Nemzei Kuaási és Fejleszési Program 1. Főirány: Éleminőség javíá Nemzei Onkológiai Kuaás-Fejleszési Konzorcium a daganaos halálozás csökkenésére 1/48/21 3. Részjelenés: 23. November 3.-24. december 31. RP.9. Rosszindulaú agydaganaok géneráiájának bevezeése Dr. Nyáry Isván Országos Idegsebészei Tudományos Inéze 1
RP9. A géneráia klinikai bevezeése a rosszindulaú agydaganaok kezelésére Témavezeő: dr. Nyáry Isván, Országos Idegsebészei Tudományos Inéze Részvevők: dr. Sáfrány Géza, OKK,OSSK, dr. Mécs Imre, Bay Z. Bioechnológiai Inéze A/ Az állakísérleek során használ adenovírus alaú vekorrendszer humanizálá. B/ Az emberi GM-CSF-e kódoló adenovírus alaú vekor klinikai minőségű előállíá. C/ Primer sejvonalaka készíünk glioblaszomás beegekből elávolío daganaból. D/ Agydaganaos beegek vakcinálá GM-CSF-e ermelő, auológ daganasejekkel. E/ Vakcinál beegek klinikai üneeinek nyomon köveése. F/ Az immunrendszer akivációjának a nyomon köveése. G/ Az eljárás haásfokának növelése dendriikus sejekkel való kombináció segíségével. ÖSSZEGEZÉS l.) Kialakio aszeikus laboraóriumi részlegünkben a szöveenyészésre alkalmazo anyagaink és eljáráink alkalmasnak bizonyulak GM-CSF- kódoló, nyers Adeno 5 vekor vírus előállíására nagyobb (17 ml) mennyiségben előállíani 1 ll -1 l2 TCID5/ml ierrel. 2.) Az álalunk előállio rogeny vekor virion ool-ok első és második asszái nem aralmazak infeciv Adeno 5 virion, azaz asszálásuk alkalmával nem örén a vekor virusok genomjában back muáció. 3.) Az álalunk előállío virion ool-ok első és második asszázinak bizonsági vizsgálaai során kiderül, hogy azok menesek bármely aerob, anaerob bakérium Mycobacerium uberculosis, és mikroszkoikus gomba, Mycolasma, Chlamydia, Heaiis B és C vírus, Cyomegalovírus, Heres simlex vírus 1 és 2. íusáól és nem aralmaznak yrogén anyago. 4.) Ezek alaján az álalunk előállío, s GM-CSF- kódoló, vekor Adeno 5 virionok első és második oolozo asszáz felhasználhaó olóvíruskén iari, vagy laboraóriumi méreű vekor vírusok előállíására, vagy ovábbi iszíás és koncenrálásnak aláveve heráiás célra is felhasználhaó. A rojec során előállío vírunyago ovábbi hasznosíás céljára áadjuk az Országos Jolio- Curie Sugárbiológiai Inézenek. 1. a.) Aszeikus körülmények közö, H-293 MS 2 ermissive sejkulurákban 17 ml GM-CSF- kódoló Adeno 5 rogeny vekor virion állíounk elő. Az Országos Jolio-Curie Sugárbiológiai Inézeből Dr. Sáfrány Géza rojekvezeő úr bocsáoa rendelkezésünkre az un. ermissive - koncenrál és iszío- vekor vírus inokulumo és a szaoríásukra alkalmas H-293 MS 2 ermissive sejkulúrá (2x,5 ml). Az inokulum mennyiségének limiál vola, valamin a asge-k során eseleg felléő muációk, neán járulékos ferőzések ellenőrzésére, elsősorban ezzel az inokulummal ferőzö sejekben szaorío rogeny virionok anyagá használuk, s 1.asge jelöléssel külön ároluk és ellenőrizük az így előállío egyes rzsoka. Az l.asge-ból származó vekor virionokból szaoriouk ovább a vekor virusok egyes rzi, s 2.asge jelöléssel ároluk és ellenőrizük őke. 2
