1 Bevezetés A bioanalitikát forradalmasították a biológiai rendszerekből ismert rendkívül szelektív kölcsönhatások, mint például antitest-antigén, enzim-szubsztrát, és komplementer nukleinsavak hibridizációjának analitikai célú alkalmazása. Az analitikai eljárás során az egyik reakciópartner a meghatározandó komponens, amelynek komplementerét általában szilárd hordozó felületre rögzítik és az analitikai eszköz/rendszer részét képezi. A rendkívül szelektív, esetenként specifikus, biomolekuláris kölcsönhatások alkalmazása vezetett a bioszenzorok, illetve a biochip technológia és a nagy áteresztő képességű bioanalizátorok kifejlesztéséhez. Az értekezésem címében is szereplő receptor szó alatt, tágabb értelemben, azt a felismerésért felelős molekuláris struktúrát értem, ami affinitás jellegű, nem kovalens kölcsönhatásokon keresztül biztosítja a meghatározni kívánt molekula felismerését, megkötését. A biológiai eredetű receptoroknak minden előnyük mellett jelentős hátrányaik is vannak. Így alkalmazásuk sok esetben csak a természetes közegüknek megfelelő körülményekre korlátozódik. Emellett sok esetben a költséghatékony, reprodukálható és nagy mennyiségben történő előállításuk sem megoldott. További problémát jelent a bioreceptorok stabilitása különböző kémiai és hőmérséklet viszonyok között. Ennek megfelelően jelentős előrelépést jelenthet a tetszőleges fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkező szintetikus receptorok kifejlesztése. Doktori munkám célkitűzése ilyen, kifejezetten analitikai feladatokra tervezett robusztus szintetikus receptorok fejlesztése és alkalmazása volt. Két alapvetően különböző szintetikus receptor fejlesztésével és analitikai alkalmazásával foglalkoztam: DNS aptamerekkel és molekuláris lenyomatú polimerekkel. Az aptamerek 40-80 bázisból álló oligonukleotid molekulák, melyek szelektíven képesek kötődni egy adott célmolekulához. Bár nukleinsav fehérje kölcsönhatások a természetben is ismertek, az aptamerek bázissorrendjének megállapítása és előállításuk tisztán szintetikus úton, in-vitro eljárással történik. Ennek megfelelően alkalmazási körük is kiterjedtebb lehet a természetes eredetű antitestekhez képest, hiszen az aptamerek akár kismolekulákra, toxikus anyagokra is előállíthatók és alkalmazásuk során nem kell fiziológiás körülményeket biztosítani. Az aptamerek szelekcióját lehetővé tevő SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) eljárás 1990-es kifejlesztése óta 1,2 rendkívül nagyszámú célmolekulára szelektáltak aptamereket 3, azonban ezek legnagyobb része nem kifejezetten analitikai, inkább molekuláris biológiai, vagy éppen terápiás célra, biológusok által fejlesztett aptamer. Az irodalomban kimondottan 1 Tuerk C, Gold L. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment - RNA Ligands to Bacteriophage-T4 DNA-Polymerase. Science. 1990;249(4968):505-10. 2 Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990;346(6287):818-22. 3 Lee JF, Hesselberth JR, Meyers LA, Ellington AD. Aptamer Database. Nucleic Acids Research. 2004;32(suppl 1):D95-D100. 1
kevés a szelekciótól az analitikai alkalmazásig végigvezetett, következetes munka található. Ezért célom originális aptamer szekvenciák felhasználásával egy olyan felületi plazmon rezonanciás szenzorchip fejlesztése volt, mellyel specifikusan detektálhatók vírusfehérjék. Modellként egy patogén növényi vírust, az alma törzsgöndörödés vírust (Apple Stem Pitting Virus ASPV) választottam, amelynek gyakorlati jelentősége is van. Munkám másik iránya olyan molekuláris lenyomatot tartalmazó polimerek fejlesztése volt, melyek alkalmasak fehérjék meghatározására és integrálhatók felületi plazmon rezonanciás (Surface Plasmon Resonance -SPR) szenzorchipre. A felületi lenyomatú polimerek (Molecularly Imprinted Polymer MIP) előállítása megfelelő funkcionális monomer egységekből, polimerizációval történik a célmolekula jelenlétében. A célmolekula eltávolítása után a polimerben visszamarad a célmolekula negatív lenyomata, ahova a célmolekula képes visszakötődni. Ez a módszer, amely kimondottan sikeresnek bizonyult kis molekulatömegű komponensekre szelektív polimerek szintézise esetén, a makromolekuláknál nem alkalmazható, ugyanis ezek mozgása gátolt a klasszikus molekuláris lenyomatot tartalmazó tömbpolimerekben. 