Ph.D. értekezés. Készítette: Dr. Bán Zoltán Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár

A magzat számbeli chromosoma-rendellenességeinek kimutatása magzatvíz- és chorionboholymintákból quantitatív fluoreszcens polimeráz láncreakció módszerrel Ph.D. értekezés Készítette: Dr. Bán Zoltán Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok (vezető: Dr. Tulassay Zsolt) 2/2. Magzati és Újszülöttkori Orvostudomány (programvezető: Dr. Papp Zoltán) Téma: I. Prenatális genetika Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Budapest, 2005. Szigorlati bizottság: Dr. Fekete György egyetemi tanár Dr. Tóth Zoltán egyetemi tanár Dr. Csapó Zsolt egyetemi docens Hivatalos bírálók: Dr. Dobos Matild egyetemi docens Dr. Gundy Sarolta osztályvezető

TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés... 1. oldal 1.1. A prenatális cytogenetikai vizsgálat indikációi... 2. oldal 1.1.1. Idősebb anyai életkor.. 2. oldal 1.1.2. Kiegyensúlyozott strukturális chromosoma-rendellenesség valamelyik szülőnél... 3. oldal 1.1.3. Előző gyermek chromosoma-rendellenessége... 3. oldal 1.1.4. Anyai szérum marker vizsgálat... 4. oldal 1.1.4.1. Anyai szérum marker szűrés a második trimeszterben. 5. oldal 1.1.4.2. Anyai szérum marker szűrés az első trimeszterben. 6. oldal 1.1.5. Ultrahang vizsgálat. 7. oldal 1.2. Invazív mintavételi módszerek.. 8. oldal 1.2.1. Chorionboholy-mintavétel.. 9. oldal 1.2.2. Genetikai amniocentézis. 9. oldal 1.3. A chromosoma-rendellenességek prenatális diagnosztikájának laboratóriumi módszerei. 10. oldal 1.3.1. Cytogenetikai vizsgálat 10. oldal 1.3.2. Molekuláris genetikai módszerek 11. oldal 1.3.2.1.FISH.. 11. oldal 1.3.2.2.QF-PCR. 13. oldal 1.3.2.3.Comparatív genomiális hybridizáció... 17. oldal 1.3.2.4.Real-time PCR.. 18. oldal 2. Célkitűzések. 20. oldal 3. Anyag és módszer... 21. oldal 3.1. Chorionboholyminták... 21. oldal 3.2. Magzatvízminták.. 21. oldal 3.3. Műszerek 21. oldal 3.4. Reagensek.. 22. oldal 3.5. Fluoreszcens jelöléssel ellátott oligonukleotid primerek... 23. oldal 3.6. Felhasznált számítógépes programok 23. oldal 3.7. Módszerek. 24. oldal I

3.7.1. Cytogenetikai vizsgálat... 24. oldal 3.7.2. QF-PCR vizsgálat... 24. oldal 3.7.2.1. DNS izolálás chorionboholymintából. 25. oldal 3.7.2.2. DNS izolálás magzatvízmintából.... 26. oldal 3.7.2.3. Polimeráz láncreakció.. 26. oldal 3.7.2.4. A PCR termékek detektálása... 27. oldal 3.7.3. Statisztikai kiértékelés... 27. oldal 4. Eredmények. 28. oldal 4.1. A QF-PCR módszer és a cytogenetikai vizsgálat eredményeinek összehasonlítása. 28. oldal 4.1.1. Normál minták értékelése... 32. oldal 4.1.2. Aneuploidiák kimutatása chorionboholymintákból... 33. oldal 4.1.3. Aneuploidiák kimutatása magzatvízmintákból.... 33. oldal 4.1.4. Magzati nemmeghatározás chorionboholymintákból 35. oldal 4.1.5. Magzati nemmeghatározás magzatvízmintákból... 35. oldal 4.1.6. Mozaikosság kimutatása. 36. oldal 4.1.7. A magzatvízminta kontaminációja anyai vérrel.. 37. oldal 4.2. Az STR markerek alléleloszlásának vizsgálata.. 38. oldal 4.3. A chorionboholy-mintavétel indikációjának vizsgálata a kórosnak talált esetekben.. 39. oldal 4.4. A magzatvíz-mintavétel indikációjának elemzése a kórosnak talált esetekben... 40. oldal 4.5. A QF-PCR vizsgálat egyéb alkalmazási lehetőségei. 40. oldal 4.5.1. Triploidia kimutatása és a számfeletti chromosomaszerelvény szülői eredetének meghatározása. 40. oldal 4.5.2. Uniparentalis disomia kimutatása és az UPD-t mutató chromosoma eredetének vizsgálata 43. oldal 4.6. Az allélvesztés csökkentésének lehetőségei... 44. oldal 5. Megbeszélés. 49. oldal 6. Következtetések.. 54. oldal 7. Összefoglalás 56. oldal 8. Rövidítések... 58. oldal II

9. Köszönetnyilvánítás 60. oldal 10. Irodalomjegyzék.. 61. oldal 11. Saját irodalom jegyzéke.. 74. oldal 11.1. Az értekezés készítése során felhasznált saját irodalom 74. oldal 11.1.1. Lektorált közlemények 74. oldal 11.1.2. Idézhető absztraktok 76. oldal 11.2. Egyéb, nem az értekezés témájában megjelent saját közlemények... 77. oldal 11.2.1. Lektorált közlemények 77. oldal 11.2.2. Könyvfejezetek 78. oldal 11.2.3. Idézhető absztraktok 79. oldal III

1. BEVEZETÉS 1. Bevezetés A prenatális diagnosztika a klinikai genetika azon területe, amely magába foglalja mindazokat a módszereket és eljárásokat, amelyek segítségével az embryo, illetve a magzat genetikai állományáról információt nyerhetünk. A módszerek segítségével felismerhetjük azokat a magzati rendellenességeket, amelyek méhen belüli, esetleg korai újszülöttkori kezelést tesznek szükségessé, vagy gyógyíthatatlan esetekben a terhesség befejezését indokolhatják. A prenatális diagnosztika egyrészt lehetővé teszi, hogy magas genetikai kockázattal bíró szülők számára is megelőzhető legyen a beteg utód születése, másrészt negatív diagnosztikus eredmény esetén elősegíti az utód vállalását ezekben a családokban. A prenatális genetikai diagnosztika kezdete az 1950-es évekre vezethető vissza. Elsőként Fuchs és munkatársai az X-chromatin vizsgálatával magzatvízből történő nemmeghatározást végeztek haemophilia A emelkedett magzati kockázata miatt [44], majd 1966-ban Steele és Bregg [114], valamint Lussier és mtsai [70] nevéhez fűződik az első magzati karyotypus-meghatározás. Magyarországon az első prenatális nemmeghatározást Papp és munkatársai végezték 1970-ben [91], majd az első magzatvízsejt-vizsgálatokról 1972-ben számoltak be [92]. A prenatális genetikai diagnosztika egyik legfontosabb területe a magzati chromosomarendellenességek vizsgálata. A petesejtek 18-19%-ában, a spermiumok 3-4%-ában figyelhető meg a chromosomák számbeli rendellenessége, aneuploidia [78,79,113]. Becslések szerint 13 megfogant embryóból egy chromosoma-rendellenességet hordoz [14], és az első trimeszterben történő vetélések mintegy 50%-ának hátterében áll aneuploidia [83]. Az összes szülés 0,65%-ában fordul elő klinikailag jelentős chromosoma-rendellenesség, valamint 0,2%-ban olyan kiegyensúlyozott chromosoma transzlokáció, amelynek a későbbi reproduktivitásban lehet következménye [58]. A perinatalis mortalitás 30%-ában van szerepe veleszületett rendellenességeknek, és összességében ezeknek 5,6-11,5%-ának hátterében áll chromosoma-rendellenesség [4]. A fenti adatok alátámasztják a prenatális chromosoma-vizsgálatok fontosságát. A vizsgálat elvégzésének előfeltétele a terhességgondozás során végzett genetikai tanácsadás. A genetikai tanácsadás feladata, hogy kiszűrje azon terheseket, akiknél a 1

