QUANTA Lite TM h-ttg IgG (Humán szöveti transzglutamináz) 708755 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

QUANTA Lite TM h-ttg IgG (Humán szöveti transzglutamináz) 708755 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM h-ttg IgG egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) a szöveti transzglutamináz (endomysium) ellenes IgG antitestek szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. Ezeknek az antitesteknek a kimutatása, az IgA ellenanyagokkal együtt felhasználható a glutén-szenzitív enteropathiák, mint a coeliakia és a dermatitis herpetiformis diagnosztikájában. Ez a teszt a diagnosztikai folyamat érzékenységét javítja IgA deficiens betegek esetében. A teszt összegzése és magyarázata A coeliakia betegség és a dermatitis herpetiformis, a glutén szenzitív enteropathia (GSE) két ismert formája, az intestinalis mucosa krónikus gyulladásával és az epithelium ellaposodásával, vagy pozitív "boholy atrophia" eredménnyel jellemezhető. 1,2 A GSE oka a glutennel, a búza, rozs és az árpa fehérje komponensével szemben kialakult intolerancia. A coeliakiás betegek hasmenéstől, gastrointestinalis problémáktól szenvedhetnek, anemia, fáradékonyság, psychiatriai problémák és más szerteágazó mellékhatások jelentkezhetnek, vagy éppen tünetmentesek is lehetnek 2. A dermatitis herpetiformis egy bőrbetegség, ami GSE kapcsán alakul ki. Minden GSE betegnek fokozott a lymphoma kockázata. 3 A gluténmentes diéta képes egyensúlyban tartani a GSE folyamatát és a vele kapcsolatos szövődményeket. Az 1950-es években tett felfedezés, miszerint a glutén okozza a coeliakia betegséget, lehetővé tette a kezelést azáltal, hogy a beteget gluténmentes diétára tesszük. Miután kifejlesztettek egy módszert a vékonybél biopszia szájon át való kivitelezésére, az orvosok képesek lettek a bélboholy-atrophia ellenőrzésére. Mivel azonban boholyatrophia pozitivitás más betegségekben is előfordulhat, a GSE bizonyítható a European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) eredeti kritériumai alapján. Ezek a kritériumok körülbelül egy éves kimerítő vizsgálatsorozatot igényelnek, ezen belül: a) egy kezdeti pozitív bélbiopszia, b) 6 hónap gluténmentes diéta, c) ezután egy negatív második bélbiopszia, d) egy gluténterheléses szakasz 6 hónapon át e) egy pozitív harmadik bélbiopszia. Három különböző, IgA izotípushoz 3 tartozó ellenanyag vizsgálatára kidolgozott szérum tesztek megjelenése tette lehetővé a gyorsabb, javított ESPGAN kritériumok felállítását a coeliakia betegség diagnosztikájára 1990-ben. 2 Ezek között van az IgA endomysialis antitestek (EMA) 4 IgA antigliadin antitestek (AGA) és az R1 antireticulin antitestek (ARA) vizsgálata. A revideált ESPGAN kritériumok megkövetelik: a) egy egyszeri pozitív bélbiopszia és b) a fentebb említett három IgA típusú ellenanyag közül legalább kettőnek a kimutatását. Azóta számos tanulmány igazolta, hogy az IgA EMA tesztek specificitása nagyobb, mint 99% GSE vonatkozásában és a szenzitivitása nagyobb, mint az ARA vagy az AGA teszteké. 5-13 Mivel az IgA EMA eltűnik, ha a coeliakiás vagy dermatitis herpetiformisban szenvedő beteg szigorúan gluténmenets diétán van, ezeknek az ellenanyagoknak a vizsgálata a diéta betartásának ellenőrzését is lehetővé teszi. 4,5,12 Újabban az endomysialis antigénről kiderült, hogy az nem más, mint a fehérjéket keresztkötő enzim, a szöveti transzglutamináz (ttg). 14,15 A ttg-t tartalmazó, antigén specifikus ELISA eljárások egy megbízható, objektív alternatívát kínálnak a hagyományos, immunfluorescencián alapuló, szubsztrátként majom oesophagus vékony szöveti metszeteit igénylő módszerrel szemben. 14-19 Az ELISA eljárás adaptálható kisebb és nagyobb beteg-minta sorozatok vizsgálatára. A legutóbbi két év során a humán ttg antigént rekombináns technológiával állították elő. A rekombináns humán antigénnek a hagyományosabb, tengerimalac májból izolált antigénnel szemben bizonyos előnyei lehetnek. 16,17,20 A coeliakia betegség szerológiai vizsgálatában megjelent két újabb előrelépés a vörösvérsejtekből izolált natív humán szöveti transzglutamináz használata antigénként, és az IgG osztályú szöveti transzglutamináz antitestek detektálására alkalmas tesztek használata. A natív humán vörösvérsejt-ttg használata a tengerimalac vagy a rekombináns humán antigénnel szemben lehetővé teszi az antigén tisztításának egyszerű módját, és baktériumból, rovarokból vagy más forrásból származó fehérje szennyeződéstől mentes készítményt eredményez. 21, 22, 23, 24 A szakirodalomban ismertetett humán ttg antigén ELISA tesztek, a 1 16, 17, 20-23 hagyományosabb tengerimalac antigént tartalmazó tesztekkel összehasonlítva jól működnek. Egy gyakori probléma, amivel coeliákiás betegek szerológiai vizsgálata során szembesülnek, az, hogy a coeliakiás betegek között nem ritka az IgA deficiencia. Ez az IgA hiány valószínűleg az egyetlen, legjelentősebb tényező, ami a téves negatív szerológiai eredményekhez vezet biopsziával igazolt coeliakiás

