(Plazma) proteins/enzimek Dr. Nagy Tamás Laboratóriumi Medicina Intézet Email: nagy.tamas@pte.hu
Proteins (in general) leggyakoribb szerves molekula a sejtben Kb. 30-50K kódoló gén egyetlen sejtben legalább ~3-5K különféle fehérje Plazmában azonosított fehérjék: ~ 400
Fő funkciók: Szerkezeti Keratin, kollagén, aktin, miozin Transzport Hemoglobin, transzferrin, cöruloplasmin Hormon Inzulin, TSH, ACTH, PTH, GH Jelátvitel Enzim Stb... Intracelluláris fehérjék egészséges ember vérében is megtalálhatók: normális Fiziológiás folyamat, sejtújdonképződés, apoptosis, sejt-anyagcsere során kiszabadulnak a sejtből
Szerkezet Elsődleges: Aminosav sorrend Másodlagos: alfa hélix, béta lemez Harmadlagos: 3-D (végső alakzat, diszulfid hidak, sóhidak, poszt-transzlációs módosulások) Negyedleges: Protein-komplexek, protein alegységek, ko-faktorok
Fehérje mérés Kémiai reakció Biuret, Lowry módszer Festés Bradford módszer (Coomassie) Abszorbció λ = 280 nm (Tyr, Trp), 220 nm (peptid kötés) Aktivitás Enzimek Immunogenitás
ELISA EIA RIA Particle enhanced turbidimetric assay A keresett fehérjét (antigén) agglutináljuk antitesttel fedett latex gyöngyökkel. Az agglutináció mértékét turbidimetriás módszerrel mérjük meg (e.g. 550 nm). FPIA (Fluorescence polarization immunoassay)
Plazma protein elválasztási Kromatográfia technikák Gél (méret-kizárás), HPLC, ion-cserés, immunaffinitás kromatogr. Elektroforézis agaróz gél, cellulóz-acetát, PAGE
Elektroforézis: elv Elektromos tér - ellenállás - +
Szérum protein elektroforézis Albumin α 1 α 2 β γ + -
Albumin 40-60% az összfehérjének máj termeli t ½ =15-19 nap Funkció Onkótikus nyomás Transzport Anti-oxidáns Puffer
Klinikai jelentősség Hiperalbuminaemia: ritka, nincs jelentőssége Hipoalbuminaemia fokozott vesztés (nefrózis szindróma) Csökkent termelés (malnutríció, májelégtelenség) Analbuminaemia Bisalbuminaemia (dimer albumin)
Pre-albumin Tiroxin-kötő protein (transthiretin or TBPA) Komplexet alkot a retinol-binding protein (RBP)-vel Az elektroforézisben az albumin előtt fut A tápláltsági állapot diagnosztikai markere. t ½ =2 nap Negatív akut fázis protein
α 1 -Antitrypsin Proteáz inhibitor, inaktiválja a trypsin-t (és más proteázokat, pl. véralvadási kaszkád egyes elemeit) Hiánya: tüdő emfizéma Liver Cirrózis
Más α 1 -proteinek α 1 -savas glikoprotein (funkciója nem ismert) α 1 -Foetoprotein (AFP) Hepatocelluláris karcinóma prenatális diagnosztika fontos markere emelkedett velőcső záródási rendellenességekben csökkent Down szindrómában
α 2 -Macroglobulin Legnagyob nem-immunoglobulin fehérje a plazmában Proteáz inhibitor Nephrózis szindrómában megemelkedik
(α 2 ) Ceruloplazmin Réz transzport Redox reakcióban vesz részt (Fe 2+ ->Fe 3+ ) Wilson kórban csökken Akut fázis protein
(α 2 ) Haptoglobin hemoglobint megköti (a myoglobint nem) Akut fázis protein Hemolízisben csökken a mennyisége
(β) Transferrin Vas transzport Vashiányban megemelkedik Negatív akut fázis fehérje
β 2 -Microglobulin kis mólsúly (MW=11.8K) a glomerolusokban filtrálódik, de a tubulusok legnagyobb részben reabszorbeálják A vizelet BMG mennyisége a tubuláris funkció indikátora Veseelégtelenségben magasabb a plazma szintje (nincs filtráció) Gyulladásos folyamatokban megemelkedhet Bizonyos malignus betegségekben szintén emelkedett plazma szint mérhető (Multiple Myeloma, Lymphoma)
(β) Complement proteins C3 és C4 a β régióban fut csökkent lehet örökletes betegség következtében, növekedhet gyulladásban, akut fázisban.