1. BEVEZETÉS magzati chromosoma-rendellenességek fokozott kockázata áll fenn. A magzati chromosoma-rendellenességek definitív diagnózisa jelenleg csak invazív beavatkozások útján lehetséges, amelyek magzati kockázatot jelentenek. A genetikai tanácsadás legfőbb célja, hogy a terhesség alatt végzett nem-invazív vizsgálatok eredményei, illetve az anamnesztikus adatok alapján felmérjék a házaspár kockázatát, és a házaspár tájékoztatása után a kockázatok és az előnyök ismeretében a házaspárral közösen szülessék döntés az invazív beavatkozás esetleges elvégzéséről [2]. A terhesgondozás során a chromosoma-rendellenességek kockázatának becslésénél a következő szempontokat kell figyelembe venni: Anyai életkor [34,38,50,54,61] Kiegyensúlyozott strukturális chromosoma-rendellenesség valamelyik szülőnél [131,132,137] Előző gyermek chromosoma-rendellenessége [84,115,131] Anyai szérum marker szűrővizsgálat pozitív eredménye [19,28,54,128] Ultrahang gyanújelek [7,8,9,72,112] Habituális vetélés, subfertilitás, vagy tisztázatlan perinatális halálozás a kórelőzményben [4,12] Egyéb (pl. szülői aggodalom, apai életkor [79], a családban észlelt UPD [16], stb.) A házaspár tájékoztatása a WHO ajánlása alapján nem-direktív módon történik [71]. A genetikai tanácsadás során a házaspár az objektív felvilágosítást követően maga hozza meg a döntést a cytogenetikai vizsgálat elvégzéséről, illetve kóros esetben a terhesség továbbviseléséről, vagy megszakításáról [126,139]. 1.1. A prenatális cytogenetikai vizsgálat indikációi 1.1.1. Idősebb anyai életkor Az autosomalis trisomiák és a nemi chromosomák aneuploidiáinak előfordulásának gyakorisága az anyai életkorral párhuzamosan növekszik. (ld. 1. ábra) 2

1. BEVEZETÉS Chromosoma-rendellenességek gyakorisága az anyai életkor függvényében 12 10 Előfordulás (%) 8 6 4 21-es trisomia 18-as trisomia 13-as trisomia Nemi chr. Összesen 2 0 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Anyai életkor 1. ábra: Chromosoma-rendellenességek gyakorisága az anyai életkor függvényében Forrás: Ferguson-Smith és mtsa 1985 [38] Amennyiben az anyai életkor 35 év, javasolt a prenatális cytogenetikai vizsgálat elvégzése. Jelenleg ez a magzati cytogenetikai vizsgálatok leggyakoribb indikációja. A 35 éves határ megállapítása abból adódik, hogy ennél a korcsoportnál éri el a chromosoma-rendellenességek előfordulásának kockázata az invazív magzati mintavételi technikák szövődményeinek kockázatát (0,5-1%) [34,38,50,54,61,94]. 1.1.2. Kiegyensúlyozott strukturális chromosoma-rendellenesség valamelyik szülőnél Ebbe a csoportba lényegesen kevesebb eset (általában <5%) tartozik, az utód kockázata azonban igen magas arra, hogy kiegyensúlyozatlan chromosoma-rendellenessége legyen [131,132]. A kockázat változó (10-50%) attól függően, hogy az apa, vagy az anya a hordozó, illetve, hogy melyik chromosomáról és milyen típusú rendellenességről van szó [137]. 1.1.3. Előző gyermek chromosoma-rendellenessége 1979-ben Milunsky 32.443 amniocentesis adatait gyűjtötte össze világméretű tanulmányában, és megállapította, hogy az előző gyermek aneuploidiája nem okoz 3

1. BEVEZETÉS szignifikáns kockázatnövekedést a következő terhesség során [80]. Ennek ellentmond az 1984-es európai kollaboratív tanulmány, amely 2353 Down-syndromás eset adatai alapján megállapította, hogy a 30 évnél fiatalabb terhesek esetén a magzati chromosoma-rendellenesség kockázata mintegy 20-szorosára emelkedik abban az esetben, amennyiben az előző gyermek chromosoma-rendellenességben szenved. [115]. Az emelkedett kockázat feltételezhető okai a szülők gonadális mozaikossága, vagy strukturális chromosoma-rendellenessége, bizonyos exogén faktorok, vagy valamilyen jelenleg ismeretlen, monogénesen öröklődő, non-disjunctióra hajlamosító gén [84]. 1.1.4. Anyai szérum marker vizsgálat A 35 év feletti anyai életkor a magzati chromosoma-rendellenességek ismert rizikófaktora, azonban a terhespopuláció nagyságából adódóan a chromosomarendellenességben szenvedő gyermekek többsége 35 évnél fiatalabb anyáktól születik. Az USA-ban, Nagy-Britanniában és Kanadában a Down-syndromás gyermekek 75-80%-a az 1970-es évek végén olyan 35 évnél fiatalabb anyától született, akiknél a negatív kórelőzmény miatt nem történt genetikai tanácsadás [2,129]. Ezen esetek egy részének megelőzésére alkalmasak a terhespopuláción végzett neminvazív szűrések, például az anyai szérum marker- és az ultrahang-szűrővizsgálatok [54,100,130]. A szűrővizsgálat nevében is benne van, hogy nem diagnosztikus célt szolgál, azaz egy átlagpopulációból kiszűri azokat az eseteket, amelyekben diagnosztikus vizsgálatra van szükség egy adott betegség szempontjából. A magzati chromosoma-rendellenességek, elsősorban a Down-syndroma szűrésére a következő szérum markerek alkalmasak: alfa-fetoprotein (AFP) humán chorion gonadotropin (első trimeszterben a szabad β-hcg, második trimeszterben az össz β-hcg) konjugálatlan oestriol (ue 3 ) inhibin-a (inha) pregnancy-associated plasma protein-a (PAPP-A) 4

1. BEVEZETÉS 1.1.4.1. Anyai szérum marker szűrés a második trimeszterben Az AFP, a β-hcg és az ue 3 markerek együttes vizsgálatát ( triple teszt ) 1988-ban fejlesztették ki [129], majd 1996-ban egészítették ki az inha vizsgálatával ( quadteszt ) [28]. Tanulmányok tapasztalata szerint a triple-teszt a Down-syndromás terhességek 65%-ában [129], a quad-teszt 75%-ában pozitív [28] amellett, hogy egy átlagos terhespopuláció 5%-ában indikál amniocentesist. Megfelelő kockázatbecslési programmal a módszer alkalmasnak bizonyult az Edwards syndroma (18-as trisomia) szűrésére is, valamint a vizsgálat során levett vérminta alkalmas a velőcsőzáródási rendellenességek AFP általi szűrésére is [19]. Az AFP-t a második trimeszterben döntően a magzati máj termeli. Indirekt adatok arra utalnak, hogy Down-syndromában a magzati máj éretlensége miatt kevesebb AFP termelődik, valamint a lepényben észlelhető csökkent vascularisatio miatt kevesebb jut az anyai keringésbe. A magzati máj, a mellékvese, valamint a lepény termeli a fetoplacentalis ue 3 -t, amelynek szintje szintén alacsonyabb Down-syndroma esetén. A hcg biológiailag aktív formája a non-kovalens módon kötött alfa és béta alegységből felépülő heterodimer. A második trimeszterben az összes, tehát a dimer és a szabad β- hcg szintje Down-syndroma esetén magasabbnak bizonyult az anyai szérumban. Az inha-t a terhesség során szintén a méhlepény termeli nagy mennyiségben, biológiailag aktív, heterodimer formájának szintje emelkedett Down-syndromás esetekben. A négy marker együttes vizsgálata biztosítja jelenleg a leghatásosabb biokémiai Downsyndroma szűrést a 2. trimeszterben [129]. A normális terhességeknél a 15-20. hét között az AFP és az ue 3 szintje erősen emelkedik, a β-hcg szintje csökken, az inha viszonylag változatlan marad [129]. Mivel ezen szűk időszakban relatíve nagy változás történik a szérum markerek szintjében, az adott terhességi napra specifikus értékeket kell használni a kockázatbecslés során (MoM). A MoM érték alkalmazása függetleníti a vizsgálatot a pontos terhességi kortól. Az MoM értékek felhasználásával, statisztikai módszerrel (multivariábilis Gauss eloszlás analízis), validált számítógépes programmal végezhető el a kockázatbecslés [129]. A teszt során a következő fő szempontokat kell betartani: A mintát a terhesség 16. hetében kell levenni. 5