A back muánsok ellenőrzésére, valamin a mikroiráor lemezekben végze vírusirálások módszerének kidolgozására a He 2 sejkulurá és a iszío és koncenrál vad Adeno 5 vírus a SZOTE Mikrobiológiai Inézeéből, Prof. Puszai Rozáliáól szerezük be. 1. b.) A Progeny vekor virionoka 14 részleben (rzs) állíouk elő, 6 ml-es T- flaskákban kifejlesze, 3-4 naos ermissive (293-as) monolayer kulúrákban. Hé eseben a Dr. Sáfrány émavezeő úról kao.1 ml inokulummal (1.asge), hé eseben edig az ebből a asge-ból származó,2 2 ml-es inokulummal ferőzö ermissive monolayerekben (2.asge). Ké órán á 37 o C-on adszorbeáluk a monolayereke az inokulummal, seril PBS-el mosuk, majd 75 ml - seril és yrogén menes - 5% GIBCO feal calf szérumo aralmazó SIGMA RPMI mediummal ölöük fel a ferőzö enyészeeke és 37 o C-on 5%-os CO 2 amoszférán inkubáluk az inenzív cyoahogén haás (5-7 na) megjelenéséig. Ekkor -7 o C-on lefagyaszouk a ferőzö enyészeeke, s ezen a hőmérsékleen ároluk. 2.) Meghaározuk a rogeny vekor virionok ieré ermissive H-293 MS 2 sejkulúrák mikroiráor enyészeeiben, ami álagon 1 11 TCID 5 / ml -nek alálunk. (A TCID5 meghaározására a viális neurálvörös fesésnél sokkal érzékenyebb iodoniroerazolium kloridos fesés (1) alkalmazuk, ami ck az érinelen dehydrogenáz enzimakiviásl rendelkező, é sejekben alakul á oldhaalan, vörös színű cadékká. Ez eszi rendkívül onossá a vírusirálások végonjainak megállaíásá, mivel a ferőzés kövekezében károsodo sejek nem fesheők meg ezzel az eljárásl.) Az I.sz. Foón a vekor virionok irálásá muajuk be H-293 MS 2 ermissive mikroiráor enyészeekben, a II.sz. Foón edig a hasonló körülmények közö He 2 sejekben szaorío, vad Adeno 5 virionok irálásá He 2 mikroiráor enyészeekben, erazóliumos feséssel. 3.) Ellenőrizük a izennégy 75 ml-es rzs -ban előállío 1. és 2.asge-ból származó rogeny vekor virion készímények iszaságá, négy - négy árhuzamos Oxoid dexrose ryone broh (code: CM73)-ban, illeve Oxoid anaeroban, 5% birka vörösvérese aralmazó véregar áalajon (Code :AN 25 és BR 42 caalys),.5 -.5 ml inokulumo alkalmazva, aerob, illeve anaerob mikrobák kimuaására, 37 o C-on, 5 naig inkubálva. (2). Mikroszkoikus gombák és éleszők kimuaására is, rzsonkén 4-4 Sabouraud liquid médiumra olásl (code: CM147) és 5 naos inkubálásl járunk el. (2) 4.) A vekor virion rzsok járulékos vírusferőzöségé Vero sejkulurákban kifeje cyoahogén haásuk alaján ellenőrizük, mely közismeren érzékeny humán enerovirusok és heresvirusok kimuaására. A 3. és 4. onok ellenőrzései során valamennyi vekor vírus rzso - bakérium és mikroszkoikus gomba - serilnek, illeve járulékos vírusferőzésől menesnek aláluk és ké ( 1. és 2. asge-ból származó) ool-ba egyesíeük. 5.) A ovábbi ellenőrző vizsgálaoka ezekről az egyesíe vekor virion ool-okból végezük. 5. a.) A Chlamydia (rachomais, siaci és neumoniae) anigén kimuaás az ÁNTSZ ben hivaalon bevezee ELISA módszerével végezük el (3., 4.), s a vekor virion ool-oka chlamydia menesnek aláluk. 3
5. b.) A Mycolasma neumoniae kimuaás ugyanck az ÁNTSZ-ben hivaalon bevezee enyészési eljárásl hajouk végre (5.),s a vekor virion ool-oka myco lasma menesnek aláluk. 5. c.) A vekor virion ool-oknak, a asgek során felléő eseleges back muációjá 1 mles (non ermissive) He 2 monolayer kulúrákban és/vagy mikroiráor enyészeek ben, majd ez köveően ermissive sejek mikroiráor enyészeeiben ellenőrizük. (A He 2 monolayereke 1 ml, a He 2 mikroiráor enyészeeke edig.1 ml ömény rogeny vekor virion 1 és 2 asge-jával ferőzük, s 5 naig 37 o C-on inkubáluk. Mivel a vekor virion ferőzés ezala haározalan cyoahogén haás idéze elő (III. sz. Foó) az így előállío virion subculúrá H-293 MS 2 mikroiráor enyészeekben isméelen megiráluk a He 2 sejek ömény és különböző hígíású felülúszójával) (IV. sz. Foó). E második, un. ermissive sejkulúrákban egyelen eseben sem észlelünk cyoahogén haás, sem az 1,sem a 2 asge-ból származó rogeny vekor virion ool-okban. Ez kizárja a GM-CSF- kódoló Adeno 5 vekor vírus back muációjának valószínűségé, mind a iszío és koncenrál inokulumban, mind edig az 1 és 2 asge-ból származó, 2 ml-es inokulummal előállío rzsok eseében. (Ugyanis, hasonló körülmények közö, nem fesődő és jellegzees cyoahogén haás alakul ki a vad vírusl ferőzö non ermissive He 2/C sejekben.)