4,5 Így a polimerizáció után a makromolekulák eltávolítása a polimerből nem lehetséges. A probléma megoldásához felületi lenyomatú polimerek előállítására és alkalmazására dolgoztam ki módszert. Ennek segítségével a fehérje felismerésére alkalmas felületi lenyomatú polimert közvetlenül a felületi plazmon rezonanciás (SPR) szenzorchipen állítottam elő. A munka sarkalatos pontja volt a receptorok és a fehérjék közötti kölcsönhatás jellemzése, amelyhez az esetek többségében a kölcsönhatások kinetikájának valós idejű, jelölés nélküli nyomonkövetését lehetővé tevő felületi plazmon rezonanciát alkalmaztam. Az aptamer-fehérje kölcsönhatások mérésére kidolgoztam egy nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens módszert (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay - ALPHA), ami lehetővé teszi a komplex mátrixokban történő mérést is. Ez jelentősen megkönnyítheti a későbbiekben az aptamer szelekció során a megfelelő analitikai tulajdonságokkal rendelkező aptamer kiválasztását. 2 Kísérleti módszerek Aptamer szelekció A növényi vírus fehérje specifikus aptamereket módosított SELEX eljárással szelektáltuk egy olyan DNS könyvtárból kiindulva, ami két darab 18 bázis hosszú primer kötő szakaszból és 40 bázis hosszú, véletlen sorrendű szakaszból álló 4 Glad M, Norrlöw O, Sellergren B, et al. Use of silane monomers for molecular imprinting and enzyme entrapment in polysiloxane-coated porous silica. Journal of Chromatography A. 1985;347(0):11-23. 5 Kryscio DR, Peppas NA. Critical review and perspective of macromolecularly imprinted polymers. Acta Biomaterialia. 2012;8(2):461-73. 2
oligonukleotidokat tartalmazott. A szelekcióhoz bakteriális expresszióval előállított 6 His módosított, Ni 2+ -His kölcsönhatáson keresztül szilárd hordozóra immobilizált vírus kapszidfehérjéket (MT32 és PSA-H) használtunk. A 15 körből álló SELEX eljárás során körönként csökkentettük a fehérje mennyiségét, és a 3., 6., és 9. ciklus után kontraszelekciós lépéseket iktattunk be. A szelekció után a PCR terméket vektorba klónoztuk és E. Coli sejtekbe transzformáltuk, majd a felnőtt telepekből kolónia PCR-t végeztünk. A PCR terméket tisztítását követően megszekvenáltattuk. Aptamarrel módosított SPR szenzor előállítása Az aptamereket tiol csoporton keresztül immobilizáltuk a felületi plazmon rezonanciás szenzorchip felületéhez. Ennek érdekében a vírus fehérjékre szelektált aptamereket a 3 végükön TTTT-(CH 2 ) 6 -SH módosítással szintetizáltattuk meg. A képalkotó felületi plazmon rezonanciás (ispr) mérésekhez a szenzorchip felületét mikrocseppentő robot (Calligrapher Microarrayer, Bio-Rad, Hercules, CA) alkalmazásával mintáztam a tiol módosított oligonukleotidokkal. Amennyiben nem volt szükség a szenzorchipek mintázására, az ispr-t egy csatornás rendszerként alkalmaztam és a szenzorchipet az SPR átfolyó cellájában módosítottam. Az aptamerek immobilizációs körülményeit ispr mérések alapján optimalizáltam. A különböző hosszúságú oligonukleotidok felületi sűrűségét az immobilizált DNS szálak negatív töltését kompenzáló Ru 3+ mennyiségének mérésével, voltammetriásan határoztam meg. Felületi lenyomatú polimer alapú SPR szenzor előállítása A protein felületi lenyomatú PEDOT/PSS mikromintázatokat planáris, módosítatlan arany SPR szenzorchipeken hoztuk létre. Az arany bevonatú üveg hordozón először fotolitográfiás technika alkalmazásával mikrobarázdákat hoztunk létre fotolakkból, majd a felületre polikarbonát (PC) áldozati anyagot vittünk fel a fotolakk barázdák közé. A fotolakk eltávolítását követően a visszamaradt PC mikrobarázdákra adszorbeáltattuk a célfehérjét, majd PEDOT/PSS vezető polimert választottunk le a felületre elektrokémiailag. A PC eltávolítása után a felületen fehérje lenyomatot tartalmazó PEDOT/PSS mikrobarázdák maradnak vissza. A lenyomatképzéshez avidin (Av, 66 kda, pi = 10,5) fehérjét használtunk és ExtrAvidin (EA, pi = 6,5), streptavidin (ST, 