1. BEVEZETÉS A pontos terhességi kort lehetőleg ultrahangos BPD, vagy CRL méréssel kell megállapítani, mivel a magzati femur és humerus Down-syndroma esetén rövidebb az átlagosnál [72]. Az anyai életkort és esetleges chromosoma-rendellenességben szenvedő gyermeket figyelembe kell venni a kockázatbecslésnél [130]. Anyai inzulin dependens diabetes mellitus, dohányzás és többes terhesség befolyásolhatja a biokémiai marker-szinteket [129]. A triple/quad teszt interpretációja genetikai tanácsadásonként változó lehet. Néhányan az 1/250 kockázatot veszik határértéknek [19,129], amely megfelel egy 37 éves terhes kockázatának. Mások az 1/380 határértéket alkalmazzák, amely egy 35 éves terhes Down-syndroma kockázatának felel meg [28]. Amennyiben a határérték meghatározásában megegyezés születik, és a terhes kockázata azt meghaladja ( pozitív szűrővizsgálat ), a genetikai tanácsadás során felmerül a magzat cytogenetikai vizsgálatának szükségessége. A triple/quad teszt irodalmi adatok szerint alkalmas a 18-as trisomia szűrésére is. Az AFP, a β-hcg és az ue 3 MoM értékei alacsonyabbak a normál értékeknél. Mivel 18-as trisomia esetén a β-hcg MoM értéke a 21-es trisomiával ellentétben alacsonyabb a normál értéknél, az inha szintje pedig nem mutat eltérést, a Down-syndroma szűrésére tervezett protokollok nem alkalmasak a 18-as trisomia szűrésére, ehhez külön kockázatbecslő programot kell használni [28]. 1.1.4.2. Anyai szérum marker szűrés az első trimeszterben A második trimeszterben történő szűrés elterjedése után kezdték vizsgálni a biokémiai marker-szűrés alkalmazási lehetőségét az első trimeszterben. Ennek előnye, hogy egy esetleges korai terhességmegszakítás a terhes szempontjából mind psychésen, mind a kockázatok szempontjából kedvezőbb. Az első trimeszterben végzett Down-syndroma szűrésre két biokémiai marker bizonyult alkalmasnak, a szabad β-hcg és a PAPP-A [49,130]. A szabad β-hcg szintje az első trimeszterben Down-syndroma esetén emelkedett, azonban önmagában alkalmazva szenzitivitása maximum 33%, 5%-os álpozitivitás mellett [49]. A PAPP-A a 8-13. terhességi hét között mérve Down-syndroma esetén alacsonyabbnak bizonyult (0,4 6

1. BEVEZETÉS MoM) a normál értéknél. Önmagában alkalmazva szenzitivitása 45%, 5%-os álpozitivitás mellett [130]. A két szérum marker együttes vizsgálata mintegy 60%-os szenzitivitást teszt lehetővé [130]. Egy harmadik faktorral, a magzati tarkóredő (nuchal translucency=nt) vastagságának ultrahanggal történő mérésével kiegészített szabad β- hcg és PAPP-A vizsgálat ( kombinált teszt ) szenzitivitása eléri a 85%-ot úgy, hogy a vizsgált terhességek 5%-ában indikál invazív vizsgálatot [13]. Az első trimeszterbeli kombinált teszt hatékonysága így meghaladja a második trimeszterbeli quad-teszt hatékonyságát, azonban az NT pontos és standardizált mérése kulcsfontosságú a módszer megbízhatósága szempontjából, ezért a klinikai alkalmazás során fontos a folyamatos minőségellenőrzés és minőségbiztosítás [112]. 1.1.5. Ultrahangvizsgálat A legtöbb klinikailag jelentős magzati chromosoma-rendellenesség részletes ultrahangvizsgálat során észlelhető rendellenességgel jár. Ezek jelentős része már az első, illetve a második trimeszterben kimutatható. Az ebben a témában megjelent legtöbb publikáció azonban progresszív betegellátást végző intézetekből származik, így válogatott beteganyagra és nem az átlagpopulációra vonatkozik. Ezért nem vonható le következtetés arról, hogy egy adott eltérés milyen gyakorisággal jár valójában chromosoma-rendellenességgel. Lényeges a vizsgálatot végző szakember tapasztalata is; több tanulmány utal az ultrahang-vizsgálatok szubjektív értékelésére [112]. Az első trimeszterben a leggyakrabban előforduló chromosoma-rendellenességet jelző elváltozás a megvastagodott magzati tarkóredő (NT). Tanulmányok szerint a terhesség 11-14. hetében mérve megbízható jele az autosomalis trisomiáknak, a Turner és Klinefelter syndromának, valamint a triploidiának. 21-es trisomia esetén 75-80%-os szűrési hatékonyságot írnak le a módszer alkalmazásával [72], bár az egészséges magzatok 5-10%-ánál is megvastagodott tarkóredő figyelhető meg [13]. Az álpozitív esetek aránya Spencer és mtsai 200-ben végzett összefoglaló tanulmányban 6%-nak bizonyult, és megállapították, hogy 3 mm-nél vastagabb tarkó redő esetén a 21-es trisomia előfordulásának kockázata 13-szorosa az átlagosnak. [112]. A jelenleg ajánlott protokoll szerint a genetikai tanácsadás 3 mm-nél vastagabb NT esetén indokolt [72]. Az NT mérésének azonban szigorú kritériumok szerint kell történnie, amelyek 7

