Az extracelluláris kalcium koncentráció érzékelése egészséges és kóros állapotokban A CaSR gén mutációk vizsgálata hazai betegekben

Az extracelluláris kalcium koncentráció érzékelése egészséges és kóros állapotokban A CaSR gén mutációk vizsgálata hazai betegekben Doktori tézisek dr. Tőke Judit Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Programvezető: Prof. Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, MTA doktora Témavezető: Dr. Tóth Miklós, egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Mátyus László, egyetemi tanár, MTA Doktora Dr. Garami Miklós, egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Takács István, egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Kovács László, főorvos, Ph.D. Budapest 2009

I. BEVEZETÉS Az extra-, és intracellularis kalcium koncentrációjának stabilitása az élő szervezetek homeosztázisának fenntartásában kulcsszerepet tölt be. Régóta ismert tény, hogy az ionos kalcium az intracelluláris jelátviteli folyamatok fontos hírvivője. Az utóbbi 30 év intenzív klinikai-, és alapkutatásainak eredményei egyértelműen igazolták, hogy az extracelluláris kalciumion egyben elsődleges receptor ligand is. A sejtfelszíni G-fehérjéhez kapcsolt receptort kalcium érzékelő receptornak (CaSR) nevezték el. A receptor felfedezése utáni években egyértelműen bebizonyosodott, hogy a receptor génjén előforduló inaktiváló mutációk felelősek néhány korábban már leírt, öröklődő kórkép kialakításáért, amelyek károsodott kalcium érzékeléssel járnak. A heterozygota inaktivaló mutációk a tünetmentes familiaris hypokalciuriás hyperkalcémiát (FHH), a homozygota inaktiváló mutációk az életet veszélyeztető újszülöttkori súlyos hyperparathyreosist (NSHPT) okozzák. Az NSHPT patogenezise, kórlefolyása eltérő lehet a CaSR genotípusától függően. Amennyiben a mutáció csak az apai allélt érinti, az újszülöttkori súlyos kórkép átalakulhat élethosszig tartó, FHH-ra hasonlító, tünetmentes

hyperkalcémiával járó állapotba. Ezek a betegségek ritkán fordulnak elő, a gyakoriságukat illetően kevés, csak becslésen alapuló populációs adat áll rendelkezésre, de felismerésük és elkülönítésük az egyéb parathormon-dependens kalcium anyagcsere zavaroktól azonban elengedhetetlenül fontos a helyes terápia megválasztásához. A betegek kivizsgálásának lépéseit kevés nemzetközi ajánlás dolgozza fel. Vizsgálatom tárgyául a Semmelweis Egyetem II. sz Belgyógyászati Klinikáján igazolt, a CaSR működésének zavarával járó betegségek elemzését választottam. A betegségek genetikai hátteréről és a kórlefolyásról szerzett tapasztalatok összefoglalásával egy diagnosztikai algoritmust állítottunk fel a parathormon-dependens hyperkalcaemiák kivizsgálását illetően, amelynek széles körű használata elősegítheti ezeknek a nem ritkán tünetmentes kórképeknek a gyakoribb felismerését. II. CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálataimhoz a betegek a Semmelweis Egyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinikájának endokrinológiai centrumában 1997 és 2007 között diagnosztizált parathormon-dependens hyperkalcaemiás betegek köréből kerültek ki.

