1 5. A DNS Mutáció Hibajavítás MUTÁCIÓ ÉS HIBAJAVÍTÁS DIA 29 DIA 30 DIA 31 DIA 32 MUTÁCIÓK Definíció: a mutáció a DNS nukleotid sorrendjének megváltozása. Csoportosítás A mutációkat többféleképpen csoportosíthatjuk. (1) Aszerint, hogy milyen típusú sejtekben fordul elő, csíravonal vagy szomatikus mutációról beszélünk. Csíravonal mutációk az ivarsejtekben vagy azok elősejtjeiben keletkeznek, s átadódhatnak az utódoknak. Szomatikus mutációk a testi sejtekben történhetnek. Ezek a genetikai elváltozások csak az utódsejteknek adódhatnak át, de nem örökíthetők. (2) Aszerint, hogy mekkora DNS szakaszt érint, beszélhetünk kis és nagy mutációkról. A kis mutációk érinthetnek egyetlen (pontmutációk) vagy néhány bázist, a nagy mutációk nagyobb DNS szakaszokat, esetleg egész kromoszómákat. (3) Egy mutációt okozhatnak szervezeten, ill. sejten belüli és kívüli okok, ez alapján beszélhetünk spontán vagy indukált mutációról. A mutációk érinthetik a DNS kódoló és nem kódoló (pl. szabályozó) régióit, vagy intergénikus (gének közötti) nem-kódoló DNS szakaszokat. Szomatikus vs. csíravonal mutáció A testi sejtekben keletkezett mutáció nem öröklődik. Ennek oka az, hogy az ember (és az állatok) csíravonal sejtjei már a korai embriogenezisben elkülönülnek, tehát nem lesz soha testi sejt belőlük. A növényeknél nem ez a helyzet, a testi sejtekből képződő merisztémákból lesznek a differenciálódás során az ivarsejtek is. A testi sejtekben keletkezett mutáció rendszerint nem okoz problémát, mert legrosszabb esetben is csak a sejt pusztulását okozhatja. Néhány sejt elvesztése pedig egy következmények nélküli esemény a szervezetben. Az olyan gének mutációja azonban, ami rákot okozhat, rendkívül veszélyes lehet. A ráksejtek ugyanis metasztázis révén elterjedhetnek a testben, s halált okozhatnak. A csíravonal sejtjeiben történő mutáció átkerülhet a következő generációba is, s ilyenkor az utódok minden sejtje tartalmazza a mutációt. Ha a mutáció az embriogenezis során történik, akkor az utód szövetei mozaikosak lesznek, csak a mutációt szenvedett sejtek leszármazottjai lesznek mutánsok. A pontmutációnak egyetlen bázis cseréjét, kiesését, vagy beépülését nevezzük. Egy mutáció sorsa kétféle lehet: eltűnik a populációból, vagy elterjed, s bizonyos mértékű genetikai polimorfizmust (változékonyságot) okoz. A mutáns genotípus rögzülhet is a populációban, amennyiben az kiszorítja a többi allélvariánst. Az egyes emberek genomja viszonylag sok pontmutációban különbözik egymástól. Egy nukleotid polimorfizmusnak (SNP; single nucleotide polymorphism; kiejtve: sznip) nevezzük azt a genetikai változékonyságot, ami egyetlen bázisban tér el az egyes egyedek között, s az emberi populáció legalább 1%- ában jelen van. A SNP-ek kimutatásának technikáiról (mikrochip, PCR, stb.) a Molekuláris biológia technológiai arzenálja c. előadásban lesz szó. A SNP-ek jelentősége abban van, hogy egyes betegségek elvileg prognosztizálhatóak egy személy SNP mintázata alapján. Egy adott SNP variánsban előforduló bázis lehet közvetlen oki kapcsolatban a betegséggel (elrontja egy gén kódoló vagy szabályozó régióját; oki SNP), de a legtöbb esetben nincs ilyen oki kapcsolat, az adott bázis csupán jelzi a betegséggel kapcsolatos DNS variáns (allél) jelenlétét (kapcsolt SNP). Magyarázat: a meiózis során lejátszódó genetikai rekombináció a kis távolságokra lévő DNS szakaszokat sok generáción keresztül nem választja el egymástól. Tehát, ha egy nagyobb genomi régión kimutatjuk az adott bázisvariánst, akkor nagy eséllyel biztosak lehetünk abban, hogy a betegséggel kapcsolatos DNS variáns megtalálható a páciens DNS-ében. Komplikálja a helyzetet, hogy a genetikai hátterű betegségek túlnyomó többsége (kb. 98%-a) nem egy, hanem több gén kombinált hatásának eredménye. Továbbá, a SNP (és egyéb DNS polimorfizmusok) nem csak a betegségek detektálásban lesznek fontosak a jövőben, hanem a prevenciós (megelőzésen alapuló) és gyógyító orvoslásban is. Az ún. egyénre szabott gyógyászatban a SNP mintázat alapján még a gyógyszerszedés előtt megállapítható egy személy várható reakciója egy adott gyógyszerre. Ehhez persze előzetesen kísérleteket kell végezni a gyógyszerhatás és a SNP mintázatok közötti összefüggések megállapítására. Ezeket a kísérleteket nem feltétlenül élő személyeken kell végezni, hanem pl. őssejteken.
2 5. A DNS Mutáció Hibajavítás DIA 34 DIA 33 DIA 35 DIA 36 DIA 37 DIA 38 DIA 39 DIA 40 Mutáció a gén kódoló régiójában Ha a fehérje aminosav összetétele megváltozik, módosulhat vagy elromolhat a molekula funkciója de, hasonló kémiai tulajdonságú aminosavak cseréje esetén, ez nem feltétlenül következik be. Néma mutációk Azokat a pontmutációkat, amelyek egy gén kódoló régiójában történnek, de nem okoznak aminosav változást, néma = szinonim, vagy neutrális (semleges) mutációknak nevezzük. Például, ha a glutaminsavat (Glu) kódoló GAA triplet 3. pozíciójában az A kicserélődik G -re, a GAG bázishármas még mindig Glu-t fog kódolni. A néma mutációk a genetikai kód néma helyein keletkeznek. Másértelmű mutációk Azokat a pontmutációkat nevezzük másértelmű (= missense, nem szinonim) mutációknak, amely esetében egyetlen báziscsere aminosav változást okoz. Ha egy bázis egy hasonló kémiai tulajdonságú bázisra cserélődik le, az nem feltétlenül jár komoly következményekkel az adott fehérje térszerkezetére vagy funkciójára nézve. Más esetek azonban súlyos, akár halálos következményekkel is járhatnak a hordozó egyénre nézve. A példán a glutaminsavat kódoló GAA triplet 3. helyén lévő A bázisa C-re cserélődik, s az így keletkezett GAC bázishármas Glu helyett aszparaginsavat (Asp) fog meghatározni. A másértelmű mutációk által okozott betegségek tipikus példája a sarlósejtes vérszegénység. E betegségnél a hemoglobin molekula 6. aminosav pozíciójában egy pontmutáció következtében a glutaminsav valinra cserélődik. A betegség, homozigóta formában súlyos következményekkel jár; a vörösvértestek sarló alakúvá válnak, s eltömítik a hajszálereket. A mutáns gén gyakorisága rendkívül magas a maláriával sújtott területeken (főként Afrika), melynek oka az, hogy heterozigóta formában a mutáns forma nem okoz betegséget, viszont véd a malária ellen. Értelmetlen mutációk Azokat a pontmutációkat nevezzük értelmetlen (nonszensz) mutációknak, amelyek egy aminosavat kódoló tripletből stop kódot képeznek. Például a GAA (Glu-t kódol) G bázisa, ha T-vé alakul, akkor TAA stop kód keletkezik. A stop kodonnál (UAA) leáll a fehérjeszintézis, tehát az eredetitől rövidebb (csonkolt) fehérje fog képződni. Bizonyos esetekben, ha nem túl sok