60 kda, pi = 5,5), NeutrAvidin (NA, 60 kda, pi = 6,3), lizozim (Lys, 14,3 kda, pi = 11,35) és bovin szérum albumin (BSA, 66,4 kda, pi = 4,7) fehérjékkel vizsgáltam a felületi lenyomatú polimer szelektivitását. Fehérje detektálás felületi plazmon rezonanciával A szintetikus receptorok és a fehérjék közötti kölcsönhatás mérésére képalkotó felületi plazmon rezonanciát (ispr) alkalmaztam. Felületi plazmon rezonanciával (SPR) egy vékony arany réteggel bevont üveglemez (szenzorchip) felületén végbemenő törésmutató változás mérhető nagy érzékenységgel, ami adott esetben arányos a szenzor felületén immobilizált receptorokhoz kötődő molekulák tömegével. Így ez a módszer alkalmas a szenzorchip felületére immobilizált receptorok és a szenzorchip felületére oldatban juttatott molekulák közötti kölcsönhatás valós időben, jelölésmentesen történő detektálására. 3
Fehérje-aptamer kölcsönhatás jellemzése ALPHA-val Az ALPHAScreen néven elterjedt nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens méréstechnika biológiai kölcsönhatások mérésére alkalmas, rendkívül érzékeny módszer. A méréstechnika egy polisztirol donor- és akceptor mikrogyöngy párból áll, melyek a felületükre immobilizált biomolekulák kölcsönhatása következtében kerülnek egymáshoz közel. Nagy intenzitású lézerfénnyel megvilágítva a donor gyöngyöt, a felületén található fényérzékenyítő származék hatására a környezeti oxigén molekulákból gerjesztett állapotú, szingulett oxigén molekulák jönnek létre. A szingulett oxigén molekulák reagálnak a térközelben található akceptor gyöngyben lévő fluoroforokkal, melynek hatására kemilumineszcencia lép fel. 3 Eredmények Aptamer alapú SPR szenzorchipek fejlesztése növényi vírusfehérjék kimutatásához Az SPR bioszenzorok esetében a szelektív molekuláris felismerést biztosító komponenst immobilizálni kell a szenzorchip felületére. Az aptamerek a felületi borítottság és a szenzorchip alaposabb optimalizálását igénylik, mint az antitestek, mivel nagymértékű konformációs flexibilitásuknak köszönhetően adaptív felismerési mechanizmussal kötődnek a ligandumaikhoz 6. Munkám során tiol módosítással ellátott aptamerek közvetlen immobilizációját vizsgáltam arany szenzorchipeken. Vizsgáltam az oligonukleotid hosszának hatását a felületi borítottságra, valamint a felületen található egyéb tiolok és a primer felismerő (flank) régiók hatását a specifikus és nem-specifkus adszorpcióra az SPR szenzor felületén. A kötési affinitás és bekötődési kinetika mérésénél döntő, hogy a kinetika kizárólag a két reagens kölcsönhatását tartalmazza, tehát elhanyagolhatónak kell lennie a nem specifikus felületi adszorpciónak. Mivel a korábbi tanulmányok rámutattak, hogy a hosszabb etilénglikol molekulák jobban ellenállnak a proteinek nem-specifikus adszorpciójának, vizsgáltam kereskedelmi forgalomban elérhető tiol terminális csoportot tartalmazó polietilénglikol (5 és 20 kda) és rövidebb oligoetilénglikol (tetra- és hexaetilénglikol) kitöltő molekulák alkalmazhatóságát növényi mátrixok esetén. Az etilénglikol származékok valóban nagyon alacsony nem-specifikus adszorpciót mutattak többféle növényi kivonat esetében is, azonban a kevert aptamer/polietilénglikol monorétegek esetében a specifikus kötődés is rendkívül alacsonynak bizonyult (1. ábra). 6 Hermann T, Patel DJ. Biochemistry - Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 2000;287(5454):820-5. 4
1. ábra Az etilénglikol molekulák hosszának hatása az aptamer molekula specifikus felismerésére. (a) referencia DNS szál (HS-T 44 ), (b) specifikus felismerést biztosító HS- MT32 aptamer. Az MT32 fehérje koncentrációja 500 nm. A kevert PSA-H aptamer-sh/teg-sh monorétegek kiváló specifikus felismerést mutattak PSA-H fehérje esetén is (2. ábra). A monoréteg nyilvánvalóan nem tartalmazhat az aptamer szekvencia immobilizálásához használt távtartónál hosszabb kitöltő molekulákat, mivel azok már sztérikusan gátolják a célmolekula bekötődését. Az aptamer szálak 3 végére tervezett TTTT-(CH 2 ) 6 -SH távtartónak köszönhetően a vírus kapszidfehérje felismeréséért felelős rész kiemelkedik a TEG-SH felületből. 