(v.sz. Foo). 5. d.) Az álalunk előállío vekor( 1. és 2.asge) virion ool-ok yrogeniásá a SIGMA-ALDRICH Kf. módszerével ellenőrizük. Poziív konrollkén a Sigma 21-A 1 E-Toxae reagens ki-jé alkalmazuk (Procedure No. 21), mely rendkívül érzékeny különböző lazmák, s egyéb folyadékok endooxin aralmának meghaározására. Poziív konrolunk eseében a yrogeniás végonja,25 NE/ml endooxin vol. Az ilyen érzékenységű yrogeniási eszel, a koncenrál (nem higío) 1 és 2 vekor virion ool-ok és különböző, 1:2 alaú hígíái negaívnak bizonyulak. Ezek alaján állíhajuk, hogy a GM-CFS- kódoló, álalunk előállío rogeny vekor virion ool-ok yrogén menesek. 5. e.) Cyomegalo vírus jelenléé az 1. és 2.asge-ból származó rogeny vekor virion ool-okban PCR módszerrel ellenőrizük (6) Dr. Puszai Róza rofesszor asszony segíségével, az un. nesed-pcr módszerrel. Sem az eredei, koncenrál Sugárbiológiai Inézeől rendelkezésünkre bocsáo,(1.sz. mina) sem edig a vele ermisszive 293 sejkulúrában előállío rogeny virionokban (2, 3, és 4. sz. mina) nem vol jelen kimuahaó Cyomegalovirus.(Lásd: I.sz. Tábláza). 5. f.) Vekorvirus Adeno 5 iusának bizonsági molekuláris biológiai vizsgálaa PCR módszerrel Mind az eredei, Sugárbiológiai Inézeből származó, koncenrál, Adeno 5 íusú vekor oló vírusban (1.sz. mina), mind az ezzel a 293 sz. komeens sejek monolayereiben előállío első asszázsában (2.sz. mina), és második asszázsában (3..sz. mina) leellenőrizük a Szegedi Tudományegyeem Szen-Györgyi Alber Orvos és Gyógyszerészudományi Cenrum Klinikai Mikrobiológiai és Diagnoszikai Inézeében (Dr. Deák Judi docens asszony segíségével) Arhus és Roche kiekkel a Chlamydia 4
rachomais, a Heaiis B és C, a Cyomegalovirus, az Enerovirusok, a Heres simlex l és 2. iui,valamin a Mycobacerium uberculosis nukleinvainak jelenléé. A felsorol kórokozók valamennyi eseében negaív eredmény kaunk. ( I.sz. Tábláza) (Az erről szóló anúsívány coljuk). Irodalmi hivakozások: l.) Nachlas M.N. e al. :Anal.Biochem. 1. 317 (196.) 2.) Oxoid manual (1998) 3.) Saikku P.: Proc.3rdChlamydia Res..215 (1996), Vienna 4.) Isenberg H.D. : Clinical Microbiol.,Procedures Handbook 2.vol.(1992),Washingon 5.)Klinikai és Járványügyi Bakeriológiai Kézikönyv. (1999). Szerk. Czirok Éva 6.)Lukácsi A. e al.(21) J.Med.Virol. 65. 537-542. 5
A GM-CFS- kódoló ADENO 5 vekor vírus bizonsági vizsgálaa Mina TCID 5 /ml Bakérium Heaiis MYCOPL. CHLAMY. PYROGÉN 293 He 2 aer anaer B C CMV Enero vírusok Heres s. 1 2 TBC 1. 2. 3. 4. 1 13-1 14 1 11-1 12 1 11-1 12 1 11-1 12,,, - - v - - - MINTÁK EREDERTE: 1./ Sugárbiológiai Inézeből kao eredei, koncenrál vekor vírus / 2 x,5 ml / 2./ Az eredei mina első asszáz 293 számú ermisszív szövekulúrán / 92 ml ool / 3./ A 2. sz. mina újabb /második/ asszáz 293 számú ermisszív szövekulúrán / 85 ml ool / 4./ Az eredei mina más rzsból származó első asszáz 293 számú ermisszív szövekulúrán / 85 ml / JELMAGYARÁZAT: : enyészéssel nyer eredmény, : PCR echnikával kao eredmény v: Vero szövekulúrán végze enyészés : Sigma-Aldrich yrogeniási esz 6