aminosav veszik el (a gén 3 vége felé történt a mutáció), a fehérje csökkent működéssel ugyan, de funkcióképes maradhat. Read-through mutációk esetén a stop kód (pl. TAA) átalakul aminosavat kódolóvá (GAA Glu-t kódolja), s emiatt a transzlációs apparátus nem áll le, hanem továbbfolytatódik az mrns eredetileg nem-kódoló szakaszainak a leolvasása aminosavakká. Az így keletkezett fehérje ezért hosszabb lesz, ami a funkciója szempontjából kedvezőtlen. Read-through mutáció keletkezhet a transzkripciós stop szignál fel-nem ismerése esetén (pl. egy mutáció báziscserét okoz). Ebben az esetben az RNS termék lesz hosszabb, a fehérje szerkezete azonban nem változik. Kereteltolódásos mutációk esetében egy vagy néhány nukleotid épül be (inszerció) vagy esik ki (deléció) egy gén fehérjét kódoló régiójából. Mivel a genetikai kód vesszőmentes, a mutáció helyétől 3 irányban a genetikai üzenet értelmetlenné válik, a leolvasó apparátus ugyanis másként fogja a tripleteket képezni, s ezért az eredetitől eltérő aminosavak, sőt stop kodonok is képződhetnek. Azokban az esetekben, amikor 3 (vagy annak többszöröse) nukleotid épül be vagy esik ki, a leolvasási keret nem változik, s így bizonyos esetekben a fehérje megtarthatja normális funkcióját. A gén szabályozó régióit érintő mutációk A gének leíródást különféle szabályozó elemek (promóterek, enhanszerek, ld. Genetikai Szabályozás c. előadást) irányítják, akár egy karmester a zenekart. Ha ilyen elemekben történik mutáció, akkor a gének kifejeződése (leírása) megváltozhat, pl. a mrns mennyisége növekszik, vagy csökken (akár meg is szűnhet), vagy a sejt-specifitása megváltozik. Kis deléciók (kiesések) és inszerciók (beékelődések) Kisebb DNS szakaszok kiesése vagy beépülése. A kódoló régióban rendszerint elrontja a gén leírását vagy leolvasását, ill. tönkreteszi a fehérje szerkezetét. A genomban egyes rövid elemek hajlamosak arra, hogy elszaporodjanak. Itt csak a mikroszatelliteket (1-6 bázisár hosszúságú ismétlődések), azon belül is az ún. DNS triplet mutációkat említjük (a témáról bővebben az Emberi genom c. előadásban). Bizonyos bázishármasok képesek számban növekedni (expanzió), ritkábban csökkenni (kontrakció). Több neurológiai betegséget is ismerünk, melyet a túlzott mértékű triplet expanzió okoz. Ilyen pl. a Huntington kór, melyet a
3 5. A DNS Mutáció Hibajavítás DIA 41 DIA 42 DIA 43 DIA 44 DIA 45 DIA 46 DIA 47 glutamin aminosavat (Q, Gln) kódoló tripletek (CAG) túlzott felszaporodása okoz a huntingtin nevű génben (35 Q még normális). A betegség izomkoordinációs zavarokkal (rángatózás) és dementiával (szellemi leépülés) jár. A triplet mutációk fontossága abban rejlik, hogy 10,000-szer gyakoribbak a normál mutációs rátánál, s nem feltétlenül rontják el a géneket, mivel nem okoznak kereteltolódást. Sokan úgy vélik, hogy szemben a pontmutációkal és egyéb kisebb mutációkkal, a triplet mutációk gyakran hasznosak lehetnek az evolúció során. Megjegyzések: a trinukleotid ismétlődések egy gén egy esetleg néhány pontján helyezkednek el, nem pedig szétszórtan. Tehát, pl. a CAG ripítek a fehérje egyetlen - egymást követő glutaminból álló - peptid szakaszt kódolnak, s a fehérje mindig ugyanazon pontján helyezkednek el. Kromoszómális mutációk nagyobb DNS szakaszok beépülését, kiesését vagy