2. ábra Tipikus szenzorgram, ami a tiol módosítással ellátott aptamer (1 M PSA-H aptamer 1 M KH 2 PO 4 oldatban) és a TEG-SH (0,1 mm, PBS-T oldatban) kétlépéses immobilizációját, valamint a növekvő koncentrációjú PSA-H fehérje bekötődését mutatja a regenerálási lépésekkel Elvégeztem a TEG-SH/tiol módosított aptamer kevert monoréteg optimálását. Az optimális specifikus kötőképesség elérése érdekében az aptamer/teg monoréteg optimalizálását három alapvető immobilizációs paraméter változtatásával végeztem: a két tiol koncentrációját és a pufferoldat ionerősségét változtattam. Az eredmények azt mutatták, hogy az optimális aptamer-ligandum kölcsönhatás, azaz a legalacsonyabb nem-specifikus adszorpció és a legmagasabb specifikus válasz érdekében legalább 5 M aptamer koncentráció szükséges, míg a TEG-SH koncentrációját a legnagyobb vizsgált koncentráción, azaz 100 M-on kell tartani. Az ionerősség hatása nem volt szignifikáns ebben a viszonylag magas koncentráció tartományban. (3. ábra) 5
3. ábra A specifikus aptamer ASPV fertőzött növényi kivonat (10x hígítás) kölcsönhatás (A) és az 1% BSA nem-specifikus adszorpció (B) két dimenziós ábrázolása a tiol módosított aptamer és a TEG-SH koncentrációjának függvényében. Az egyes szintvonalak a két tiol keverési arányának megfeleltethető rezonancia szög eltolódások Az aptamer felületi borítottságának elektrokémiai meghatározása során 1,9 10 12 molekula/cm 2 -t kaptam PSA-H aptamer (45mer) esetében, ami 100 nm 2 területen 2 darab molekulának felel meg. Ezt kedvezőnek tekinthetjük, ha a felülethez kötődő proteinek között kis sztérikus gátlást várunk. Vizsgáltam a 81 bázisból álló, a primer régiókat is tartalmazó (PSA-H Flank), valamint rövidebb, 20mer (trombin) aptamer szálakat is. Az eredmények azt mutatták, hogy a hosszabb aptamerek felületi borítottsága csak 25%-kal kisebb (1,3 10 12 molekula/cm 2 ), míg a rövidebb, 20mer aptamerek esetén több mint 3-szor nagyobb a felületi borítottság (6,2 10 12 molekula/cm 2 ), mint a 45mer aptamer esetében. A munkám során használt aptamerek (45mer és 81mer) esetén kapott közel azonos felületi borítottság miatt nem volt szükség külön optimálásra. Az SPR jel koncentráció függését először ideális oldatban, tisztított MT32 és PSA-H vírus fehérjékkel vizsgáltam (4. ábra). 4. ábra MT32 (A) és PSA-H (B) proteinek SPR kalibrációs görbéi MT32 (a), PSA-H (b) és PSA-H-Flank (c) aptamerrel módosított biochipek alkalmazásával. A mérési adatok illesztése a specifikus kötődés elsőrendű kinetikáját leíró hiperbolikus egyenlettel történt. 6
Csak a primer felismerő régiókat is tartalmazó 81mer PSA-H-Flank aptamer bizonyult specifikusnak, amihez egyáltalán nem kötődött az MT32 fehérje. Azonban a PSA-H-Flank aptamer érzékenysége kisebb volt a PSA-H fehérjére, mint a rövidebb PSA-H aptamernek. A kisebb érzékenység magyarázható azzal, hogy a hosszabb aptamer esetén a felületi borítottság (kötőkapacitás) kb. 25%-kal kisebb, mint a rövidebb aptamer esetén. A szelektivitás összhangban van az SPR tranziensek kinetikai kiértékeléséből származó aptamer-fehérje kölcsönhatások disszociációs állandóival (K d ). MT32 fehérje esetén a HS-MT32 aptamer K d értéke kb. 1 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a HS-PSA-H aptamer K d értéke, azaz 5,5 10-8 M a 2,9 10-7 M-rel szemben. A PSA-H fehérje-aptamer disszociációs állandó értéke az alábbiak szerint növekszik: PSA-H aptamer (8,0 10-9 M), PSA-H-Flank aptamer (2,6 10-8 M) és MT32 aptamer (8,3 10-8 M), ami megfelel a megfigyelt szelektivitásoknak. A vírusfehérjék valós növényi mintából történő kimutatásakor számolni kellett az aptamerek jelentős negatív töltéssűrűsége miatt a magasabb pi értékű mátrix fehérjék nem-specifikus adszorpciójával. A TEG-SH felületek nem mutattak szignifikáns nemspecifikus adszorpciót a vizsgált mintákkal, azonban az aptamereket is tartalmazó kevert monorétegek esetén jelentős mértékű volt (10-35 m ). Bár az azonos sarzsból származó növényi kivonatok esetén a nem-specifikus adszorpció gyakorlatilag megegyezett, jelentősen eltért a különböző növényekből készített növényi kivonatok, illetve