1. BEVEZETÉS alkalmazásáról és eredményeiről a multicentrikus FASTER (First and Second Trimester Evaluation of Risk) tanulmány számol be [130]. Az elmúlt években jelentek meg közlemények egy másik, első trimeszterben észlelhető gyanújelről, a magzati orrcsont hiányáról 21-es trisomia esetén. Az orrcsont a terhesség 11-14. hete között a chromosomálisan egészséges magzatok 99,5%-ában ultrahangvizsgálat során látható. 21-es trisomia esetén az orrcsont hypoplasiás, és ezért a 21-es trisomiás magzatok 60-73%-ában az első trimeszterben nem látható. Egészséges magzatok esetén az orrcsont hiányának valószínűsége 0,3-0,6% [81]. Előrehaladottabb terhesség során a különböző chromosoma-rendellenességekhez egyéb, változatos eltérések társulhatnak [54]. A második trimeszterben észlelhető jelek közül leggyakrabban a ventriculomegalia (21- es, 18-as, 13-as trisomia és triploidia), holoprosencephalia (18-as, és 13-as trisomia), plexus choroideus cysta (21-es és18-as trisomia), corpus callosum hiány (18-as, és 13-as trisomia), rövid frontális lebeny (21-es trisomia), fossa posterior rendellenességek (18- as trisomia), eper alakú koponya (18-as trisomia), brachycephalia (21-es, 18-as, 13-as trisomia, Turner syndroma és triploidia), súlyos micrognathia (18-as trisomia), szem- és orr rendellenességek (13-as trisomia), cysticus hygroma és non-immun hydrops (21-es, 18-as, 13-as trisomia, Turner syndroma és triploidia), hernia diaphragmatica (18-as trisomia), szív rendellenességek (trisomiák és Turner syndroma), hyperechogén papilláris izom, oesophagus atresia (18-as trisomia), duodenum atresia (21-es trisomia), echogen belek (21-es trisomia), omphalocele (18-as és 13-as trisomia), rövidebb femur és a végtagok egyéb rendellenességei (21-es, 18-as, 13-as trisomia, Turner syndroma és triploidia), és intrauterin retardatio (18-as trisomia és triploidia) figyelhető meg [7,8]. A magzati symphysis-szög mérése a 21-es trisomia szűrésében 20% feletti álpozitivitása miatt jelenleg nem alkalmas önálló markerként [46], több markerrel kombinálva azonban értékes információt nyújthat [9]. 1.2. Invazív mintavételi módszerek A genetikai diagnosztikus vizsgálatra alkalmas magzati mintavétel módjai a chorionboholy-mintavétel (CVS), a genetikai amniocentézis (GAC), és a vérvétel a magzati köldökzsinórból (percutan umbilical blood sampling=pubs) [20,32]. 8

1. BEVEZETÉS 1.2.1. Chorionboholy-mintavétel A CVS a terhesség mindhárom trimeszterében, legkorábban a 10-12. hét között alkalmazható magzati mintavételi technika. A behatolás 20 G-s spinál tűvel a hasfalon keresztül történik ultrahang-ellenőrzés mellett. 10-20 mg szövetminta nyerhető a méhlepényből, amely cytogenetikai vizsgálatra, enzimaktivitás mérésére, illetve DNSvizsgálatokra alkalmas [86,111]. Elsőként Kazy és mtsai alkalmazták az 1980-as évek elején [59]. A módszer alkalmazása az 1990-es évek elején átmenetileg visszaesett, mivel feltételezték, hogy összefüggésben állhat végtag-redukciós defektussal, illetve oromandibularis hypogenesissel [21,43]. A 10. terhességi hét után végzett CVS esetén a fenti rendellenességeket nem figyelték meg [21], ezért klinikánkon CVS vizsgálatot kizárólag a 10. terhességi hét után végzünk [88,89,90]. A transcervicalis és transabdominális behatolási lehetőségek közül napjainkban szinte kizárólag a transabdominális mintavételt alkalmazzák biztonságosabb volta miatt [6,89,90]. A módszer előnye, hogy az első trimeszterben is elvégezhető és a nyert minta direkt cytogenetikai vizsgálatával az eredmény a mintavételt követő 24 órán belül elkészül, így kóros esetben a terhesség megszakítása már az első trimeszterben elvégezhető. A módszer hátránya, hogy alkalmazása során a magzati veszteség mintegy kétszerese az amniocentesis során észleltnek ( 2%), valamint sem a direkt, sem a tenyésztéses módszer során vizsgálható mitózisok minősége és sávozhatósága nem éri el a magzatvíz preparátumokét [68]. A pseudo-mozaikosság kérdése, amely lényegesen gyakoribb, mint a magzatvízvizsgálatnál, nehezítheti a kiértékelést [51]. A magzati veszteség a módszer alkalmazásával a nemzetközi tapasztalatokhoz hasonlóan klinikánk beteganyagában 1,7%-nak bizonyult, végtag-redukciós defektust, illetve oromandibularis hypogenesist nem figyeltünk meg [88]. 1.2.2. Genetikai amniocentesis Az első magzatvízből végzett cytogenetikai vizsgálatokat az 1960-as években írták le [70,114,123]. A klasszikus (a terhesség 16-18 hete között végzett) genetikai amniocentesis azóta a magzati chromosoma vizsgálatok standard módszerévé vált [85], és mivel az 1980-as évek végén történt kísérletek a korai (10-14. hét közötti) amniocentesissel kevésbé váltak be [57], a középidős amniocentesis azóta is alapvető 9

1. BEVEZETÉS fontosságú módszer a prenatális diagnosztikában [6]. Az eljárás során ultrahangellenőrzés mellett az amnionűrből egy 22G-s tűvel mintegy 10-20 ml magzatvizet veszünk, amely magzati eredetű sejteket tartalmaz. A minta cytogenetikai vizsgálatra, enzimaktivitás mérésére, illetve DNS-vizsgálatokra alkalmas. Mivel a magzatvízsejtek tenyésztése és cytogenetikai vizsgálata igen megbízható [105], valamint a beavatkozás szövődményeinek kockázata is alacsony (<1%), cytogenetikai vizsgálathoz elsősorban ezt a módszert alkalmazzuk [102]. Hátránya, hogy az eredményre a sejtek tenyésztése miatt mintegy két hetet kell várni, így kóros esetben a vetélésindukcióra -amennyiben azt a házaspár kéri- legkorábban a 18. héten kerülhet sor [6]. 1. 3. A chromosoma-rendellenességek prenatális diagnosztikájának laboratóriumi módszerei 1.3.1. Cytogenetikai vizsgálat A chromosoma analízis hagyományos módszere a cytogenetikai vizsgálat során történő karyotypizálás, amely a metafázisban gátolt osztódó sejtek Giemsa (G-) sávozását követően fénymikroszkópos vizsgálattal történik [52,53] (2. ábra). a. b. c. 2. ábra: a. tenyésztett magzatvízsejtek colchicinnel történt blokkolást és hypotonizálást követően b. egy sejthez tartozó metafázis c. 46, XX karyotypus (karyogram) A magztavíz-minta nem tartalmaz osztódó sejteket, ezért minden esetben szükséges a sejtek tenyésztése. A prenatális karyotypizálás fejlődése során kevésbé kondenzált, jobban sávozható chromosomák nyerése vált lehetővé, valamint a sejttenyésztés ideje lerövidült. A számbeli chromosoma-rendellenességeken kívül jelenleg az 5 Mb méretnél 10

1. BEVEZETÉS nagyobb deléciók, duplikációk és transzlokációk felismerésre lehetséges a rutin cytogenetikai vizsgálatok során [134]. 1.3.2. Molekuláris genetikai módszerek Az utóbbi évtizedekben a társadalmi igények változása és az idősebb életkorban gyermeket vállaló nők számának emelkedése miatt ugrásszerűen megnőtt az igény a prenatális diagnosztika iránt [77]. A vizsgálatok számának megemelkedése nagy megterhelést ró a cytogenetikai laboratóriumokra, amely igényt teremtett olyan automatizálható diagnosztikai módszer iránt, amely bizonyos esetekben helyettesítheti a hagyományos cytogenetikai vizsgálatot [134]. A cytogenetikai vizsgálat időigénye a másik oka azon molekuláris módszerek bevezetésének, amelyek nem igényelnek sejttenyésztést és ez által a vizsgálat rutinszerűen 1-2 napon belül elvégezhető. A két leggyakrabban alkalmazott molekuláris módszer a chromosoma-rendellenességek prenatalis kimutatására a fluorescens in situ hybridisatio (FISH) és a quantitativ fluoreszcens polimeráz láncreakció (QF-PCR). Mind a FISH, mind a QF-PCR alkalmazható a 21-es, a 18-as és a 13-as trisomia, valamint a nemi chromosomák rendellenességeinek (47,XXY, 47,XYY, 47,XXX, stb.) kimutatására [55]. Ezek a chromosoma-rendellenességek alkotják a chromosoma-rendellenességek 99%-át olyan terhességekben, amelyekben a magzati chromosoma-vizsgálat anyai életkor, gyanús ultrahang lelet, vagy az első és második trimeszterben észlelt szérum marker eltérés miatt történik. További újabb módszerek a comparatív genomiális hybridizáció (CGH) és a real-time PCR, amelyek azonban jelenleg még nem terjedtek el a magzati chromosoma-rendellenességek diagnosztikájában. 1.3.2.1. FISH A FISH módszer során fluoreszcens jelöléssel ellátott oligonukleotid probe-okat hybridizálunk a tárgylemezre korábban speciálisan rögzített interfázis- vagy metafázis- A probe-ok kötődnek a chromosomákon található komplementer DNS- preparátumokra. szakaszhoz és ezáltal fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálhatóak. Az aneuploidiák vizsgálata során interfázisban lévő sejteket használnak [125]. Normális esetben két fluoreszcens jel utal a chromosoma-párra, trisomia esetén három jel látható a sejtmagokban [55]. A 3. ábrán a 21-es trisomia FISH képe látható. 11