betegekben. 25 Ennek kiküszöbölése céljából sok laboratórium végez IgG meghatározásokat olyan általánosan tesztelt, coeliakiával kapcsolatos antitestekre, mint a reticulin és gliadin. 25 A legtöbb IgA deficiens coeliakiás pácienst pozitívnak találták IgG osztályú reticulin és gliadin ellenanyagra nézve. 18 Számos munkacsoport beszámolt a ttg assay IgG változatának használatáról, annak érdekében, hogy az IgA deficiens betegeket megtalálják. 17,18,20,21 Az egyik ilyen tanulmányban a teszt szenzitivitása 98.5%-ra nőtt, amikor az IgA és IgG eredményeket együttesen értékelték, a 91.5%-kal szemben, ami az IgA antitestek egyedüli vizsgálata adott. 18 A módszer elve Friss vörösvérsejtekből izolált natív humán transzglutamináz (h-ttg) antigént kötöttek polisztirén mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához olyan körülmények között, ami képes az antigén natív állapotát megőrizni. Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő h-ttg IgG antitestek kikötődnek az immobilizált antigénhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, tisztított h-ttg antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek h-ttg antigén ellenes IgG antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. h-ttg IgG ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum h-ttg ellenes IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. h-ttg IgG ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum h-ttg ellenes IgG antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. HRP Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg kék színűre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontroll, az h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 26 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy 2

az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. 3

Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az CSLI (NCCLS) Document H18-A3 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 h-ttg IgG ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL h-ttg IgG ELISA Low Positive (mérsékelten pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL h-ttg IgG ELISA High Positive (erősen pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL HRP Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:101 arányú hígítást a következő módon: adjon 5µL mintát 500µL HRP minta diluenshez. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. NE HÍGÍTSA a h- ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontrollt, a h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. 4. A h-ttg IgG antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontrollból, a h-ttg IgG 4

ELISA erősen pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. A h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel a h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontroll, a h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll abszorbanciája 0.7-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.2-nél. c. A h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.25. d. Az ELISA negatív kontroll és a h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. A h-ttg IgG ELISA erősen pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az CLSI (NCCLS) Document C24-A3 tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása meghatározható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk a h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív 5

kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk a h-ttg IgG ELISA mérsékelten pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység mérőszámával. Minta OD Minta eredménye = x h-ttg IgG ELISA mérs. Pozitív (egység) h-ttg IgG ELISA mérs. Pozitív OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, gyengén pozitív, mérsékelten pozitív vagy erősen pozitív az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív < 20 Gyengén pozitív 20-30 Mérsékelt - erős pozitív > 30 1. Egy pozitív eredmény h-ttg IgG antitestek jelenlétére utal, és felveti bizonyos glutén-szenzitív enteropathiák, mint coeliakia és dermatitis herpetiformis fennállásának a lehetőségét. 2. Egy negatív eredmény arra utal, hogy a mintában nincs h-ttg IgG antitest, vagy annak koncentrációja a teszt negatív küszöb értéke alatt van. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott vélemény tartalmazza az alábbi kijelentést: Az itt következő eredmények az INOVA QUANTA Lite TM h-ttg IgG ELISA használatával keletkeztek. A különböző gyártók assay módszereivel kapott h-ttg IgG értékek nem használhatók felváltva. A közölt IgG értékek nagysága nem hasonlítható egy végpont-titer értékhez. A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Egy negatív h-ttg IgG eredmény kezeletlen beteg esetében nem zárja ki a glutén-szenzitív enteropathia lehetőségét. A beteg lehet IgA pozitív, vagy előfordulhat, hogy nincs ttg antitestje. 3. Az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 4. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek A QUANTA Lite h-ttg (human tissue transglutaminase) IgG ELISA teszt alkalmasságát a szöveti transzglutamináz ellenes IgG antitestek detektálására egy másik, kereskedelmi forgalomban lévő IgG ttg antitest kimutatására szolgáló teszttel történt összehasonlítás segítségével határozták meg, összevetve az aktuális klinikai diagnózissal, két külső klinikai vizsgálatban és egy belső tanulmány során. Referencia tartomány A referencia (normál) tartomány meghatározása az INOVA kutató laboratóriumában történt. Összesen 185 mintát teszteltek. 102 férfi donort vizsgáltak, életkoruk 6-60 év között volt, az átlagos életkor 34 év. A vizsgált 83 nő életkora 7-63 év között volt, az átlag 31 év. 6

Ennek a 185 mintának a QUANTA Lite h-ttg IgG kittel történt tesztelése során csak egy minta (0.5%) volt pozitív. Ennek a mintának az eredménye (21 egység) meghaladta a küszöbértéket. Ezen az egy gyengén pozitív mintán kívül a következő legmagasabb érték 8 egység volt. A normál minták vizsgált csoportjára kapott átlagérték 3.7 egység lett. Klinikai szenzitivitás és specificitás A QUANTA Lite TM h-ttg (human tissue transglutaminase) IgG antitest kitet belső vizsgálattal ellenőrizték klinikailag kijelölt mintákkal. Az alábbi táblázat foglalja össze az eredményeket: Patient Group No. No. Poz (%) Normál 185 1* (0.5%) Coeliakia 24 15 (62.5%) Coeliakia (gyermek) 11 1 (9%) Coeliakia IgA deficiens 16 15** (94%) Ulcerativ colitis 14 0 Crohn betegség 6 0 Patient Group No. No. Poz (%) Anemia perniciosa 6 0 Krónikus aktív hepatitis 9 0 Kevert kötőszöv. Antitest pozitív minta 55 0 * Ez az 1 minta gyengén pozitív volt, 21 egységgel. ** Az 1 negatív minta gluténmentes diétán lévő pácienstől származott. A minta negatív volt IgG endomysialis antitestre is. Kereszt-reaktivitás A QUANTA Lite h-ttg IgG kit specificitásának további ellenőrzése érdekében összesen 90, más gastrointestinális betegségben szenvedő beteg, valamint különböző kötőszöveti betegségekkel kapcsolatos autoantitestre nagy titerrel pozitív betegek mintáit tesztelték. 14 ulcerativ colitises, 6 Crohn beteg, 6 anemia perniciosa, 9 krónikus aktív hepatitises beteg szérumát tesztelték. Ezen felül teszteltek egy olyan szérumokból álló csoportot is, amelyeket más INOVA autoantitest ELISA kitek gyártásához gyűjtöttek. Összesen 55 ilyen savót teszteltek, ezek között volt 8 SS-A pozitív, 6 SS-B pozitív, 9 Sm pozitív, 11 RNP pozitív, 13 Scl-70 pozitív és 8 Jo-1 pozitív. Ebből a 90 mintából egy sem volt pozitív humán ttgellenes IgG antitestre. Valójában egy kivétellel a minták eredménye nem volt 7 egységnél magasabb, az az egy egy Crohn beteg mintája volt, de ez az eredmény (15 egység) is egyértelműen a 20 egységnyi küszöbérték alatt volt. Precizitás és reprodukálhatóság Az assay precizitását és reprodukálhatóságát egy erősen pozitív, egy gyengén pozitív és egy negatív minta hat paralell vzsgálatával határozták meg, hat különálló sorozatban megismételve. Az átlagos reaktivitás az erősen pozitív mintában 85 egység, a gyengén pozitív minta átlaga 25, a negatív mintáé 14.7 volt. Az alábbiakban összefoglalva láthatók a sorozatok standard deviációi és variációs együtthatói az egyes minták esetében. Negatív Erősen pozitív Gyengén pozitív SD CV SD CV SD CV Általános 0.40 2.7% 2.16 2.5% 0.63 2.5% Sorozaton belül 0.37 2.5% 1.75 2.1% 0.67 2.7% Sorozatok között 0.28 1.9% 1.59 1.9% 0.32 1.3% 7