az azonos növényből készített, de különböző sarzsok esetén. A nem-specifikus kölcsönhatást 250 nm avidinnel (pi=10,5) és annak származékával, NeutrAvidinnel (pi=6,3) vizsgáltam. A 7,4-es ph-n pozitívan töltött avidin 220,5 (±3) m rezonancia szög változást adott, míg a NeutrAvidin, amely enyhén negatívan töltött ezen a ph-n, csak 8,5 (± 0,5) m változást okozott. Mivel a két fehérje mérete közel azonos (~60 kda), az avidin esetében fellépő nagy rezonancia szög változást nehéz lenne mással magyarázni, mint elektrosztatikus kölcsönhatással. Véletlenszerű bázissorrendű, de az aptamerekkel megegyező hosszúságú és felületi borítottságú DNS szálból kialakított referencia felületet alkalmazva vizsgáltam a felületre immobilizált aptamerek és MT32 vírus kapszidfehérjével spike-olt alma levél kivonat közötti kölcsönhatást. Az ispr mérésekkel kapott adatok jó egyezést mutattak az ideális oldatban végzett mérésekkel. A hosszabb PSA-H-Flank és a rövidebb PSA-H aptamerek válasza alacsony volt, míg az MT32 aptamer a növekvő MT32 koncentrációval közel lineárisan növekvő rezonancia szög eltolódást mutatott.(5. ábra) 7
5. ábra MT32 kalibrációs görbék alma levél kivonatból, három különböző aptamerrel. A görbék korrekciója a referencia DNS felületen mért rezonancia eltolódások kivonásával történt. A mérési adatokat a specifikus kötődés elsőrendű kinetikáját leíró hiperbolikus egyenlettel illesztettem. A vírus kapszidfehérjék növényi kivonatból történő meghatározására alkalmazott módszert a Bioreba AG-tól származó, kereskedelmi forgalomban kapható ASPV pozitív növényi kivonatokon is teszteltem (6. ábra). 6. ábra 500 g/ml összes protein koncentrációjú, ASPV fertőzött növényi kivonat válaszjele: (a) MT32, (b) HS-PSA-H, (c) HS-PSA-H-Flank aptamerek Az eredményekből egyértelműen látszik, hogy HS-PSA-H és HS-MT32 aptamerek alkalmazásával, jelölésmentes detektáláson alapuló módszerrel megkülönböztethető a pozitív és negatív kontroll minta. Mivel a HS-PSA-H-Flank aptamer egyáltalán nem adott válaszjelet, és a legnagyobb rezonancia szög eltolódást az MT32 aptamerrel mértem, feltételezhető, hogy a növényi kivonat csak MT32 proteint tartalmazott, ami a gyártó specifikációjának megfelelően az ASPV jelenlétére utal. 8
7. ábra (A) HS-MT32 aptamer SPR chip háttér korrigált válaszgörbéje különböző ASPV fertőzött növényi kivonat hígítások esetén. (B) Koncentrációfüggés a három különböző aptamer esetében: (a) HS-MT32, (b) HS-PSA-H, (c) HS-PSA-H-Flank. A 7. ábra tipikus válaszgörbét mutat ASPV fertőzött mintákra, valamint a negatív kontrollra. A várakozásnak megfelelően a minta hígításával az SPR válaszjel csökken, és rendkívül jól megkülönböztethető a negatív kontroll. Míg a PSA-H-Flank aptamer nem adott választ a vizsgált koncentrációtartományban, a HS-MT32 és a HS-PSA-H aptamerek jól elkülöníthető válaszjelet adtak, ami ismét mutatja az APSV fertőzések detektálhatóságát még jelentősen kihígított növényi kivonatokban is. A 8. ábra egy aptamerrel módosított és egy TEG-SH védett szenzorfelület pásztázó elektronmikroszkópiás felvételét mutatja. A hosszúkás vírustöredékek (2,2 10 7 db/cm 2 ) tisztán láthatók az aptamerrel módosított felületeken, míg az aptamerrel nem módosított felületről készített felvételeken nem voltak láthatók. 8. ábra Tipikus pásztázó elektronmikroszkópiás felvételek: (A) aptamer nélküli referencia felület és (B) HS-MT32 aptamer módosított felület ASPV fertőzött növényi kivonattal történő inkubálást követően. Glutáraldehiddel történő rögzítést és negatív festést alkalmaztam a felülethez kötődő vírus részek megjelenítéséhez. A méretvonalak 500 nm-esek. Annak ellenőrzésére, hogy az MT32 aptamer különbséget tud-e tenni különböző vírusok által fertőzött növényi minták között, ASPV-vel, alma mozaik vírussal (apple mosaic ilarvirus APMV) és alma klorotikus levélfoltosság vírussal (apple chlorotic leaf spot trichovirus ACLSV) fertőzött növényi mintákat vizsgáltam HS-MT32 aptamerrel módosított SPR szenzorchipen. Az MT32 aptamer és a HS-T 44 referencia oligonukleotidon mért rezonancia szög eltolódások között nem volt szignifikáns eltérés 9