1. Munkám egyik célja volt, hogy összefoglaljam a hazai familaris hypokalciuriás hyperkalcémiás betegek klinikai jellemzőit. A klinikailag FHH-nak diagnosztizált betegekben elvégeztem a CaSR génmutáció analízisét. 2. Célul tűztem ki, hogy egy újszülöttkori hyperparathyreosisos beteg kórtörténetét, klinikai és laboratóriumi jellemzőit feldolgozzam. Célul tűztem ki továbbá az index beteg és családtagjai CaSR gén genotípusának pontos meghatározását molekuláris genetikai módszerekkel. 3. Munkámban vizsgálni kívántam egy szokatlan kórtörténetű, újszülöttkori hyperparathyreosisos betegben azonosított pontmutációk hatását, továbbá a mutáns receptor sejtfelszíni megjelenését HEK-293 sejtekben. 4. Munkámban célul tűztem ki, hogy egyetlen endokrinológiai centrum 10 éves beteganyagában meghatározzam a parathormon-dependens hyperkalcaemiával járó kórképek relatív gyakoriságát. Vizsgálni kívántam a betegek klinikai

és laboratóriumi eredményei között esetleg kimutatható különbségeket is. III. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Betegek A klinikai vizsgálatok alapján 1997 és 2007 között 8 betegben állapítottunk meg FHH-t. Munkám során egy szokatlan kórlefolyású súlyos újszülöttkori hyperparathyreosisos beteg klinikai adatait is feldolgoztam, a beteg és családtagjai vérmintáiból molekuláris biológiai vizsgálatokat végeztem. A vizsgálat idején 10 éves fiú beteg egészséges szülei második gyermekeként, szövődménymentes terhesség 41. gesztációs hetében, normális testsúllyal és Apgar értékekkel született 1995-ben. Az újszülöttben 2 napos korában általános hypotonia mellett respirációs distressz alakult ki, ami miatt intenzív osztályos ápolás vált szükségessé. Laboratóriumi vizsgálati eredményei enyhe hyperkalcaemia, hyperkalciuria és hypofoszfataemia mellett normális parathormon szintet, valamint igen magas szérum alkalikus foszfatáz értéket mutattak. Az újszülöttkori röntgen felvételek súlyos csontbetegségre engedtek következtetni. Konzervatív terápia mellett a beteg általános állapota fokozatosan javult, 30 napos

korában elhagyta a kórházat. A gyermek mentális és fizikai fejlődése zavartalan volt. 6 éves korában obesitás miatt kezdődött endokrinológiai kivizsgálás. A rutin laboratóriumi vizsgálatok eredményei szerint a szérum kalcium koncentráció továbbra is magas, a vizelet kalcium clearence-kreatinin clearence hányados (CCCR) értéke alacsony volt (0.073). Az ultrahang vizsgálatok nem mutattak eltérést a mellékpajzsmirigyek szerkezetében, vesekő vagy nephrocalcinosis sem igazolódott. Az inaktiváló CaSR génmutációk által okozott kórképek relatív gyakoriságát, valamint a betegek klinikai és laboratóriumi paramétereit, továbbá a vesekövesség és az osteoporosis gyakoriságát 141 parathormon-dependens hyperkalcaemiás index beteg körében állapítottam meg. Klinikai vizsgálatok A betegek klinikai vizsgálata során a CaSR-ral összefüggő kórképek klinikai diagnózisa standard módszerekkel elvégzett rutin laboratóriumi vizsgálatokon alapult. Meghatároztuk a betegek szérum össz-kalcium, -foszfát, és kreatinin koncentrációját. A kalcium ürítést 24 óra alatt gyűjtött vizeletből és ugyanazon a napon vett vérmintából

meghatározott CCCR értékek elemzésével vizsgáltuk A CCCR értékét a következő formula szerint számítottuk: (24 óra alatt gyűjtött vizelet kalcium koncentráció / szérum összes-kalcium koncentráció) / ( 24 óra alatt gyűjtött vizelet kreatinin koncentráció / plazma kreatinin koncentráció). Az ismételten 0.01-nál kisebb CCCR érték esetén az FHH diagnózis alapos gyanúját állítottuk fel. A csontanyagcsere jellemzésére a szérum alkalikus-foszfatáz (ALP), osteokalcin (OC) és béta-crosslaps (βcl) koncentrációját vizsgáltuk. A hyperkalcaemiás betegekben a mellékpajzsmirigy működését a parathormon mérésével vizsgáltuk. A betegek körében osteodensitometriás méréseket is végeztünk. A vizsgálat kettős energiájú röntgen abszorpciometriával, Hologic QDR 4500C készülékkel történt. A csont ásványianyag sűrűséget (BMD) valamint a BMD korra és nemre standardizált z-score értékeit elemeztük az ágyéki csigolyákon és a combnyakon. Molekuláris biológiai vizsgálatok A betegek CaSR gén mutáció analízisét a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Biológiai Laboratóriumában végeztem. A betegek perifériás vérmintáinak fehérvérsejteiből standard kit-ek segítségével