áthelyeződését (transzlokáció) foglalják magukba. A Kromoszómális betegségek előadás fogja részletesebben tárgyalni ezt a témakört. A poliploidia a teljes kromoszómaszám megsokszorozódása (poliploidia) nagy evolúciós ugrásoknál, ill. a növénynemesítés során fordul elő. Ez az esemény rendkívül ritkán következik be az evolúció (főként az állatok evolúciója) során. A növények nemesítése során viszont egy viszonylag gyakran alkalmazott technika a terméshozam növelésére: pl. a búza hexaploid (6n), a banán pedig triploid (3n) kromoszóma állományú. Az aneuploidia a kromoszóma számban történő változás, rendszerint egyetlen kromoszóma többletét vagy hiányát jelenti. Az ember egyetlen kromoszóma elvesztését (monoszómia) képes túlélni, ez az X kromoszóma (X0 kariotípussal jellemezhető Turner szindrómát eredményez). A kromoszóma többlet (triszómia egy plusz kromoszóma esetén) is rendszerint halálos, kivéve három testi kromoszómát: 21-es (Down szindróma), a 13-as (Patau szindróma) és a 18-as (Edwards szindróma) triszómia, és az ivari kromoszómákat: XXY (Klinefelter szindróma); XXX (szuper nő), XYY (szuper férfi). A mutációk okai A mutációk oka lehet belső (spontán mutáció) vagy külső (indukált mutáció). (1) A spontán mutációk leggyakoribb formái a DNS szintézise és a crossing over során fellépő genetikai hibák. A tautomer átváltozások által okozott mutációk is a DNS replikációhoz kapcsolódnak. (2) Az indukált mutációk forrása lehet fizikai vagy kémiai természetű. A spontán mutációk leggyakoribb formája (1) a DNS szintézise során fellépő hibás bázis beépítés (mismatch). Ilyen esetben a DNS polimeráz téveszt, de ezeknek a hibáknak a nagy részét a hibajavító mechanizmusok korrigálják. A téves bázisbeépítés tehát, a hibajavító mechanizmusok nem tökéletes működéséből ered. Sok kutató feltételezi, hogy hibajavítás hatékonyságát a természetes szelekció optimalizálja. Nem jó ugyanis, a 100%-os hatékonyság, mivel az megszüntetné az evolúció nyersanyagának (mutációk) produkcióját, tehát kvázi befagyasztaná az evolúciót. (2) Egy másik hibalehetőség a meiózis során történő crossing over (genetikai rekombináció), ahol a homológ DNS-ek nem megfelelően kapcsolódnak egymáshoz, s így hibásan megy végbe a DNS szakaszok kicserélődése. (3) Egy további belső eredetű hiba a bázisok tautomer formáiban keresendő. Például a T bázis keto és enol formában lehet jelen, de a keto forma jóval gyakoribb. Az enol-t azonban A helyett inkább G-vel képez párt. Ezért, ha a replikáció során, nagyon ritkán, bekövetkezik a keto enol átalakulás, az mutációt okozhat. Hasonló a probléma az A-val. A ritka imino tautomer A nem T-vel (mint a gyakori enol-t), hanem a G-vel vagy a C-vel képez párt. Indukált mutációk Fizikai tényezők. (1) az UV sugárzás pl. a timin dimerizációját okozza; (2) az ionizáló sugárzás pont-, inszerciós- és deléciós mutációkat is eredményezhet; (3) hő hatására pedig eltörhet a cukor/foszfát kötés. Indukált mutációk Kémiai tényezők. (1) A bázis analógok a bázisokhoz hasonló vegyületek. Az 5-brómuracil pl. a T-hez hasonló, s az A-val képez párt. A problémát az okozza, hogy az 5-brómuracil sokkal gyakrabban átalakul enol formává, s ekkor G-vel párosodik. Hasonló a helyzet a 2-aminopurinnal. Ez a vegyület adenin analóg, s T-val képez párt. A