1. BEVEZETÉS 3. ábra: 21-es trisomia kimutatása interfázis FISH módszerrel. A DAPI magfestés kék színe előtt megfigyelhetőek a 21-es chromosomára specifikus vörös SpectrumOrange jelek, amelyekből három ábrázolódik. A módszer első leírása 1969-ben Pardue és Gall nevéhez fűződik, ők még radioaktív jelöléssel ellátott probe-okat alkalmaztak [93]. Napjainkban, kereskedelmi forgalomban kapható kitek (pl. Vysis AneuVysion Assay Kit) segítségével fluoreszcens jelölésű probe-okkal lehetséges a 21-es, 18-as, 13-as és az X/Y chromosomák aneuploidiáinak a vizsgálata [124]. A vizsgálat során 1-2 ml magzatvízminta üledékéből származó sejteket speciális tárgylemezekre kell fixálni, majd a hybridizációt elvégezni. Az aneuploidiavizsgálathoz két lemezt szokás használni, az egyiken a 21-es és 13-as, a másikon a 18-as és az X/Y chromosomák vizsgálata történik [18,55]. Mind az előkészítés, mind a kiértékelés idő- és munkaigényes, de a mintavételt követő két-három napon belül általában rendelkezésre áll az eredmény. Az utóbbi években megjelentek az automatizált kiértékelést szolgáló software-ek (Applied Imaging, stb.), azonban ezek megbízhatóságáról és hatékonyságáról még nem áll rendelkezésre elegendő adat [104,116]. Az irodalomban összesen publikált FISH vizsgálatok száma jelenleg több mint 60.000, ennek alapján az álpozitivitás 1/30000-nek, az álnegativitás 1/4000-nek bizonyult [17,18,35,37,65,133,136]. A viszonylag nagy arányú álnegativitás oka elsősorban abban keresendő, hogy az anyai sejtekkel történő kontamináció során a magzati és az anyai sejtek nem különíthetőek el egymástól [36,116,135]. A másik probléma a magzati mozaicizmus [116]. Mivel a probe-ok nem 100%-os specificitásúak, normál minta esetén is a sejtmagok egy részében három szignál figyelhető meg. Emiatt több (25-50) sejtmag vizsgálata alapján kell egy mintát kiértékelni és az eredmény akkor tekinthető normálisnak, ha a hármas-szignált adó magok száma nem ér el egy küszöbértéket [17,18]. Mindez azonban gyakorlatilag lehetetlenné teszi az alacsony arányú mozaikosság kimutatását [119]. 12

1. BEVEZETÉS 1.3.2.2. QF-PCR A PCR módszert 1985-ben Saiki és munkatársai írták le [107], majd 1987-ben Mullis és Faloona [82] fejlesztette tovább. 1989-ben a hőstabil DNS polymeráz (Taq) enzim bevezetésével [108] a módszer automatizálhatóvá vált, és forradalmasította a molekuláris biológiát. A módszer lényege a genomiális DNS-nek egy -a primerek által közrefogott szakaszának- in vitro megsokszorosítása. A reakció három lépés ismétlődéséből áll: Denaturáció: 95 C-on a DNS kettős hélix komplementer szálai közötti hidrogénkötés felbomlik, a DNS egy szálúvá válik (ssdns) Primer hybridizáció (annealing): a primerek a komplementer DNS szakaszokhoz kötődnek. Ennek ideális hőmérséklete a primerek olvadási hőmérsékleténél (Tm) néhány fokkal alacsonyabb, általában 52-72 C között van, a primer C-G tartalmától függően. A magasabb annealing hőmérséklet alkalmazása javítja a reakció specifikusságát, de csökkentheti a hatékonyságát. Extenzió: a Taq enzim a bekötött primerek folytatásában, a reakcióelegyben található dntp felhasználásával szintetizálja az adott DNS szakasz komplementer párját. A Taq enzim hőmérsékleti optimuma 72 C körül van. Ezen a hőmérsékleten az enzim percenként 2 kb hosszúságú DNS-t szintetizál. A reakcióelegy összetétele is befolyásolja a reakció működését. - A reakciópuffer pontos összetétele gyártónként változik. - A Taq enzim optimális koncentrációja 1,0-1,25 U között van 100 µl elegyben. Túl magas enzimkoncentráció a reakció specificitását rontja, ami zavaró háttér termékek képződéséhez vezet. A reakció specificitását rontja az is, ha az enzim szobahőmérsékleten kerül a reakcióelegybe. Ekkor primer dimerek és egyéb aspecifikus termékek képződnek. Ezt küszöbölte ki régebben a hot start, amely során a Taq enzimet csak az annealing hőmérséklet elérése után adták a reakcióelegyhez. Napjainkban olyan blokkolt Taq enzimet (pl. AmpliTaq Gold ) használnak a nagy specificitást igénylő PCR-ekhez, amely csak 95 C-on aktiválódik, és így a hot start -ot szimulálja, azonban lényegesen egyszerűbb az alkalmazása. - A dntp-k koncentrációja általában 20-200 µm között van. Koncentrációjának csökkentése a specificitást növelheti. 13

1. BEVEZETÉS - A MgCl 2 koncentrációja általában 0,5 2,5 mm között van, amelyet minden PCR reakcióhoz optimalizálni kell. - Az optimális primerkoncentráció 0,1 0,5 µm között van. A magasabb koncentráció csökkenti a specificitást. A primerek megtervezését a célszekvencia ismeretében számítógépes programok segítik. Az optimális primerhossz 18-28 bp, C-G tartalma 40-60% között van és legalább az egyik végén C/G-re végződik. A hossz és C-G tartalom alapján kiszámítható az olvadási hőmérséklet, amely az annealing hőmérséklet megválasztásában ad támpontot. A QF-PCR módszer a PCR továbbfejlesztett változata. Előnye, hogy érzékenysége mintegy 1000-szerese a hagyományos PCR vizsgálatnak, a PCR termékek méretének pontos meghatározására alkalmas, valamint multiplex vizsgálat esetén könnyebben kiértékelhető, mint a hagyományos PCR [69]. 1993-ban Du és munkatársai írták le a PCR termékek szekvenálóval történő gyors és pontos meghatározását [31]. Mansfield és munkatársa 1993-ban ehhez fluoreszcensen jelölt primereket használt, amely az érzékenységet lényegesen megnövelte [74], ugyanabban az évben beszámoltak az első automatizált mikroszatellita tesztről [75]. Adinolfi és Mansfield munkacsoportja 1995-ben számolt be a módszer alkalmazásáról a 21-es trisomia kimutatása céljára [3]. 1994-ben Pertl és mtsai a 21-es trisomia 24 órán belüli meghatározását írták le magzatvízből, magzati szövetből és magzati vérből QF-PCR módszerrel [98]. Adinolfi és mtsai 1995-ben már 2-2 primer párt használtak a 18-as és 21-es trisomiák kimutatására, a módszer megbízhatóságának növelését érték így el [95]. Findlay és mtsai 1995-ben blastomerákból a nemi chromosomák és a cystás fibrosis deltaf508 mutáció QF-PCR módszerrel való meghatározásáról számoltak be [40], majd 1998-ban az allélvesztés (ADO) problémáját elemezték munkájukban [39]. 1998-ban klinikánkon Tóth és mtsai a 13-as trisomia magzatvízből történő QF-PCR módszerrel való meghatározását írták le [121], ezt követte a 21-es trisomia és a 18-as trisomia hasonló módszerrel való maghatározása [120]. Findlay és mtsai 1998-ban a leggyakoribb trisomiák, a 21-es, 18-as és 13-as meghatározásának lehetőségét a prenatalis diagnosztikában és preimplantatios diagnosztikában elemezték [41]. 1999-ben Pertl és mtsai 247 chorionboholyminta vizsgálata során sem téves pozitív, sem téves negatív eredményt nem kaptak a QF-PCR vizsgálatok során. A FISH módszernél megbízhatóbb 14