genomikus DNS-t izoláltunk. A CaSR gén mutáció analíziséhez a gén 6 kódoló exonját (exon2-7) polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltam. A tisztított PCR reakciótermékeket tovább amplifikáltam ABI Prism 310 DNS készüléken. A DNS-szekvenálás LiCOR IR2 készüléken történt. Az NSHPT-s betegben azonosított CaSR génmutációk allélikus elhelyezkedésének megállapítását valamint a HEK-293 sejtek vizsgálatát a Semmelweis Egyetem Élettani Intézetében, prof. Dr. Enyedi Péter laboratóriumában végeztem. Az index beteg perifériás vérmintájából nyert fehérvérsejtekből guanidium-isothiocyanát, fenol-kloroform módszerrel RNS-t izoláltam. MMLV reverz transzkriptáz és random hexamerek segítségével 1 µg RNS-ből reverz transzkripcióval cdns-t szintetizáltam. A cdns fragmentekből két egymást követő PCR reakcióval felsokszorosítottam a CaSR-t kódoló cdns-t. A tisztított PCR terméket pcr4-topo vektorba klónoztam TOPO TA Cloning Kit használatával, majd a klónokat szekvenáltam. Az NSHPT-s betegben azonosított két pontmutáció funkcionális jelentőségének tisztázása céljából HEK293-as

sejteket vad típusú és mutáns CaSR cdns-sel transzfektáltam. A vizsgálatokhoz a pcdna3-ba klónozott, rekonstruált CaSR cdns-t (rhupcar4.0; wcasr vektor) Dr. Edward M. Brown laboratóriumából kaptuk. Az rhupcar4.0 vektorban (wcasr) az R551K és az A986S pontmutációkat irányított mutagenezissel hoztam létre QuickChange kit és PfuTurbo DNS-polimeráz használatával. A pontmutációknak megfelelő bázis cseréket szekvenálással ellenőriztem. Az NSHPT-s betegben azonosított pontmutációkat hordozó CaSR sejtfelszíni expresszióját HEK293 sejtekben vizsgáltam. A CaSR megjelenítését a receptorhoz fúzionált vörös fluorescens fehérje (RFP) tette lehetővé. A rekonstruált vad típusú CaSR-RFP (wcasr-rfp) szekvenciát tartalmazó vektort irányított mutagenezissel tovább módosítottam, így R551K pontmutációt, A986S pontmutációt és R551K-A986S dupla mutációt tartalmazó CaSR-RFP vektorokat állítottam elő. A konstrukciókat szekvenálással ellenőriztem. Sejtkultúra, transzfekció A HEK293 sejtkultúra 10% fetalis marha szérumot Dulbecco s modified Eagle s médium oldatban volt fenntartva 37 C-os 5% CO 2 tartalmú termosztátban.