az APMV és az ACLSV vírussal fertőzött minták esetében (9. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az MT32 aptamer képes különbséget tenni különböző vírusok között. 9. ábra Referencia felülettel korrigált felületi plazmon rezonanciás válaszok ASPV, APMV és ACLSV fertőzött növényi kivonatokra, 100 g/ml összprotein koncentrációnál Nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens assay (ALPHA) aptamer-fehérje kölcsönhatások jellemzésére A vírus fehérje-aptamer kölcsönhatások jellemzésére kidolgoztam egy erősített lumineszcenciás távolságmodulált homogén mérési módszert, amivel megerősítettem az ispr-rel mért K D értékeket. A PSA-H aptamer esetében az így kapott K d érték 5,3±3,9 nm, az MT32 aptamer esetében pedig 70,5±28,0 nm (10. ábra). Ezek az eredmények jó egyezést mutatnak az SPR-rel megállapított adatokkal. 10. ábra PSA-H fehérje kölcsönhatás telítési görbéje MT32 ( ) és PSA-H ( ) aptamerekkel. Kompetitív assay-vel is ellenőriztem az aptamer-fehérje kölcsönhatás K d értékét (11. ábra). A kompetitív assay-vel meghatározott 28,4±16,6 nm K d érték kissé nagyobb, mint az SPR mérések során meghatározott érték, azonban nem különböznek szignifikánsan (c=95%) az értékek. 10
11. ábra Kompetitív assay PSA-H aptamerrel. A kísérleti adatok homológ kompetitív modellel történő illesztéséből a K d érték 28,4±16.6 nm-nak adódott Fehérjék szelektív, jelölésmentes detektálása mikromintázott, felületi lenyomatot tartalmazó mesterséges receptorokkal Az általános vékonyfilm stratégiával szemben egy újszerű megközelítést alkalmaztunk annak érdekében, hogy az SPR szenzor érzékelési zónájában hozzuk létre fehérje kötőhelyeket kihasználva a felületi lenyomatképzésben (SI) rejlő lehetőségeket. A 12. ábra mutatja a molekuláris lenyomatképzés sematikus ábráját, ami fotolitográfiás eljárással létrehozott mintázatképzésen alapul, és csak a PEDOT/PSS barázdák függőleges falain, azaz a szenzorchip felületére merőlegesen elhelyezkedő kötőhelyeket hoz létre. 12. ábra A molekuláris lenyomatú polimer mikrobarázdák létrehozása során a felületi lenyomatképzés folyamatának sematikus ábrája (a-f, felül), és a megfelelő mikrostruktúrák optikai mikroszkópos képei (a-c, e,f, alul). A (d) ábrán a PC mikrobarázdákon a protein abszorpciót fluoreszcensen jelölt proteinnel (avidin-fluoreszcein izotiocianát Av-FITC) és epifluoreszcens képalkotással jelenítettük meg. A mikromintázott polimer chipekkel történő SPR mérésekhez a szenzorchipen felületi lenyomatot tartalmazó (SIP) és felületi lenyomatot nem tartalmazó (NIP) struktúrákat is kialakítottunk, hogy egyszerre lehessen nyomonkövetni a kétféle felületen a kötődéseket. Az additív kalibrációs görbe (13. ábra) egyértelműen mutatja a felületi lenyomatképzés hatását avidinnal történő kötődéskor a NIP felülethez képest. A legnagyobb vizsgált avidin koncentrációban a NIP mikrostruktúrák válaszjele megközelítőleg egy nagyságrenddel alacsonyabb volt, mint a SIP felületek esetében, ami azt jelenti, hogy a lenyomatképzési faktor az egyik legmagasabb a publikált protein-mip-ek között. 11
13. ábra (A) avidin-sip mikromintázott (a) és NIP (b) felületeken mért SPR szenzorgramok egymást követő, növekvő avidin koncentrációk esetén; (B) a kumulatív kalibrációs görbe 4 paraméteres logisztikus függvénnyel illesztve A számításokból a értéke 125 nm, ami valamivel jobb, mint egy korábbi munkában, felületi lenyomatú PEDOT/PSS mikrorudak esetén közölt érték 7 és a NIP felületre számított értéknél is több mint tízszer kisebb (1,4 M). A SIP szelektivitását avidin származékokkal, streptavidinnal (ST), NeutrAvidinnal (NA) és ExtrAvidinnal (EA) vizsgáltam, valamint olyan fehérjékkel, melyek szintén magas izoelektromos ponttal (pi) rendelkeznek, például a lizozimmal (Lys, pi 11,35) (14. ábra). Egy jelentősen kisebb pi értékű (4,7), de közel azonos molekulatömegű fehérjét, BSA-t is vizsgáltam. A NIP felületek alacsonyabb válaszjelet adtak a vizsgált fehérjék esetén, mint az avidin-sip felületek, ami a natív PEDOT/PSS felületek alacsonyabb fehérje adszorpciója miatt volt. A vártnak megfelelően az avidin- SIP felületen a legnagyobb válaszjelet az avidin adta, majd az ExtrAvidin, NeutrAvidin és streptavidin következett (14. ábra). 14. ábra Avidin-SIP (a) és NIP (b) felületek válaszjelei különböző proteinek 10-2 mg/ml koncentrációjú oldata esetén A SIP felületek regenerálásához 1 M-os NaCl oldatot választottunk. A regenerált felület válaszjele (15. ábra, A) ugyan elhanyagolható alapvonal eltolódást mutat, de eb- 7 Menaker A, Syritski V, Reut J, et al. Electrosynthesized Surface-Imprinted Conducting Polymer Microrods for Selective Protein Recognition. Advanced Materials. 2009;21(22):2271-2275. 12