1. BEVEZETÉS eljárásnak tekintik, sürgős esetben a cytogenetikai vizsgálat kiváltására is alkalmas módszernek javasolják [96]. 2001-ben Ogilvie munkacsoportja vezette be kifejezetten diagnosztikus célra a QF-PCR módszert a 21-es, 18-as és 13-as trisomia prenatalis kimutatására. Tanulmányukban 1148 magzatvíz- és 188 chorionboholy vizsgálatáról számolnak be. A vizsgálatok 98%-a volt informatív, 22 esetben (2%) a vizsgálat nem informatív eredménnyel járt. Álnegatív és álpozitív vizsgálatról nem számoltak be. A QF-PCR vizsgálatot önállóan javasolják az anyai életkor miatt végzett prenatalis diagnosztika során [73]. 2003-ban Leung és mtsai elemezték 235 magzatvízminta párhuzamos QF-PCR és cytogenetikai vizsgálata, valamint 1526 cytogenetikai vizsgálat indikációjának és eredményeinek retrospektív feldolgozásával azt, hogy milyen indikációk esetén pótolhatja a QF-PCR vizsgálat a cytogenetikai vizsgálatot. Eredményeik alapján a QF-PCR vizsgálatot alkalmasnak találták arra, hogy az anyai szérum marker szűrés pozitív eredménye esetén helyettesítse a cytogenetikai vizsgálatot [63]. Érzékenysége miatt a QF-PCR vizsgálat alkalmas egyetlen sejt vizsgálatára (single-cell PCR), amelynek a preimplantatiós genetikai diagnosztikában [48], valamint az anyai vérből dúsított, majd mikromanipulált magzati sejtek vizsgálatában van jelentőssége [10]. 2002-ben beszámoltunk a preimplantatiós genetika diagnosztika területén klinikánkon elért sikereinkről. A QF-PCR módszerrel chromosoma-specifikus ismétlődő úgynevezett short tandem repeat (STR) DNS szekvenciákat vizsgálunk. Az STR-eket az irodalom microsatellita néven is említi. Az STR-ek polimorfizmust mutatnak, tehát egyénenként változó hosszúságúak attól függően, hogy hányszor ismétlődik egy adott tri-, tetra-, vagy pentanukleotid egység [15,122]. A mendeli szabályok szerint öröklődnek, tehát az egyik allél anyai, a másik pedig apai eredetű. Az STR-ek első leírása Edwards és munkatársai nevéhez fűződik 1991-ben [33]. A DNS mintából a PCR amplifikációt fluoreszcens jelöléssel ellátott primerekkel végezzük, és a keletkezett PCR termékeket automata szekvenálóval mutatjuk ki. Az automata szekvenáló lehetővé teszi a PCR termékek méretének pontos meghatározását és mennyiségének összehasonlítását. Normál heterozygota (két különböző hosszúságú STR allélt hordozó) egyének esetében a vizsgálat során két eltérő méretű terméknek megfelelő csúcs látható, amelyek közel azonos magasságúak. Az STR-ek PCR amplifikációjának szemléltetése a 4. ábrán látható. 15

1. BEVEZETÉS AATG 7 ismétlődő egység 8 ismétlődő egység 4. ábra: Az STR-ek ismétlődő tetranukleotid egységek. A piros és kék négyszögek a példaként vett AATG ismétlődő szekvenciákat jelzik. A kék nyilak a primereket jelzik, a zöld csillag a forward primer fluoreszcens jelölésére utal. A trisomiás egyénektől származó minta vizsgálata során három azonos méretű csúcs látható (triallélikus), vagy csak két csúcs, amelyek közül azonban az egyik kétszer akkora, mint a másik (diallélikus). Ezt a 5. ábra szemlélteti. a. b. c. 5. ábra: a: normál mintázat esetén két csúcs 1:1 aránya figyelhető meg b: triallélikus mintázat esetén három csúcs 1:1:1 aránya figyelhető meg c: diallélikus mintázat esetén két csúcs 2:1 aránya figyelhető meg Az STR markerek homozygotasága esetén csak egy csúcs figyelhető meg, ekkor neminformatív vizsgálati eredményről beszélünk. Ha egyszerre több marker vizsgálatát végezzük el, a nem-informatív eredmények aránya csökken. A markerek vizsgálata szimultán módon történhet multiplex PCR vizsgálat során. A QF-PCR módszer alkalmazása során figyelték meg az allélvesztés (allele drop-out - ADO) jelenségét [39,47]. Az allélvesztés kis kiindulási mennyiségű DNS-ből történő heterozygota locusok PCR amplifikációja során figyelhető meg. A preferenciális amplifikáció során a primerek jobban kötődnek a heterozygota allélpár egyik tagjához, 16

1. BEVEZETÉS és emiatt ezen allél PCR terméke lényegesen nagyobb mennyiségben szaporodik fel, mint az allélpárjáé. Amennyiben a preferenciális amplifikáció során a két termék mennyisége közötti különbség oly nagy mértékű, hogy az egyik termék nem detektálható, allélvesztésről beszélünk [39]. Az allélvesztés jelensége monogénes betegségek PCR diagnosztikája esetén a téves diagnózishoz vezethet, az STR markerek vizsgálata esetén pedig a nem informatív esetek számát emelheti. Az allélvesztés előfordulása függ a kiindulási DNS kópiaszámtól, illetve az izolált DNS mintában található szennyezőanyagoktól, amelyek gátolhatják a PCR-t [39,47]. A QF-PCR vizsgálathoz minimális mennyiségű minta szükséges, 1 ml magzatvízből, vagy 1-2 chorionboholyból izolált DNS elegendő. Lényegesen gyorsabb, mint a FISH vizsgálat, eredménye akár 4 órával a mintavétel után készen lehet, és mivel a módszer automatizálható, nagy mennyiségű minta gyors vizsgálatára alkalmas [55]. Klinikánk genetikai laboratóriumában a világon az elsők között alkalmaztuk rutinszerűen a módszert chromosoma-rendellenességek kimutatására. Az elmúlt években a QF-PCR módszer a cytogenetikai vizsgálat fontos kiegészítőjévé vált, és értekezésemben a módszer alkalmazása során nyert tapasztalataimat dolgozom fel. 1.3.2.3. Comparatív genomiális hybridizáció (CGH) A CGH módszert 1992 óta alkalmazzák chromosoma-rendellenességek kimutatására, különösen a tumorgenetika területén [60]. Az eljárás során DNS-t izolálnak a vizsgálandó mintából, valamint egy egészséges kontroll mintából. A két mintát ezt követően zöld és piros (FITC és Texas Red) fluorochrommal jelölik és egy tárgylemezre fixált referencia chromosoma-preparátumhoz hybridizálják egyenlő mennyiségben összekeverve. A hybridizáció után a mikroszkópos kép számítógépes kiértékelése történik, amely során az adott chromosoma hiánya/deléciója esetén a kontroll minta színének irányába történő eltolódás, többlet/duplikáció esetén a vizsgálandó minta színének irányába történő eltolódás jelez (6. ábra). A deléciók, illetve duplikációk kimutathatóságának mérete 1 Mb, és a vizsgált szövet sejtjeinek legalább 50%-ában jelen kell lennie az eltérésnek ahhoz, hogy a CGH módszerrel kimutatható legyen. 17