A transzfekció után 48 órával a HEK293 sejtekben expresszált CaSR-ok működését fluorimetriával vizsgáltam. CaSR konstrukciókkal transzfektált HEK-293 sejtek cytoplazma kalcium koncentrációjának mérése fluorimetriával A tesztoldatokban a CaCl 2 koncentrációja 1, 2, 3, 4, 5, 8, 16, 32 mm volt. Első lépésben a HEK293 sejteket fura-pe3 AM fluoreszcens, intracellularis Ca 2+ indikátor festékkel 2 óráig töltöttem 37 C-on. A CaSR vad és mutáns típusai által kiváltott intracellularis kalcium koncentráció változásának a követésére a festék 340 nm és 380 nm-es gerjesztés mellett mért fluoreszcens intenzitásának arányát (F340/F380) használtam. A fluorimetriás méréseket Xenon ívlámpát tartalmazó fordított mikroszkópon CCD kamera használatával 37 C-os környezetben végeztem. A CCD kamera által rögzített képeket Imagemaster software programmal értékeltem. A fedőlemezeket 0.5 mm-tól 32 mm-ig fokozatosan növekvő, egymás után, kimosási periódus nélkül következő, CaCl 2 koncentrációjú tesztoldatokkal perfundáltam. Az F340/F380 hányadosok adott tesztoldathoz (CaCl 2 koncentrációhoz) tartozó értékeiből számtani átlagértéket származtattam.

A CaSR sejtfelszíni expressziójának vizsgálata konfokális mikroszkóppal Az NSHPT-s betegben azonosított két pontmutációval rendelkező CaSR sejtfelszíni expresszióját HEK293 sejteken Zeiss LSM 510 konfokális mikroszkóppal, 63X objektívvel vizsgáltam. A sejtekbe a wcasr-rfp és dmcasr-rfp konstrukciókat átmeneti transzfekciós technikával juttattam. Statisztikai módszerek A fluorimetriás mérések eredményeit Origin V6 szoftver segítségével elemeztem. Azonos vad típusú és/vagy mutáns CaSR-t expresszáló HEK293 sejtek F340/F380 átlagértékeiből átlagot számítottam, amit az átlag standard hibájával (SEM) együtt az egyes CaCl 2 koncentrációk függvényében ábrázoltam. Az átlagértékek pontjaira szigmoidalis illesztéssel görbét szerkesztettem. A csoportokon belül kiszámoltam az EC 50 értékek átlagát és az átlag standard hibáját is. A különböző csoportok EC 50 értékeit egyutas ANOVA és Tukeyféle post hoc analízissel hasonlítottam össze SPSS v15.0 szoftver csomag használatával.

IV. EREDMÉNYEK 1. 8 esetben diagnosztizáltunk FHH-t. A 8 betegben, valamint 2 beteg 1-1 családtagjában tünetmentes hyperkalcaemiát (szérum teljes kalcium: 2.84±0.26 mmol/l; átlag±sd; normálérték: 2.25-2.61 mmol/l ) és alacsony CCCR értéket találtunk (CCCR: 0.006±0.004). A szérum átlagos PTH koncentrációja a referencia tartomány felső határán volt (64.8±32.8 pg/ml; referencia érték: 11-64 pg/ml). A z- score-ban (átlag ± SD) kifejezett csontsűrűség minden régióban normális volt. A csontmarkerek szérum koncentrációi szintén normálisak voltak A genetikai vizsgálatokkal, a nemzetközi adatokkal megegyezően, a betegek 1/5-ében, azaz 2 betegben igazoltam CaSR gén mutációt. Ezek a nemzetközi irodalmi adatok alapján FHHt okoznak (P55L és C582Y). Ezeket a mutációkat a családok genetikai szűrése során az egyik esetben az index beteg édesapjában (P55L), a másik esetben az édesanyában (C582Y) is kimutattuk. További 2 betegben a CaSR gén ismert polimorfizmusait találtuk (R990G, Q1011E), 4 betegben a CaSR gén mutációanalízise nem mutatott ki eltérést.