ben az esetben valamivel kisebb a lenyomatképzési tényező. Ez arra utal, hogy a koncentrált NaCl oldat befolyásolja a SIP kötőhelyeit. 15. ábra (A) A mikromintázott avidin-sip nem-specifikus adszorpcióval korrigált SPR válaszjele különböző avidin koncentrációk esetén, az egyes koncentrációk között regenerálva a felületet. (B) 4 paraméteres logisztikus függvénnyel illesztett kalibrációs görbe. Az asszociációt növekvő NaCl koncentrációjú pufferben végezve a SIP felülethez kötődő avidin mennyisége jelentősen csökken (16. ábra). 16. ábra A puffer NaCl tartalmának hatása az avidin asszociációjára avidin-sip felületeken (a) és NIP felületeken (b) Ez ismét az avidin és a SIP közötti kölcsönhatás elektrosztatikus jellegére utal, szemben az avidin NIP kölcsönhatással, amit nem befolyásol az ionerősség. Valószínűleg a lenyomatképzés során feldúsul a PSS a PEDOT/PSS filmek felületén. Ez a jelenség megmagyarázná a SIP felületek nagyobb affinitását a nagyobb pi-vel rendelkező fehérjékhez, valamint lizozim nagyobb adszorpcióját a SIP felületekhez, mint a NIP felületekhez. Az avidin és a SIP közötti kölcsönhatás azonban nem tisztán elektrosztatikus jellegű, amire az utal, hogy az avidin és a semleges töltésű extravidin esetén nagyobb válaszjelet kapunk, mint a lizozim estében. 13
4 Tézisek 1. Originális DNS aptamereken alapuló felületi plazmon rezonanciás (SPR) chipeket fejlesztettem ki alma törzsgöndörödés vírus (Apple Stem Pitting Virus - ASPV) kapszidfehérjék szelektív meghatározására. Képalkotó felületi plazmon rezonanciás (SPRi) méréstechnikával meghatároztam az aptamerek optimális immobilizálási paramétereit planáris arany szenzorchipen. Azonosítottam és meghatároztam több olyan tényező hatását, amely az aptamer érzékelők szelektivitását befolyásolja: (a) az aptamer variábilis részét közrefogó primer régiók jelenléte, (b) az aptamerek felületi borítottsága, (c) térkitöltő molekulák, és (d) az aptamerek elektrosztatikus kölcsönhatása a mintamátrixszal. P1 2. Megmutattam, hogy originális, kontraszelektált aptamereket felhasználva, optimalizált SPRi szenzorchipekkel szelektíven detektálható az alma törzsgöndörödés vírus (Apple Stem Pitting Virus - ASPV) két módosulatának kapszidfehérjéje. Megfelelő referencia felületet alkalmazva jelölésmentesen kimutattam ASPV fertőzött növényi kivonatban a vírus jelenlétét. A módszer szelektívnek bizonyult alma mozaik vírussal (Apple Mosaic Virus APMV) és alma klorotikus levélfoltosság vírussal (Apple chlorotic leaf spot virus - ACLSV) P1, P2 szemben is. 3. Fehérje-DNS aptamer közötti kölcsönhatás jellemzésére először alkalmaztam az ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) nagy jelerősítésű homogén távolság modulált lumineszcens módszert és bizonyítottam a módszer alkalmasságát az ilyen jellegű kölcsönhatások disszociációs egyensúlyi állandóinak meghatározására. P4 4. Fotolitográfiás eljáráson alapuló módszert dolgoztam ki fehérjék felismerésére alkalmas mikromintázott molekuláris lenyomatú polimerek előállítására közvetlenül SPR chipek felületén. A kiválasztott avidin modellfehérje alkalmazásával bizonyítottam, hogy ez a módszer kiválóan használható szelektív fehérje meghatározására alkalmas felületi lenyomatú polimerek előállítására és az így előállított SPR érzékelők lehetőséget nyújtanak a fehérje bekötődés valós idejű, jelölésmentes nyomonkövetésére. P3 5 Közlemények Az értekezés tárgyát képező közlemények: P1 Lautner, G., Balogh, Z., Bardóczy, V., Mészáros, T., Gyurcsányi, R. E. P2 14 Aptamer-based biochips for label-free detection of plant virus coat proteins by SPR imaging. Analyst 135, 918-926, (2010). IF: 3,913, idézettség: 16 Balogh, Z., Lautner, G., Bardóczy, V., Komorowska, B., Gyurcsányi, R. E., Mészáros, T., Selection and versatile application of virus-specific aptamers. Faseb Journal 24, (11) 4187-4195, (2010) IF: 6,721, idézettség: 4