γ Régió Immunoglobulin (IgG, IgA, IgM) és C-reaktív protein (CRP) Éles csúcs: paraprotein (monoklonális gammopátia) CRP: jelenleg a legérzékenyebb akut fázis marker gyulladás, trauma, malignitás
Monoklonális gammopátia csökkent albumin Éles csúcs a gamma régióban (ritkán a gamma régión kívül is elhelyezkedhet) Albumin α 1 α 2 β γ
Immunfixáció
Lipoprotein elektroforézis HDL alfa VLDL (pre-beta) LDL (beta) Chilomicron (feltöltés helye) (az ábrázolt mintákban nem látható)
multiples of upper limit 10 5 1 Akut fázis proteinek C-reaktív protein α 1 -Antitrypsin C3 1 2 3 Days 4 5 További akut fázis proteinek: fibrinogén, α 1 -savas glikoprotein, haptoglobin, coeruloplasmin, transzferrin (utóbbi negatív akut f. fehérje) Sepszis: procalcitonin (a calcitonin prekurzora), szepszisben elsősorban a tüdő és a gasztrointesztinum neuroendokrin sejtjeiből szabadul fel.
Plasma enzimek
A plazmaenzimek kimutatása és mérése 1./ Aktivitás mérés (funkcionális teszt) - specifikus szubsztrátok - specialis kémiai mérő rendszerek (reagensek) - specialis mérő műszerek ( spektrofotométerek, kinetikus) - optimalizált feltételek (hőmérséklet, pufferek, stb.) 2./ Izoenzim kimutatás, mérés - eltérő hőérzékenység - eltérő érzékenység a különböző enzimgátlókkal szemben - eltérés az elektroforetikus mobilitásban (az elektroforetikusan elválasztott enzimek detektálása az enzimhisztokémia elve és gyakorlata alapján történik) 3./ Koncentráció mérés - érzékeny immunológiai reakciókkal monoklonális ellenanyagok felhasználásával. 28
Az enzimek aktivitása és/vagy koncentrációja a plazmában (szérumban) 1. Enzimek, amelyek fiziológiás úton kerülnek a véráramba, ahol fontos szerepet töltenek be a szervezet homeosztázisának fenntartásában - csökkent értékek (amikor az enzimet termelő sejtek károsodnak, jelentős diagnosztikus vizsgálatok) - emelkedett értékek (nincs diagnosztikus felhasználhatóságuk) 2. Intracelluláris enzimek, amelyek sejtkárosodáskor és/vagy sejthalálkor kerülnek a keringésbe - csökkent értékek (nincs diagnosztikus felhasználásuk) - emelkedett értékek (jelentős diagnosztikus vizsgálatok) 29
Emelkedett aktivitása és/vagy koncentrációja az intracelluláris enzimeknek a plazmában, ill. szérumban A leggyakoribb okok: 1. Nekrózis vagy súlyos sejtkárosodás. Ez általában oxigénhiány (ischaemia) vagy mérgező anyagok hatására következik be. 2. Fokozott sejt újdonképződéskor. Ez van a fokozott növekedési fázisokban. (pl. emelkedett alkalikus foszfatáz értékek az élet első évében és pubertáskor), vagy szövetregenerációknál (pl. az emelkedett alkalikus foszfatáz értékek azokban a betegekben, akik több csontjuk töréséből gyógyulnak). Ezen kívül a malignus betegségek minden súlyos állapotában. 3. Amikor a sejtekben megnövekedett az enzimek mennyisége, ez az enzimindukció, amely bizonyos betegségek vagy gyógyszerek hatására jöhet létre. 4. Vezetékek elzáródása. Enzimek, amelyek exokrin termékként vannak jelen (pl. amiláz). 30