1. BEVEZETÉS 6. ábra: 13-as trisomiára jellemző kép CGH vizsgálat során. A vizsgálandó minta zöld jelölésének irányába történő színeltolódás chromosoma többletre utal. Forrás: Marton T. és mtsai 2001. A microarray technológiával kombinált CGH vizsgálat előnye, hogy a cytogenetikai vizsgálathoz hasonlóan valamennyi chromosoma szimultán vizsgálatára alkalmazható és nem igényel élő, osztódó sejteket, tehát akár archivált anyag vizsgálatára is alkalmas. Hátránya a költségessége és munkaigényessége. Főként ezen utóbbi okok miatt a prenatális diagnosztikában eddig nem terjedt el és kevés közlemény jelent meg a módszer prenatális alkalmazásával kapcsolatban [29,67]. 1.3.2.4. Real-time PCR A real-time PCR módszer segítségével a keletkezett PCR termékek mennyisége minden ciklusban folyamatosan vizsgálható. A hagyományos PCR módszerrel szembeni előnye a gyorsasága, teljes automatizálhatósága és az, hogy a keletkezett termékek abszolút quantitatív vizsgálata végezhető el általa. Az utóbbi években a módszer széles körben elterjedt a génexpressziós vizsgálatokban, illetve pontmutációk kimutatásában [5]. 2002-ben jelent meg az első közlemény a real-time PCR alkalmazásáról 21-es trisomia kimutatása céljára [138]. A módszer alapja a 21 chromosoma Down syndroma kritikus régiójában (DSCR) lévő amyloid gén quantitatív amplifikációja egy referencia génnel, a 12. chromosomán lokalizált glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenáz (GADPH) génnel párhuzamosan. A vizsgálat során a küszöb-ciklusszám változásával 10 esetből 9 esetben mutatták ki a 21-es trisomiát és 11 euploid kontrollból 9 esetben mutatták ki az euploidiát. Egy másik vizsgálat során 6 különböző, a 21-es chromosomán található pontmutáció (SNP) olvadáspont analízisét végezték el 52 esetben 21-es trisomiás, és 59 negatív kontroll mintán. A quantitatív analízis során 52 pozitív esetből 50-ben volt kimutatható a 21-es trisomia, míg az 59 negatív kontrollból 49 volt egyértelműen negatív. Bár a módszer még további vizsgálatokat igényel, adaptálható egyéb chromosomák vizsgálatára is, és egy teljesen automatizálható, egyszerű diagnosztikus módszer lehetőségét hordozza magában. A módszer érzékenysége miatt alkalmazható a 18

1. BEVEZETÉS preimplantatiós genetikai diagnosztikában, illetve alkalmas az anyai szérumból izolált magzati DNS vizsgálatára is, amely a nem-invazív prenatális genetikai diagnosztika legígéretesebb területe. 19

2. CÉLKITŰZÉSEK 2. Célkitűzések 1. Az QF-PCR módszer megbízhatóságának vizsgálata a gyakori chromosomarendellenességek magzatvízsejtekből és chorionboholymintákból történő kimutatásában. a. A normál minták vizsgálati eredményeinek értékelése. b. A 21-es, 18-as és 13-as trisomia kimutatásának elemzése. c. A magzati nemmeghatározás eredményeinek áttekintése. d. A mozaikosságnak a QF-PCR vizsgálat eredményeire gyakorolt hatása. e. Az anyai vérrel történő kontaminációnak a QF-PCR vizsgálat eredményeire gyakorolt hatása. 2. Az alkalmazott STR markerek alléleloszlásának vizsgálata klinikánk beteganyagában. 3. Azon indikációs területek meghatározása, amelyben a magzatvíz/chorionboholy minták QF-PCR vizsgálata biztonságosan alkalmazható, mint önálló vizsgálat. 4. A QF-PCR vizsgálat egyéb alkalmazási lehetőségeinek vizsgálata. a. A QF-PCR módszer alkalmazhatóságának vizsgálata a számfeletti chromosomaszerelvény eredetének meghatározására triploidiában. b. A QF-PCR módszer alkalmazhatóságának vizsgálata uniparentalis disomia eseteiben. 5. A allélvesztés (ADO) csökkentésére alkalmas lehetőségek vizsgálata 20

3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3. Anyag és módszer 3.1. Chorionboholyminták A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Genetikai Tanácsadásán 2001. januártól 2004. júliusig 146 terhesnél végzett chorionboholymintavétel során nyert magzati mintán végeztünk párhuzamos cytogenetikai és QF-PCR vizsgálatot. Az összesen 20-40 µg mintából 1-2 chorionbolyhot DNS izolálás céljára, a többit cytogenetikai vizsgálatra használtunk fel. A két módszert egymástól függetlenül értékeltük ki, majd az eredményeket összehasonlítottuk. A terhesek átlagéletkora a chorionboholy mintavétel időpontjában 32,1 ± 2,5 év, az átlagos gestatiós kor 11,3 ± 1,1 hét volt. A terhesek a beavatkozás és a vizsgálat előtt részletes tájékoztatást követően a beavatkozásra vonatkozó Kérelem és beleegyező nyilatkozat -ot írtak alá. 3.2. Magzatvízminták A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Genetikai Tanácsadásán 1999. januártól 2004. júliusig 4850 terhesnél végzett 4875 amniocentesis során nyert magzatvízmintán (25 ikerterhesség) végeztünk cytogenetikai vizsgálatot és QF-PCR vizsgálatot. Az összesen 10-12 ml magzatvízből 1,5 ml-t DNS izolálás céljára, a többit cytogenetikai vizsgálatra használtunk fel. A két módszert egymástól függetlenül értékeltük ki, majd az eredményeket összehasonlítottuk. A terhesek átlagéletkora az amniocentesis időpontjában 36,1 ± 2,5 év, az átlagos gestatiós kor 18,2 ± 2,7 hét volt. A terhesek a beavatkozás és a vizsgálat előtt részletes tájékoztatást követően a beavatkozásra vonatkozó Kérelem és beleegyező nyilatkozat -ot írtak alá. 3.3. Műszerek Molekuláris genetikai vizsgálat: ABI 310 Genetic Analyzer Applied Biosystems, Foster City, CA. USA GeneAmp 9700 PCR System Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Genetic Analyzer kapilláris 47cm X 50µm Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Laminar Airflow Series 3 Nuaire Plymouth, MN. USA Mikrocentrifuga Microfuge E Beckman Instruments, Providence, RI. USA 21