viszonylag gyakori imino tautomer formája viszont C-vel párosodik. (2) közvetlenül ható vegyi anyagok (a) Például az ún. interkaláló ágensek tartoznak ide. Az etidium bromidot a DNS megjelölésére használják (fluoreszcens fény hatására narancssárgán világít). Ez a molekula beépül a DNS kis árkába. (b) Ebbe a csoportba tartoznak még a deamináló (az amin csoportot távolítják el a G, a C és az A bázisról), ill. (c) az alkiláló ágensek, amelyek alkil csoportokat raknak a nukleotidokra. (3) Közvetetten ható vegyi anyagok Ezek a vegyületek olyan anyagok képződését segítik elő, amelyek mutagén hatásúak. Például több vegyület elősegíti a peroxid - egy mutagén szabadgyök - képződését.
4 5. A DNS Mutáció Hibajavítás DIA 48 DIA 49 DIA 50 A mutációk következményei (1) A funkcióvesztéssel (loss-of-function) járó mutáció megszünteti egy fehérje aktivitását. Az ilyen típusú mutációk rendszerit recesszívek, mert az ép allél kópia képes egyedül is elvégezni a fehérje funkcióját a sejtekben. Az ún. haplo-elégtelenség kivétel, ilyenkor egyetlen allél kópia nem elegendő a normális funkció elvégzéséhez. A Marfan szindrómát a fibrillin-1 gén egyik kópiájának mutációja okozza. A Marfan szindrómás betegek egyik jellemző tünete, a megnyúlt végtagok. Michael Phelpsről tételezik fel, hogy ebben a betegségben szenved. Egyre több génről derül ki, hogy haploelégtelenséget okoz, ha csupán egyetlen funkcióképes alléllal rendelkezik. (2) A funkció-nyerésessel (gain-of-function) járó mutációk rendszerint dominánsak, s a fehérje abnormális működését okozzák. A kódoló régióban történő funkciónyeréses mutáció hibás fehérjefunkciót eredményez, míg a szabályozó régió mutációja a génkifejeződést változtatja meg. Mutáció és evolúció A mutáció biztosítja az evolúció nyersanyagát a genetikai változatosság létrejöttében. De a géneket érintő mutációk többsége káros, ill. jó esetben semleges. Megjegyzés: A káros mutáció akkor érinti a populációt, ha öröklődik. Egy mutációnak tehát egy hármas szűrőn kell áthaladnia, hogy elterjedjen egy populációban, melyek a (1) hibajavító mechanizmusok kikerülése, (2) a negatív szelekció elkerülése (az érintett egyén túlél), (3) és az érintett egyén leszármazottainak sikeressége. Nem-véletlen mutációk Lamarc úgy vélte, hogy a szerzett jellegek öröklődnek. Modern kifejezéssel, a genetikai variáció irányított; tehát, elegendő egy tevékenységet sokszor ismételni, s az öröklődni fog (a szerzett tulajdonságok öröklődése: pl. ha sokat edzünk, a gyerekeink izmosak lesznek:). Ezzel szemben, Darwin alapvetően fontos tézise az volt, hogy - modern terminológiával élve - a genetikai változékonyság véletlenül alakul ki, tehát semmi köze sincs a jövendő hasznossághoz. A modern tudomány ma is ezt az elvet tekinti szentírásnak. Az utóbbi évek kutatásai azonban azt mutatják, hogy - legalábbis bizonyos esetekben - egyes mutációk irányítottan keletkeznek. Az irányított mutációk típusai. (1) Irányított globális mutáció: egyes baktériumok stressz hatására megnövelik a mutációs rátájukat, s így nagyobb valószínűséggel keletkezik olyan mutáns, amely ellenáll az adott környezeti stressznek. Ennél a mutáció típusnál tehát nem sérül a véletlenszerűség elve, mivel a bekövetkezett genetikai változások nem függenek attól, hogy mire van a szervezetnek