P3 Lautner, G., Kaev, J., Reut, J.; Opik, A., Rappich, J., Syritski, V., Gyurcsanyi, R. E. Selective Artificial Receptors Based on Micropatterned Surface-Imprinted Polymers for Label-Free Detection of Proteins by SPR Imaging. Advanced Functional Materials 21, 591-597, (2011). IF: 10,179, idézettség: 7 P4 Lautner, G., Balogh, Z., Gyurkovics, A., Gyurcsányi, R. E., Mészáros, T. Homogeneous assay for evaluation of aptamer-protein interaction. Analyst 137, 3929-3931, (2012), IF(2011): 4,23 Előadások magyar nyelven Lautner, G., Növényi vírus burokfehérjék jelölésmentes detektálása aptameren alapuló ispr biochipekkel, Oláh György Doktori Iskola Doktoráns konferencia, 2010, Budapest Lautner, G., Syrytski, V., Rappich, J. Gyurcsányi, R., Felületi lenyomatú, mikromintázott polimeren alapuló érzékelés, Kémiai Szenzorok Workshop, 2010, Pécs Egyéb előadások Gyurcsányi, R.E., Jágerszki, Gy., Lautner, G., Syritsky, V., Szűcs, J., Höfler, L., Nanoszerkezeteken és szintetikus ligandumokon alapuló miniatürizált analitikai rendszerek, Kémiai Szenzorok Workshop, 2006, Pécs Szűcs, J., Lautner, G., Gyurcsányi, R.E., Bardóczy, V., Mészáros, T., Tóth, K., Development of Biochips for Surface Plasmon Resonance Imaging Detection of Aptamer - Ligand Interactions, 14th Young Investigators Seminar on Analytical Chemistry, 2007, Pardubice Gyurcsányi, R.E., Lautner, G., Mészáros, T., Szintetikus receptorokon alapuló chipek vírusok és proteinek jelölés nélküli meghatározására felületi plazmon rezonanciás képalkotással, Francelab Tudományos Napok 2011, Budapest Lautner, G., Képalkotó felületi plazmon rezonancia bioanalitikai alkalmazása, Francelab Tudományos Napok 2012, Budapest Egyéb közlemények és poszterek Lautner, G., Development of Biochips for Surface Plasmon Resonance Imaging Detection of Aptamer - ligand Interaction, Periodica Polytechnica Ser. Chemical Engineering, 51/2 (2007) 72 Lautner, G., Szűcs, J., Gyurcsányi, R.E., Bardóczy, V., Mészáros, T., Aptamereken alapuló SPR biochipek fejlesztése növényi vírusok meghatározására, Oláh György Doktori Iskola Doktoráns konferencia, 2008, Budapest Lautner, G., Szűcs, J., Gyurcsányi, R.E., Balogh, Zs., Bardóczy, V., Komorowska, B., Mészáros, T., Komorowska, B., Selective Detection of Plant Virus Coat Proteins by Aptamer Based Biochips, International Conference on Electrochemical Sensors, Mátrafüred 08, 2008, Dobogókő 15
Gyurcsányi, R. E., Höfler, L., Cserkaszky, Á., Varga, T., Lautner, G., Jágerszki, Gy., Fürjes, P., Tóth, A. L., Chemically Modified Solid-State Nanopores for Sensing, International Conference on Electrochemical Sensors, Mátrafüred 08, 2008, Dobogókő Lautner, G. Rappich, J., Syritsky, V., Gyurcsányi, R.E., Selective Artificial Receptors Based on Micropatterned Surface-Imprinted Polymers for Label-free Detection of Proteins by SPR Imaging, Oláh György Doktori Iskola Doktoráns konferencia, 2009, Budapest Balogh, Zs., Bardóczy, V., Lautner, G., Komorowska, B., Gyurcsányi, R.E., Mészáros, T., Aptamers as Virus Detecting Molecules, Pittcon, 2010, Orlando FL, USA Lautner, G., Szűcs, J., Gyurcsányi R.E., Balogh, Zs., Bardóczy, V., Komorowska,.B., Mészáros, T., Selective Detection of Plant Viruses by Aptamer Based Biochip, International Conference on Electrochemical Sensors, Mátrafüred 11, 2011, Dobogókő Szeitner, Zs., Nagy, K.Sz., Lautner, G., Gyurcsányi, R.E., Mészáros, T., Selection and binding properties of cardiac specific troponin aptamers, International Conference on Electrochemical Sensors, Mátrafüred 11, 2011, Dobogókő Lautner, G., Jágerszki, Gy., Bakk, D.T., Fekete, Z., Vrouwe, E., Gyurcsányi, R.E., Fürjes, P., Microfluidically Addressable Solid State Nanopores for Biochemical Sensing and Counting, Pittcon, 2012, Orlando FL, USA 16