2. Egy NSHPT-s beteg kórtörténetének feldolgozásával, továbbá a beteg klinikai paramétereinek elemzésével egyértelműen igazoltam, hogy az újszülöttkorban fennállt, súlyos tüneteket okozó hyperparathyreosis spontán alakult át tünetmentes hyperkalcaemiával járó állapotba. A beteg fehérvérsejtjeiből izolált DNS mintát felhasználva a CaSR gén 551. kodonján heterozygota pontmutáció jelenlétét igazoltam (AGG AAG; Accession no. Hm040041), ami arginin lizin cserét eredményez (R551K). Ez a pontmutáció a beteg szüleiben és testvérében nem volt jelen. Ezen kívül az A986S ismert polimorfizmust igazoltam heterozygota formában a 7-es exonon. Ugyanezt a polimorfizmust a beteg apjában is azonosítottam, szintén heterozygota formában, míg a beteg édesanyjában az R990G polimorfizmust találtam, szintén heterozygota formában. A beteg nővérében nem találtam genetikai eltérést. A beteg CaSR génjének allélszekvenciáit is vizsgáltam és kimutattam, hogy az R551K mutáció és az A986S polimorfizmus az apai allélon helyezkedik el. Az anyai allél a normális CaSR szekvenciát tartalmazta. Ez az első, de novo heterozygota CaSR génmutációval járó publikált NSHPT eset, ahol mellékpajzsmirigy műtét nem történt.

3. A vad típusú CaSR-t expresszáló sejteknek az extracellularis kalciumra vonatkozó EC 50 értéke 3.38 ± 0.62 mmol/l (n=13) volt. Az R551K mutációt tartalmazó CaSR EC 50 értéke ezzel szemben szignifikánsan magasabb volt (6.10 ± 0.83 mmol/l; n=13, p = 0.038), ezzel megállapítottam, hogy az új R551K mutáció inaktiváló hatású a CaSR működésére, ennek következtében a mutáns receptorok kalciumérzékenysége csökken.. Az A986S polimorfizmus jelenléte nem befolyásolta az R551K mutáció hatását, mivel mindkét pontmutációt tartalmazó sejtek extracellularis kalciumra vonatkozó EC 50 értéke 6.64 ± 1.01 mmol/ volt (n=11). A vad típusú és a dupla mutáns (R551K és A986S) CaSR-okat koexpresszáló HEK-293 sejtek extracellularis kalciumra vonatkozó EC 50 értéke hasonló volt a vad típusú CaSR EC 50 értékéhez (EC 50 = 3.02 ± 0.25 mmol/l; n=14). Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy a modellkísérletben alkalmazott sejtek igen nagy számban expresszálták a receptorokat. Konfokális mikroszkóppal készült felvételekkel igazoltam, hogy a vad típusú CaSR-hoz hasonlóan a betegben azonosított két pontmutációt (R551K és A986S) tartalmazó receptor is döntően a sejtmembránban lokalizálódik.

4. A 141 vizsgált parathormon-dependens hyperkalcaemiás betegből 123 (87.2%) betegnek sporadikus primer hyperparathyreosisa (PHPT), 15 (10.6%) betegnek familiaris PHPT-a volt: 11 betegben MEN1 szindrómát, 2 betegben MEN2A szindrómát, 1-1 betegben familiaris izolált hyperparathyreosist és hyperparathyreosisállkapocstumor szindrómát igazoltunk. 3 (2.2%) betegnél mutattunk ki CaSR gén mutációt, közülük 2-nél FHH-t, 1- nél NHPT-t diagnosztizáltunk. A kórképek relatív gyakoriságára vonatkozó eredményeim nagyságrendileg megegyeznek az irodalmi adatokkal, illetve a közvetett becslésekkel. 30 éves kor alatt csak familiaris PHPT vagy hibás CaSR működéshez köthető megbetegedés fordult elő. A szérum parathormon koncentráció a sporadikus és a familiaris PHPT-s betegekben egyaránt emelkedett volt (a sporadikus esetekben 137; 69-1301 pg/ml, míg a familiaris esetekben 174.9; 83.8-414.0 pg/ml (median; min-max)). A CaSR gén mutációval rendelkező betegeknél azonban a szérum PTH koncentráció normális volt (43.5; 34.1-56 pg/ml). A PHPT szövődményei közül a sporadikus esetekhez hasonlóan alakult a vesekövesség és az osteoporosis gyakorisága a familiaris PHPT-s betegekben. Eredményeink is megerősítik, hogy a parathormon-