Hivatkozások 1. Meuweisse GW. Diagnostic criteria in celiac disease. Acta Paediatr Scand 59: 461, 1970. 2. W. Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Shmerling DH, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis of celiac disease: Report of working group of Euorpean Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN). Arch Diseases of Childhood 65: 909-911, 1990. 3. Chorzelski TP, Beutner EH, Zalewski TK, et al. editors. Serologic diagnosis of celiac disease. Boca Raton (FL): CRC Press, 1990. 4. Chorzelski TP, Sulej J, Tcherzewska H, et al. IgA class endomysium antibodies in dermatitis herpetiformis and celiac disease. Ann NY Acad Sci 420: 325-334, 1983. 5. Volta U, Molinar N, De Franchis R, et al. Correlation between IgA antiendomysial antibodies and subtotal villous atrophy in dermatitis herpetiformis. J Clin Gastroenterol 14: 298-301, 1992. 6. Valdimarsson T, Franzen L, Grodzinsky E, Skogh T, Strom M. Is small bowel biopsy necessary in adults with suspected celiac disease and IgA anti-endomysial antibodies? 100% positive predictive value for celiac disease in adults. Digestive Diseases and Science 41: 83-87, 1996. 7. Unsworth FJ. Serologic diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J Clin Path 49: 704-711, 1996. 8. Volta U, Molinaro M, Fusconi M, Cassani F, Bianchi FB. IgA antiendomysial antibody test: A step forward in celiac disease screening. Digestive Diseases & Science 36: 752-756, 1991. 9. Wilfang S, Knauss M, Stern M. IgA endomysiumantikorper. Montsschr Kinderkeilkd 140: 639-645, 1992. 10. Muscart-Lemone F, Van den Broek J, Cadranel S, Colombel JF. Serologic aspects of celiac disease. Acta Gastro-Enterologica Belgica 55:200-208, 1992. 11. Grodzinsky E, Hed J, Skogh T. IgA antiendomysium antibodies have a high predictive value for celiac disease in asymptomatic patients. Allergy 49: 593-597, 1994. 12. Sategna-Guidetti C, Pulitano R, Grosso S, Ferfoglia G. Serum IgA antiendomysium antibody titers as a marker of intestinal involvement and diet compliance in adult celiac sprue. J Clin Gastroenterol 17: 123-127, 1993. 13. Catassi C. Screening of coeliac disease. In: Maki M, Collin P, Visakorpi JK. editors. Coeliac disease. Tampere (Finland): Coeliac Disease Study Group; p. 23-33, 1997. 14. Dieterich W, Ehnis T, Bauer M, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine 3: 797-801, 1997. 15. Sollid LM, Molberg O, McAdam S, Lundin K, et al. Autoantibodies in coeliac disease: tissue transglutaminase guilt by association? Gut 41: 851-852, 1997. 16. Beutner EH, et al. A case of dermatitis herpetiformis with IgA endomysial antibodies but negative direct immunofluorescent findings. J Am Acad Dermatol 43: 329, 2000. 17. Sardy M, et al. Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of glutensensitive enteropathy. Clin Chem 45: 2142, 1999. 18. Sblattero D, et al. Human recombinant tissue transglutaminase ELISA: an innovative diagnostic assay for celiac disease. Am J Gastroenterology 95: 1253, 2000. 19. Sugai E, et al. Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Am J Gastro 95: 2318-2322, 2000. 20. Lampasona V, et al. Tissue transglutaminase and combined screening for coeliac disease and type 1 diabetes-associated autoantibodies. Lancet 352:1192-1193, 1998. 21. Hansson T, et al. Antibody reactivity against human and guinea pig tissue transglutaminase in children with celiac disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 379, 2000. 22. Andersson AS, et al. Inhibition of endomysial staining with human tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000. 23. Axiö-Frekricksson UB, et al. Differences in human and guinea pig tissue transglutaminase. Ninth International Symposium on Celiac Disease. J Pediatric Gastroenterology and Nutrition 31: S16, 2000. 24. Signorini M, et al. Human erythrocyte transglutaminase: Purification and preliminary characterization. Biological Chemistry 369: 275, 1988. 25. Collin P, Mäki M, et al. Selective IgA deficiency and Coeliac disease. Scand J Gastroenterol 27: 367, 1992. ' 26. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National 8

Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628755HUN October 2007 Revision 0 9