Daganat immunterápia molekuláris markereinek tanulmányozása biofizikai módszerekkel. Áramlási és képalkotó citometria Szöllősi János, Vereb György Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Orvos- és Egészségtudományi Centrum DEBRECENI EGYETEM Debrecen, 2007
Szöllősi János Nagy Péter Vereb György Horváth Gábor Roszik János rekk Zsuzsanna Lisboa Duarte Barok Márk Sejtanalitikai Munkacsoport árász Andrea Tóth Enikő Ujlaky-Nagy László Szöőr Árpád Fábián Ákos Friedländer Elza Szabó Ágnes
ÉPELEMZŐ CITOMETRIA CLSM CORE FACILITY Gerjesztés: Ar ion 350-360 Ar ion 458 / 477 / 488 / 514 HeNe 543 HeNe 633 Emisszió (LSM): Emisszió (FCS): 3 PMT 1 dióda array (spektrális kép) 2 APD
ÁRAMLÁSI CITOMETRIA NAGY SEBESSÉGŰ SEJTVÁLOGATÁS, MEDIUM/HIGH THROUGHPUT MÉRÉS BD FACSDiVa BD FACSArray Gerjesztések: Ar ion 350-360 / 488 Dióda 532 HeNe 633 6 detektor Gerjesztések: Dióda 532 Dióda 635 6 detektor 96-well plate formátum
IMAGE itapadó, kitapasztott Metszetek Alkalmazások Immunfluoreszcencia Sejtek FLOW szuszpenzióban kvantifikálás onfokális mód Z-irányú feloldás 3D rekonstrukció szubcelluláris lokalizáció Dekonvolúció reflexiós / transzmissziós kép Spektrális képalkotás Nagy sejtszám jó statisztika Sejtválogatás Polarizáció mérése olokalizáció FRET
PÉLDÁ AZ ALALMAZOTT MÓDSZERERE Módszerek: Immunfluoreszcencia sejteken (flow, image), szövettani metszeteken (image) Szubcelluláris kolokalizáció kvantitatív elemzése Molekuláris asszociácók vizsgálata FRET-tel egész sejt átlagban és mikroszkópos feloldással Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia Fluoreszcens fúziós fehérjék előállítása és transzfekciója vantitatív digitális képelemzés In vitro proliferációs esszék és gyógyszer-jelölt tesztelés Xenograft tumormodellek (a Bőrklinikával együttműködésben), tumor szubklónok, keringő és disszeminált tumoresejtek vizsgálata Bemutatott témakör: Receptor-specifikus immunterápiák és kis molekulájú inhibitorok - Herceptin/trastuzumab kezelés, rezisztencia
Az EGF (ErbB) receptor család kinázai EGF TGFa Amphiregulin b-cellulin HB-EGF Epiregulin 1 2 3 4 Heregulins NRG2 NRG3 Heregulins b-cellulin Magas mitogenikus potenciállal rendelkező ErbB dimerek 1 1 2 2 1 3 1 2 2 3 Növekvő mitogenikus aktivitás
Az ErbB2 jelentősége tumorokban Az emlődaganatok kb. 30 %-ában rossz prognózis Mutáció vagy amplifikáció
Az ErbB mint terápiás célpont Antitest Chaperon Antagonisták ináz inhibitorok Toxin Expresszió gátlása TI Hsp90 Receptor Internalizáció, lebontás, Jelátvitel gátlása, Immunválasz fokozása Receptor lebontás Jelátvitel gátlása, lebontás serkentése Sejtpuszítás Protein szintézis gátlás
Az első szolid tumor elleni humanizált antitest: az ErbB2 - specifikus Trastuzumab (Herceptin) Slamon et al., 1987; Carter et al., 1992, Genetech Inc. 30-50% -ban hatásis Primer és szekunder rezisztencia Herceptest pozitivitás 3+ Nagy affinitás és specificitás d = 5nM 95% humán, 5% egér (4D5) evéssé immunogén Hatékony immunválaszt mediál FISH - ErbB2 amplifikáció JIMT-1 Az első in vitro növeszthető trastuzumab rezisztens emlőtumor vonal
Az ErbB2 az ErbB3-mal kolokalizálódik ErbB2 & ErbB3 ErbB2 & ErbB2 ErbB2 & TrfR ( xi, ( x i j i, j x)( yi, j y) C = 1 teljes azonosság C = 2 2 x) ( y y) C = 0 C=0.50 0.75 i j j i j i, j eresztkorreláció számítása C=0.85 teljesen független képek Az egy klaszterben található receptorok egymás molekuláris közelségében vannak-e? C=0.17
Az ErbB1, ErbB2 és ErbB3 molekuláris asszociációi FRET méréssel kimutathatók akceptor ErbB2 donor ErbB1 ErbB2 E=19+1% E=14+1% 1-10 nm ErbB3 E=19+1% Donor Akceptor E E = R 6 0 6 R0 + R 6 0.5 k ex k f k t k f R 0 R
ErbB2 aktiváció vizsgálata: asszociáció mérése FRET-tel akceptor fotoelhalványítás előtt akceptor fotoelhalványítás után I F D( i, j) II F D(i, j ) donor akceptor E (i, j ) = 1 F I D (i, j ) II γ F D(i, j) 0% FRET 19% ref,i γ = F D(i, j ) ref,ii F D(i, j)
Barátságos interaktív program FRET kiértékeléshez ÚJ PROGI
ErbB2 aktiváció vizsgálata: asszociáció mérése FRET-tel donor ( I 0 d+a ) donor ( I 0 d ) 14 12 SBR-3 JIMT-1 FRET (%) + SEM 10 8 6 4 2 akceptor kiégetett akceptor 0 ErbB1-ErbB2 +Trast. +EGF ErbB2-ErbB2 +Trast. SBR-3 sejteken az ErbB1/ErbB2, ill. ErbB2/ErbB2 asszociáció számottevő az ErbB2 homoasszociáció EGF és trastuzumab kezelésre fokozódott JIMT-1 sejteken az ErbB2 hetero- ill. homoasszociációja alacsony EGF és trastuzumab kezelésre nem változott A rezisztencia oka JIMT-1 sejteken az ErbB2 funkcióvesztése?