3. ANYAG ÉS MÓDSZER Mikrocentrifuga Z 160 M Pipetták Proline 10, 50, 200, 1000 Rázógép REAX 2000 Vízfürdő Dri-Block DD-2A Hermle, Gosheim, Germany Biohit, Helsinki, Finland Heidolph, Schwabach, Germany Techne, Cambridge, UK Cytogenetikai vizsgálat: IG150 CO 2 Inkubátor Jouan, Winchester, VA. USA MSC 9 Laminar Airflow Jouan, Winchester, VA. USA 4-15 Centrifuga Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA Wilovert S invert mikroszkóp Hund Wetzlar, Wetzlar, Germany Leica DMLB mikroszkóp Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany Chantal Chromosome Karyotype Software Leica Imaging AG, Wetzlar, Germany 3. 4. Reagensek Molekuláris genetikai vizsgálat: ABI Prism puffer (EDTÁ-val) AmpliTaq Gold DNS polimeráz dntp Formamid GeneScan 500-TAMRA méretmarker POP4 gél ReadyAmp Genomic Purification System High Pure PCR Template Isolation Kit Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Promega, Madison, WI. USA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Promega, Madison, WI. USA Roche, Mannheim, Germany Cytogenetikai vizsgálat: Chang Medium KCl (0,075 M, GIBCO) Colchicin Methanol (analítikai tisztaságú) Ecetsav (99-100%) Tripszin Irvine Scientific, Santa Ana, CA. USA Invitrogene, Carlsbad, CA, USA Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA Merck KGaA, Darmstadt, Germany Acidum-2 Kft, Debrecen, Hungary Difco Laboratories, Detroit, Mi. USA 22

3. ANYAG ÉS MÓDSZER Giemsa festék Entellan Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA Merck KGaA, Darmstadt, Germany 3. 5. Fluoreszcens jelöléssel ellátott forward és jelöletlen reverse oligonukleotid primerek (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA. USA) Amel A, oligo 24-mer Amel B, oligo, 24-mer D21S11/F1 oligo, 22-mer D21S11/R1 oligo, 22-mer 5 -TET-ccc tgg gct ctg taa aga ata gtg-3 5 atc aga gct taa act ggg aag ctg-3 5 -TET-tgt att agt caa tgt tct cca g-3 5 -ata tgt gag tca att ccc caa g-3 D21S1411/F oligo, 22-mer 5'-TET-tga tga atg cat aga tgg atg g- D21S1411/R oligo, 21-mer D21S1412/F2 oligo, 19-mer D21S1412/R2 oligo, 19-mer D18S51/F1 oligo, 20-mer D18S51/R1 oligo 20-mer D18S851F oligo-24-mer D18S851 R oligo-20-mer D13 S631/F1 oligo, 20-mer D13 S631/R1 oligo, 19-mer D13S258/F1 oligo, 20-mer D13S258/R1 oligo, 21-mer 5'-cta tgg gcc cag aaa aca act-3' 5 -TET-cgg agg ttg cag tga gtt g-3 5 -ggg aag gct atg gag gag a-3 5 -FAM-caa acc cga cta cca gca ac-3 5 -gag cca tgt tca tgc cac tg-3 5'-FAM-cac aca caa aca tct ctt tct atc-3' 5'-tta tga agc agt gat gcc aa-3' 5 -HEX-ggc-aac-aag-agc-aaa-act-ct-3 5 -tag-ccc-tca-cca-tga-ttg-g-3 5 -HEX-acc tgc caa att tta cca gg-3 5 -gac-aga-gag-agg-gaa-taa-acc-3 3. 6. Felhasznált számítógépes programok Excel 2002 Software Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA 23

3. ANYAG ÉS MÓDSZER SPSS for Windows v. 11.0.0. SPSS Corporation, USA GeneScan Analysis Software version 2.1 - Applied Biosystems, Foster City, CA. USA 3. 7. Módszerek 3.7.1. Cytogenetikai vizsgálat Klinikánk cytogenetikai laboratóriumában a cytogenetikai vizsgálatokat a magzatvízsejtek in situ eljárással történő tenyésztését követően végezzük el. Az eljárás során 10 ml magzatvízmintát 1000 G fordulatszámon 10 percig centrifugálunk, majd az üledéket Chang B+C tápfolyadékban reszuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót petricsészékbe pipettáztuk, amelyek alján 22X22 mm-es fedőlemezek vannak. A petricsészéket 37 C-on 5%-os CO 2 koncentráció mellett inkubáljuk 6 napig, majd a tápfolyadék cseréje következik. Ezt követően a tápfolyadék kétnaponta történő cseréjével további inkubálás következik mindaddig, amíg invert-mikroszkóppal vizsgálva megfelelő mitózisokat nem látunk. A metafázisokra 0,1 mg/ml colchicint cseppentve, majd 37 C-on 1,5 óráig inkubálva a sejtosztódást metafázisban blokkoljuk. A sejteket 0,075 mmol-os KCl-oldattal 37 C-on 12-20 percig inkubálva hypotonizáljuk, majd methanol-ecetsav 3:1 arányú keverékével fixáljuk. 24 órás száradást követően ASG sávozást végzünk 5%-os tripszines emésztést követő Giemsa festéssel. A fedőlemezeket entellánnal tárgylemezre montírozzuk, majd fénymikroszkóppal 100X-os nagyítással értékeljük. A kiértékelés során 15-20, más-más kolóniából származó metafázis vizsgálatát végezzük el. 3.7.2. QF-PCR vizsgálat A QF-PCR módszerrel a 3.5. pontban felsorolt STR markereket vizsgáltuk. A Genomic Database-ből [125,126] kiválasztott markerek alkalmazása 1997 óta történik klinikánk genetikai laboratóriumában. A nemmeghatározás az amelogenin gén amplifikációjával történt. A gén az X és az Y chromosomán helyezkedik el (Xp22.31-p22.1 és Yp11.2), de az Y chromosomán 6 bázispárral hosszabb formában, azaz amikor csak egy 103 bp hosszúságú terméket mutatunk ki, a magzat neme leány, amennyiben a 109 bp hosszúságú termék is kimutatható, a magzat neme fiú. 24

3. ANYAG ÉS MÓDSZER Három, a 21-es chromosomán, valamint két-két, a 18-as és 13-as chromosomán elhelyezkedő STR-t vizsgáltunk. A markerek chromosomalis lokalizációját az 1. táblázatban foglalom össze. 1. táblázat: A vizsgált markerek chromosomalis lokalizációja Marker Chromosomalis lokalizáció D21S11 21q21-21q21 D21S1411 21pter-21qter D21S1412 21pter-21qter D18S51 18q21.33-18q21.33 D18S851 18pter-18qter D13S258 13q21.2-13q31 D13S631 13q31-13q32 3.7.2.1. DNS izolálás chorionboholymintából A DNS izolálását két különböző módszerrel végeztük. 1998-2004 között a DNS izolálást ReadyAmp kit-tel, a használati útmutató szerint, módosításokkal végeztük. A natív chorionboholymintából egy-két bolyhot eltávolítottunk, majd 1 ml desztillált vízzel átmostuk és lecentrifugáltuk. Ezt követően 500 µl desztillált vízzel szobahőmérsékleten 10 percig forgattuk, majd újabb centrifugálás következett 5 percig 8000 rpm-mel. A felülúszó eltávolítása után az üledéket 100 µl resinben szuszpendáltuk, majd 20 percig 56 C-on, majd keverés után 8 percig 95 C-on inkubáltuk. Ezt 2 perces centrifugálás követte 8000 rpm-en. Az izolált DNS a felülúszóban található. Későbbi felhasználás esetén a minta 4 C-on tárolható és felhasználás előtt lecentrifugálandó. 2004-től a High Pure PCR Template Isolation Kit-et alkalmaztuk a használati útmutató szerint, módosításokkal. Az amniocentesis során nyert 10-12 ml minta 1,5 ml-es alliquotját Eppendorf csőbe pipettáztuk, majd éjszakára 200 µl lízis puffer és 40 µl proteináz K oldattal 55 C-on inkubáltuk. A további lépések a használati útmutató szerint történtek, a DNS-t 60 µl pufferben oldottuk fel. 25