Néhány enzim féléletideje a plazmában 31
32
Sodium 137 136-146 mmol/l Potassium 3,90 3,80-5,20 mmol/l Glucose 4,16 4,00-7,00 mmol/l Total bilirubin 79,4! 5,0-20,0 umol/l Direct bilirubin 32,1! 1,0-5,0 umol/l Cholesterol 1,54! 4,00-5,60 mmol/l Triglicerid 0,55! 0,80-2,00 mmol/l LDH 466! <450 U/l AST 44 <44 U/l ALT 16 <50 U/l Alkalic phosphatase 110 40-130 U/l Gamma-GT 23 <70 U/l Amylase 128! 28-100 U/l Lipase 70! <60 U/l Cholinesterase 1,17! 5,30-12,90 ku/l Total protein 77,2 66,0-83,0 g/l Albumin 24,3! 35,0-53,0 g/l Protein electrophoresis: Albumin 37,9! 52,0-65,0 % alfa1 2,3 2,0-5,0 % alfa2 5,1 5,0-9,0 % beta 9,5 9,0-13,0 % gamma 45,2! 14,0-20,0 % Extrafraction not present % hscrp 2,50 <5,00 mg/l Prothrombin INR 2,01! 0,90-1,15. WBC total 5,650 4,000-10,000 Giga/l RBC 3,32! 4,50-6,00 T/l MCV 100,0! 80,0-95,0 fl MCH 35,0! 26,0-33,0 pg Trombocyte 65,3! 140,0-440,0 Giga/l Westergren # 37! 0-10 mm/h
Izoenzimek Egy enzim csoport, amely ugyanazt a reakciót katalizálja, viszont strukturálisan, szubsztrát affinitásban, V max és regulatorikus tulajdonságaikban egymástól eltérnek. A gén differenciálódás miatt: hasonló gén különböző produktumai vagy eltérő peptidjei. Ugyanannak a szervezetnek különböző szöveteiben vannak jelen, vagy egyetlen sejtnek szubcelluláris összetevői. 34 34
Izoenzim elektroforézis Máj, izom: 5 (M 4 ) Máj, izom: 4 (HM 3 ) Tüdő, Limfociták: 3 (H 2 M 2 ) VVT, szív: 2 (H 3 M) Szívizom: 1 (H 4 ) - + Normálisan: CK-MB < 5% Makro-CK gyakran fordul elő egészségesekben (CK- MB CK) (CK-BB immunkomplex)
Cardiovaszkuláris markerek: Akut: troponin I, T myoglobin CK CK-MB LDH GOT pro-bnp, BNP Kockázati faktorok: Procalcitonin súlyos szepszis markere koleszterin, HDL, LDL, triglicerid, homocystein, vércukor, Lp(a) (Homocysteine degrades and inhibits the formation of the three main structural components of the artery(collagen, elastin, proteoglycans)). Lp(a) LDL-szerű fehérje, normál funkcója nem ismert, kockázati faktor (hasonlít a plazminogénhez és a tpa-hoz, kompetíciós mechanizmussal csökkenti a fibrinolízis hatékonyságát)
Máj markerek LDH GOT (AST) glutamic oxaloacetic transaminase - aspartate transaminase GPT (ALT) glutamic pyruvic transaminase alanine transaminase γgt gamma-glutamyltransferase ALP alkaline phosphatase De Ritis Ratio: (GOT/GPT) > 2: alcoholic hepatitis < 1: viral hepatitis Bilirubin Pancreas markers Amiláz (szérum és vizelet) makroamiláz: Ig-amiláz komplex, az amiláz plazma fél-életideje megnyúlik (a nagyobb méret miatt nem filtrálódik át a vesén) Lipáz