ErbB2 aktiváció vizsgálata trastuzumab-mikrogyöngyökkel SBR-3 JIMT-1 trastuzumab-gyöngy Aktivált ErbB2 (Ab18) trastuzumab oldat P - ErbB2 fluoreszcencia 160 140 120 100 80 60 40 20 0 trastzumab vantitatív digitális képelemzés TR-gyöngy EGF-gyöngy trastuzumab egész sejt stimlált régió stimulálatlan régió TR-gyöngy EGF-gyöngy SBR-3 JIMT-1 A trastuzumab csökkent kötődése és hatékonysága lehet sztérikus gátlás eredménye Ezt a mikrogyöngyök által biztosított nagy ligandsűrűség és mechanikai hatások képesek legyőzni Az ErbB2 JIMT-1 sejteken is működőképes ihasználható-e ez az ErbB2 leszabályozására?
ErbB2 aktiváció módosítása a citoplazma felől a HSP-90 számos jelátviteli fehérje szerkezetét stabilizálja FRET (%) + SEM 15 12 9 6 3 0 SBR-3 JIMT-1 ontroll 2' 5' 10' 17-AAG FRET (%) + SEM FRET (%) 9 6 3 0 SBR-3 ontroll 2' 5' 10' 17-AAG A HSP-90 az ErbB2-t inaktív állapotban tartja a membránban ErbB2 ErbB2 asszociáció ErbB2 ErbB3 asszociáció Sejtszám 25000 15000 5000 C 50 =0.076 µm C 50 =0.011 µm SBR-3 17-AAG SBR-3 17-AAG +TR JIMT-1 17-AAG JIMT-1 17-AAG + TR -4-3 -2-1 0 1 log (17-AAG, μm) A HSP-90 gátlása ErbB2 aktivációt, internalizációt és proliferáció gátlást okoz, így TR rezisztens tunorok esetén potenciális terápiás módszer lehet
Tumor volume (mm3) In vivo xenograft modell: A trastuzumab kezdetben hatékony 2500 2000 1500 1000 500 0 in vitro rezisztens sejteken is (ADCC mechanizmus) saline trastuzumab suspended trastuzumab continuous trastuzumab 0 14 28 42 56 70 84 98 112 * Days post-inoculation Tumor volume (mm3) 1200 1000 800 600 400 200 0 saline trastuzumab trastuzumab-f(ab')2 0 14 28 42 56 70 84 Days post-inoculation Fiz. só TR TR(fab) 2 TR-susp Fluorescence intensity 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ErbB2 saline continuous trastuzumab suspended trastuzumab trastuzumab F(ab') 2
onklúziók A trastuzumab-rezisztencia oka lehet az ErbB2 homodimerek hiánya Az ErbB2 aktiváhatósága és leszabályozhatósága csökkent A MUC4 és CD44-hialuronsav komplex sztérikus gátlást okozhat A sztérikus gátlás mikrogyöngyökkel legyőzhető, az ErbB2 működőképes A hialuronsav szintézis gátlása fokozza a trastuzumab tumorellenes hatását Egyéb ErbB heterodimerek (pl. ErbB2-ErbB3) szerepe a sejtosztódásban A trastuzumab kezelés ADCC útján in vivo kis tumorméreteknél hatékony in vitro rezisztencia esetén is, valamint csökkenti a keringő tumorsejtek számát akkor is, ha a primer tumor már rezisztens trastuzumabra A jövő: gyógyszer koktélok?