SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDMÁYK DKTRI ISKLA Doktori (Ph.D.) tézisek A differencia cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia alkalmazása gyógyszervegyületek meghatározásában. Sztereoizomerek vizsgálata HPLC-CD/UV módszerrel BALGHÉ SZETESI ALETTA Témavezető: Dr. Gergely András, C.Sc. Gyógyszerészi Kémiai Intézet Budapest, 2002
A differencia cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia alkalmazása gyógyszervegyületek meghatározásában. Sztereoizomerek vizsgálata HPLC-CD/UV módszerrel Írta: Baloghné Szentesi Aletta Témavezető: Dr. Gergely András, a kémiai tudomány kandidátusa Semmelweis Egyetem, Gyógyszertudományok Doktori Iskola, Budapest, 2002 Program: A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai ÖSSZEFGLALÓ A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia széles körben alkalmazható a gyógyszervegyületek analitikájában. A CD spektroszkópia analitikai alkalmazásának egyik legfontosabb előnye a módszer elvéből következő ún. belső szelektivitás, amely lehetővé teszi az optikailag aktív abszorpciós sávval rendelkező királis molekulák szelektív vizsgálatát. A közvetlen CD spektroszkópiás módszerek mellett számos új, CD spektroszkópián alapuló eljárást fejlesztettek ki a királis gyógyszervegyületek vizsgálatára és meghatározására. A kiroptikai analízis egyik legdinamikusabban fejlődő területe a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztást követő CD, valamint szimultán kettős CD/UV spektroszkópiás detektálás. Célkitűzéseink között szerepelt új CD spektroszkópiás eljárások kidolgozása, valamint ezen módszerek gyógyszeranalitikai alkalmazásának tanulmányozása. A doktori munka keretében a ketocsoport oximképzésén alapuló differencia CD spektroszkópiás módszert dolgoztunk ki 4-3-ketoszteroidok és 6-keto-morfinszármazékok szelektív és érzékeny meghatározására. Az oximképzési reakció során előállított E és Z oxim-izomerek moláris CD és UV spektroszkópiás paramétereit a HPLC-CD/UV módszer alkalmazásával határoztuk meg az izomerek izolálása nélkül. Szimultán kettős CD/UV detektálást alkalmazva nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert dolgoztunk ki spirociklusos piridopiridazin vegyületek sztereokémai tulajdonságainak vizsgálatára. A vizsgált piridopiridazin sztereoizomerek enantiomer viszonyát egy új, általunk bevezetett módszerrel, az ellipticitás-abszorbancia hányados spektrumok alapján igazoltuk. 2
Application of difference circular dichroism (CD) spectroscopy for determination of pharmaceutical compounds. Analysis of stereoisomers by the HPLC-CD/UV method Aletta Balogh-Szentesi Tutor: András Gergely, C.Sc. Semmelweis University, Doctoral School of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences Budapest, 2002 Programme: Modern trends in pharmaceutical scientific research SUMMARY Circular dichroism (CD) spectroscopy is gaining an increasing importance in pharmaceutical analysis. ne of the main advantages of the CD spectroscopic method is its inherent selectivity, which provides the selective analysis of chiral molecules possessing optically active absorbance bands. In addition to direct CD spectroscopic methods, several new procedures have been developed based on CD spectroscopy for the analysis and determination of pharmaceutical compounds in the past few years. ne of the most progressive fields of chiroptical analysis is the combination of high performance liquid chromatographic separation and CD spectroscopy and the application of simultaneous dual CD/UV detection. The aim of our research work was to work out new procedures based on CD and CD related techniques and to investigate the application of these methods in pharmaceutical analysis. This work presents a new, selective and sensitive difference CD spectroscopic method based on oxime formation of the keto group for the determination of 4-3-ketosteroids and 6-keto-morphinans. Molar CD and UV spectral parameters of E and Z oxime isomers, produced in the course of oxime formation reaction, have been determined by HPLC separation and simultaneous dual CD and UV detection, without isolation of the isomers. The stereochemistry of spirocyclic pyridopyridazine compounds has been investigated by simultaneous dual CD and UV spectroscopy following HPLC separation. The enantiomeric relationship of the pyridopyridazine stereoisomers has been proved by the application of ellipticity-absorbance ratio spectra in a novel way. 3
