sejtek közötti térbe jut, a vizsgálatot zavaró légbuborékokat eltávolítja. A pikkelylevél darabkát tárgylemezre tesszük, lefedjük fedõlemezzel, majd polarizációs mikroszkóppal megvizsgáljuk. Keményítõszemcsék vizsgálata Kettévágott burgonya vágási felületérõl kevés kaparékot veszünk. Cseppentsük le vízzel, egyenletesen terítsük szét a tárgylemezen, és fedjük le. Vizsgáljuk meg a keményítõ szemcséket polarizációs mikroszkóppal. A látótérben ovális, kagyló alakú keményítõszemcséket látunk, melyekben szabálytalan kereszt alakú képzõdmény húzódik. NaCl kristályok vizsgálata Szórjunk a tárgylemezre kevés konyhasó kristályt. Lefedés nélkül vizsgáljuk meg polarizációs mikroszkóppal. Vizsgáljuk meg a citoplazma-organellumokat elektronmikroszkópos képeken. Oldjuk meg az album feladatait. A megoldásokat írjuk be a gyakorlati jegyzõkönyvbe. 16