dependens hypercalcaemiás állapotok diagnosztikus algoritmusába beillesztett genetikai vizsgálatok jelentős mértékben elősegítik a hypercalcaemiás kórképek elkülönítő diagnosztikáját, nemritkán döntő módon hozzájárulva a végső diagnózis és helyes terápia kialakításához.

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 1. Toke J, Czirjak G, Patocs A, Enyedi B, Gergics P, Csakvary V, Enyedi P, Toth M: Neonatal severe hyperparathyroidism associated with a novel de novo heterozygous R551K inactivating mutation and a heterozygous A986S polymorphism of the calcium-sensing receptor gene. Clinical Endocrinology 67:385-392, 2007 IF: 3.370 2. Toke J, Patocs A, Balogh K, Gergics P, Stenczer B, Racz K, Toth M: Parathyroid hormone-dependent hypercalcemia. Wiener Klinische Wochenschrift 121:236-245, 2009 IF: 0.885 3. Tóth M, Tőke J, Horányi J, Stenczer B, Patócs A, Balogh K, Jakab Zs, Szücs N, Gergics P, Varga I, Rácz K, Tulassay Zs: A sporadikus és familiáris primer hyperparathyreosis klinikai és laboratóriumi jellemzői. Magyar Belorvosi Archivum 60:154-159, 2007 4. Tőke J, Tóth M, Patócs A, Bertalan R, Gergics P, Stenczer B, Speer G, Lakatos P, Rácz K, Tulassay Zs: A kalcium-szenzor gén mutációvizsgálatának hazai tapasztalatai. Magyar Belorvosi Archívum 60: 451 454, 2007 5. Tőke J, Patócs A, Gergics P, Bertalan R, Tóth M, Rácz K, Tulassay Zs: Az extracelluláris kalcium koncentráció érzékelése egészséges és kóros állapotokban. Orvosi Hetilap 150: 781-790, 2009

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 1. Tóth M, Tőke J, Kiss E, Bernád I, Miheller P, Szücs N, Rácz K: Acromegalia McCune-Albright szindrómában. Orvosi Hetilap 143:1070-1073, 2002 2. Balogh K, Hunyady L, Patócs A, Valkusz Zs, Bertalan R, Gergics P, Majnik J, Tőke J, Tóth M, Szücs N, Gláz E, Fűtő L, Horányi J, Rácz K, Tulassay Zs: Az 1-es típusú multiplex endocrin neoplasia klinikai tünetei, diagnózisa és kezelése. A genetikai vizsgálatok hazai tapasztalatai. Orvosi Hetilap 146:2191-2197, 2005 3. Bertalan R, Patócs A, Balogh K, Tőke J, Boyle B, Tóth M, Kiss R, Varga I, Gláz E, Rácz K, Tulassay Zs: A phaeochromocytoma örökletes formáinak klinikai és genetikai szűrése. Magyar Belorvosi Archivum 59:103-108, 2006 4. Tóth M, Tőke J, Fütő L, Varga I, Kiss R, Pusztai P, Szücs N, Adler I, Karlinger K, Horányi J, Czirják S, Pásztor E, Gláz E, Rácz K, Tulassay Zs: A Cushing-szindróma kezelésének eredményei 115 beteg adatainak retrospektív elemzése alapján. Magyar Belorvosi Archivum 59:131-138, 2006 5. Majnik J, Patócs A, Balogh K, Luczay A, Török D, Szabó V, Borgulya G, Gergics P, Szappanos Á, Bertalan R, Belema B, Tőke J, Sereg M, Nagy ZZ, Sólyom J, Tóth M, Gláz E, Rácz K, Németh J, Fekete Gy, Tulassay Z: Glükokortikoidreceptor gén szekvenciavariánsai és jelentőségük a glükokortikoidok iránti érzékenység meghatározásában. Orvosi Hetilap, 147:2107-2115, 2006 6. Halasz Z, Toke J, Patocs A, Bertalan R, Tombol Z, Sallai A, Hosszu E, Muzsnai A, Kovacs L, Solyom L, Fekete G, Racz K: High Prevalence of PROP1 Gene Mutations in Hungarian

