Neuronok előkészítése funkcionális vizsgálatokra. Az alkalmazható technikák előnyei és hátrányai Sejtszintű elektrofiziológia 1.: csatornák funkcionális Sejtszintű elektrofiziológia 2.: izolált/sejtkultúrában fenntartott neuronok Szelet elektrofiziológia 1.: intakt neuronok ionáramainak Szelet imaging: nagyobb lokális hálózatok Nagyobb agyi struktúrák : ferde megvilágítás (IR-LED) 2012.11.27. Pál Balázs Neuronok izolálása I Az agy kipreparálása A megfelelő agyterület elkülönítése A funkcionális mérések és a preparálás mesterséges agyfolyadékban történnek (artificial Cerebro Spinal Fluid acsf). Az acsf a liquor ionösszetételét utánozza. A sejtek tényleges izolálása: Általában egy kombinált enzimatikus emésztés és ezt követő mechanikai szétválasztás Neuronok izolálása II Enzimatikus kezelés (fehérjék részleges hasítása; a protokoll laboratóriumonként változhat) pl.: Collagenase/pronase (papain) Időtartam: 20-50 perc Hőmérséklet: 31 C Folyamatos oxigenizáció Az enzimatikus emésztés leállítása (oldatcsere/ enzim inhibitor) Neuronok izolálása III Festetlen minták mikroszkópos Az enzim kezelés után a sejteket nagyon óvatos mechanikai kezeléssel választjuk el egymástól. A neuronok kiülepítése A kitapadást a poli-d-lysinnel bevont fedőlemez használata segítheti A neuronok vizualizálásához fázis kontraszt mikroszkópot használunk. (Vagy differenciál interferencia contrast mikroszkópiát.) Fény mikroszkópia Fázis kontraszt mikroszkópia Nomarsky optika (DIC) forrása: Animal Physiology Mechanisms of adaptation 1
Előnyök és hátrányok Idegsejt tenyészetek létrehozása Előnyök: Kisebb eszközigény Nem igényel nagy kézügyességet és gyakorlatot Hátrányok: enzim kezelés csatorna és receptor fehérjék sérülhetnek A szövettani szerkezet NEM megtartott, a neuronok morfológiája is megváltozik Az egyes idegsejt-típusok elkülönítése is nehézzé válik 1. Az idegsejtek izolálása a fentiek szerint 2. Az izolált sejtek életbentartása sejttenyészeti körülmények közt 3. A neuronok tenyésztésénél segíthet: NGF ASZTROCITÁkkal együtt tenyésztés - KOKULTÚRA Idegsejt tenyészetek II KOKULTÚRA Az asztrociták egy ágyat képeznek melyre ülepítve az idegsejtek, jelentősen növelhető a neuronok túlélése Az asztrociták osztódnak a sejttenyészeti körülmények közt, az idegsejtek viszont nem. A gliasejtek osztódását ezért le kell állítani amikor a monolayer kész fluoro-dezoxiuridinnel (FdUR). Glia sejt marker : GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) Neuron marker : Beta III tubulin forrás: RD systems Autaptikus kultúra Előnyök és hátrányok Előnyök: folyamatos idegsejt ellátást biztosíthat funkcionális kísérletekhez Kammermeier P J, Worley P F PNAS 2007;104:6055-6060 Hátrányok: A háttér asztrocita tenyészetet folyamatosan fenttartani nem könnyű. Drága a sejttenyésztési körülmények biztosítása miatt. A tenyészet befertőződésére mindig figyelni kell. 2007 by National Academy of Sciences 2
Organotópiás szelet Előnyök Krónikusan fenntartható és kezelhető Az eredeti hálózatok részben megőrzöttek Hátrányok A gliasejtek túlnövik a neuronokat Felbomlik a hálózatok eredeti struktúrája Sejtszintű elektrofiziológia 1.: csatornák funkcionális Sejtszintű elektrofiziológia 2.: izolált/sejtkultúrában fenntartott neuronok Szelet elektrofiziológia 1.: intakt neuronok ionáramainak Szelet imaging: nagyobb lokális hálózatok Nagyobb agyi struktúrák : ferde megvilágítás (IR-LED) A vékony szelet preparátum Patch-clamp mérések csak izolált neuronokon végezhetőek, melyek sejtmembránja tiszta, könnyen hozzáférhető Vagy mégsem...? A preparálás legfontosabb lépései Az agy (adott agyterület) kipreparálása Az agy/agyterület leragasztása (a szeleteléshez) 200-400 mikrométer vastag agyszeletek készítése (vibrotómmal) A szeleteket 30-60 percig 37 C-on inkubáljuk majd szobahőmérsékleten tartjuk a mérés megkezdéséig Bert Sakmann Erwin Neher Artificial Cerebro Spinal Fluid (acsf) A CSF ionösszetételét utánozza Emelt glükóz koncentráció a neuronok energiaigényének biztosítása érdekében PH bikarbonát puffer rendszer (folyamatos buborékoltatás karbogénnel; 5% CO2, 95% O2 ) Folyamatos oxigenizálás (carbogen) Hőmérséklet Ozmolaritás 3
M-current amplitude (pa) 2012.11.27. Vibráló mikrotóm (vibrotóm) A szeletek életben tartásához használt kamra -20 mv -20 mv A 55 50 B -60 mv 45 +/+ control 40 35 *** XE991 30 0 pa 25 20 15 C 50 pa 200 ms 20 pa 10 5 -/- 0 +/+ n = 17 -/- n = 8 0 pa Biocitin + immun jelölés Funkcionális és fehérje lokalizációs adatok ugyanazon neuronról. Spontán posztszinaptikus áramok (AP-függő neurotranszmitterfelszabadulás is) Miniatűr posztszinaptikus áramok (csak spontán neurotranszmitterfelszabadulás) 4
Ic. Ca koncentráció mérés Kalciumkoncentrációfüggő fluoreszcens festék bejuttatása (termeltetése) a sejtekbe(n) Fluoreszcens video mikroszkópia (CCD kamera) Ic. Ca koncentráció mérés (agyszeletben) Kalciumjelek és spontán tüzelés párhuzamos Sejtszintű elektrofiziológia 1.: csatornák funkcionális Sejtszintű elektrofiziológia 2.: izolált/sejtkultúrában fenntartott neuronok Szelet elektrofiziológia 1.: intakt neuronok ionáramainak Szelet imaging: nagyobb lokális hálózatok Nagyobb agyi struktúrák : ferde megvilágítás (IR-LED) 5