szüksége. (2) Lokális hipermutációk: a Haemophylus influenzae nevű baktérium azon DNS régiója, amely a sejtfelszíni struktúráit kódoló géneket tartalmazza, rendkívül magas mutációs rátával rendelkezik (forró pont). Ennek funkciója nyilvánvaló: a gazda immunrendszerének kijátszása az antigének gyors változtatásával. Itt már a mutáció nem teljesen független a későbbi haszontól. (3) Indukált lokális mutációk: az E. coli baktérium aminosav éhezés esetén kijavítja a defektív aminosavak előállításához szükséges gént az azt kódoló génben való mutációs ráta növekedése útján. Nyilván, a próba-szerencse módszert használva, azaz, véletlen mutációkat generálva, melyek közül egy vagy néhány csupán a kívánt mutáció. (4) Indukált regionális mutációk: a mustár (Brassica nigra) hősokk hatására elveszti a rrns gének egy részét (sok kópiában jelenlevő gén kódolja ezeket a riboszóma alkotó RNS-eket). A jelnség oka nem ismert. Ezek a példák látszólag jelentéktelenek, mivel elszórtan fordulnak csupán elő. Azért fontosak mégis a fenti nem-véletlen típusú mutációk, mert ha ilyen folyamatok alacsonyabbrendű fajokban végbemehetnek, miért ne történhetnének az embernél. A magasabb rendűek mutációs folyamatait alig ismerjük. Lehetséges, hogy az új kísérletes adatok meglepetéssel fognak szolgálni.
5 5. A DNS Mutáció Hibajavítás DIA 51 HIBAJAVÍTÁS (REPAIR) A DNS szintézise során hibák lépnek fel, amelyeket ki kell javítani, különben a DNS funkcióképtelenné válna. A hibajavításnak 3 fő mechanizmusa létezik. (1) Korrektúra (proof-reading) Ez a mechanizmus a DNS szintézise közben zajlik, s maga a DNS polimeráz II (pol-ii) végzi. A DNS polimeráz ugyanis két, egymással versengő, funkcióval rendelkezik, melyek a polimeráz és az exonukleáz funkciók (ez utóbbi a szabad DNS végek levágása). Ha nincs hiba, akkor a pol-ii polimeráz aktivitása dominál, ha viszont hibás a bázisok párosítása, akkor az enzim érzékeli azt, s aktivizálódik az exonukleáz* funkciója, s levágja az új szál szabad végét a hibás bázissal. (2) Rossz párosítás javítás (mismatch repair) Ez a folyamat a DNS szintézisét követően zajlik, más enzimek részvételével. Rossz párosítás pl. az A-C pár (A-T helyett) esetén a javító enzimek (például a baktériumoknál a DNS polimeráz-i) kicserélik a hibás párt a megfelelőre. De hogyan tudják a javítóenzimek, hogy melyik bázis volt az eredeti DNS szálban, a hibás? A válasz az, hogy a DNS szál kémiailag módosul (a DNS metilálódik; egy CH 3 gyök kapcsolódik hozzá) a replikációt követően, míg az újonnan képződött szálak nem tartalmazzák ezeket a módosulásokat. Ezt a különbséget ismerik fel a javító enzimek. E javító rendszer hibája okozza pl. a vastagbél daganatok egyik formáját. (3) Kivágásos javítás A DNS sérülhet replikáció-mentes időszakokban is, például mutagének által. A kivágásos javító mechanizmus enzimjei (pl. DNS pol-i) ezeket a hibákat korrigálják. E rendszer nem megfelelő működése okozza a xeroderma pigmentosum nevű betegséget, melynek jellemzője, hogy a páciens bőrén ultraibolya sugárzás hatására könnyen bőrrák keletkezik. Megjegyzés: a mitokondriális DNS-nél nincs hibajavítás Exonukleázok: a DNS-t a végeiken emésztő enzimek Endonukleázok: a DNS belső nukleotidjait emésztő enzimek A kisbetűs részek az extra követelményekhez tartoznak!!!