Patients with Childhood-Onset Combined Anterior Pituitary Hormone Deficiency. Endocrine 30:255-260, 2006 IF:1.805 7. Tóth M, Vajda Zs, Görömbey Z, Molnár F, Major L, Tőke J, Szabolcs I, Szücs N, Kovács L, Kiss R, Czirják S, Fütő L, Gláz E, Góth M, Rácz K: Sinus petrosus inferior katéterezés értékelése az adrenokortikotrop hormon dependens Cushingszindróma elkülönítő diagnosztikájában Orvosi Hetilap 148:843-847, 2007 8. Tőke J, Tóth M, Tulassay Zs: A csontanyagcsere jellegzetességei a cukorbetegség különböző formáiban. Magyar Belorvosi Archivum 60:437-442, 2007 9. Pusztai P, Toke J, Somogyi A, Ruzicska E, Sarman B, Racz K, Tulassay Z: Plasma ghrelin response to an oral glucose load in growth hormone-deficient adults treated with growth hormone. Wiener Kliniche Wochenschrift 119:99-103, 2007 IF: 0.885 10. Halasz Z, Bertalan R, Toke J, Patocs A, Toth M, Glaz E, Fekete G, Racz K: Laterality disturbance and hypopituitarism. A case report of co-existing situs inversus totalis and combined pituitary hormone deficiency. Journal of Endocrinological Investigation 31:74-78, 2008 IF: 2.021 11. Fütő L, Toke J, Patócs A, Szappanos Á, Varga I, Gláz E, Tulassay Z, Rácz K, Tóth M: Skeletal differences in bone mineral area and content before and after cure of endogenous Cushing s syndrome. Osteoporosis International 19:941-949, 2008 IF: 3.893 12. Pusztai P, Sarman B, Ruzicska E, Toke J, Racz K, Somogyi A, Tulassay Zs: Ghrelin: a new peptide regulating the

neurohormonal system, energy homeostasis and glucose metabolism. Diabetes Metabolism Research and Reviews 24:343-352, 2008 IF: 3.087 13. Bertalan R, Patocs A, Vasarhelyi B, Treszl A, Varga I, Szabo E, Tamas J, Toke J, Boyle B, Nobilis A, Rigo J Jr, Racz K: Association between birth weight in preterm neonates and the BclI polymorphism of the glucocorticoid receptor gene. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 111:91-94, 2008 IF: 2.799 14. Sereg M, Szappanos A, Toke J, Karlinger K, Feldman K, Kaszper E, Varga I, Glaz E, Racz K, Toth M: Atherosclerotic risk factors and complications in patients with non-functioning adrenal adenomas treated with or without adrenalectomy. A long-term follow-up study. European Journal of Endocrinology 160:647-655, 2009 IF: 3.239 15. Szappanos A, Patócs A, Tőke J, Boyle B, Sereg M, Majnik J, Borgulya G, Varga I, Likó I, Rácz K, Tóth M: BclI polymorphism of the glucocorticoid receptor gene is associated with decreased bone mineral density in patients with endogenous hypercortisolism. Clin Endocrinol (Oxf). 2009 Jan 22. [Epub ahead of print] DOI: 10.1111/j.1365-2265.2009.03528 IF: 3.373