1. BEVEZETÉS Az emberi szervezetben lejátszódó biokémiai folyamatok nagyfokú sztereoszelektivitással rendelkeznek. A szervezetbe kerülő exogén anyagok szervezetre gyakorolt hatása tehát jelentősen függ azok térszerkezetétől. A sztereoszelektív folyamatok megismerése különösen fontos feladat a terápiás vagy diagnosztikai céllal alkalmazott gyógyszervegyületek esetében. A kutatások célja részben a gyógyszerek szervezetre gyakorolt hatásának (farmakodinámia), részben a gyógyszerek szervezeten belüli sorsának (farmakokinetika) vizsgálata. A vegyületek térszerkezetét alapvetően a konfigurációs és a konformációs izoméria határozza meg, így az ellentétes konfigurációjú gyógyszermolekulák viselkedésének tanulmányozása napjainkban a gyógyszerkutatás legtöbb területén alapvető és elengedhetetlen feladat. A gyógyszeranalitika egyik legfontosabb és legjobban fejlődő területe az enantiomerek mennyiségének és arányának vizsgálata gyógyszeranyagokban, gyógyszerkészítményekben és biológiai mintákban. Számos tudományos közlemény foglalkozik az enantiomerek elválasztásával és az enantiomer szennyezés meghatározásával. apjainkban az enantiomerek vizsgálatánál jóval kisebb hangsúlyt kap a gyógyszermolekulák cisz-transz vagy geometriai izomereinek tanulmányozása annak ellenére, hogy a geometriai izomerek eltérő biológiai hatékonyságára is számos példát találunk. Doktori munkám során a CD spektroszkópia és a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia CD/UV spektroszkópiával kombinált alkalmazásának lehetőségeit vizsgáltam gyógyszeranyagok szelektív meghatározásában, valamint enantiomerek és geometriai izomerek analízisében. 4
2. CÉLKITŰZÉSEK A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia alkalmazása lehetőséget nyújt a királis, optikailag aktív abszorpciós sávval rendelkező molekulák szelektív vizsgálatára. A közvetlen CD spektroszkópiás módszerek mellett számos új eljárást fejlesztettek ki a királis gyógyszervegyületek vizsgálatára és meghatározására. A doktori munka keretében célul tűztük ki új CD spektroszkópiás eljárások kidolgozását, valamint ezen módszerek gyógyszeranalitikai alkalmazásának tanulmányozását. A differencia CD spektroszkópiás módszer alkalmazását két, terápiás szempontból igen fontos vegyületcsoport, a 4-3-ketoszteroidok és a 6-keto-morfinszármazékok meghatározásánál vizsgáltuk. Az oximképzésen alapuló differencia CD spektroszkópiás módszer kidolgozásának célja a fenti vegyületek meghatározásánál jelenlévő királis komponensek zavaró hatásának kiküszöbölése volt. Az általunk kidolgozott differencia CD spektroszkópiás eljárás a ketocsoportot nem tartalmazó szteroid vegyületekben szennyezésként előforduló 4-3-ketoszteroidok meghatározásánál alkalmazható. A 6-keto-morfinszármazékok szelektív meghatározása a gyógyszer- és kábítószeranalitika területén egyaránt fontos feladat, ezért célul tűztük ki a differencia CD spektroszkópiás módszer alkalmazhatóságának vizsgálatát a fenti vegyületek esetében is. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztást követő szimultán kettős CD/UV detektálás lehetőséget nyújtott az általunk előállított oximvegyületek esetében a geometria izomerek eltérő CD és UV spektroszkópiás tulajdonságainak tanulmányozására. Az oxim-izomereket a moláris ellipticitás és moláris abszorpciós spektrumukkal jellemeztük, amelyről az irodalomban igen kevés adat állt rendelkezésünkre. A HPLC-CD/UV technika alkalmazásával egy új, általunk kidolgozott módszerrel, az ellipticitás-abszorbancia hányados spektrumok alapján spirociklusos vegyületek enantiomer viszonyát igazoltuk. A hányados spektrum igen előnyösen alkalmazható, mert az eljárás során nincs szükség az enantiomerek pontos koncentrációjának ismeretére. 5
3. ALKALMAZTT MÓDSZEREK 3.1. CD SPEKTRSZKÓPIA A kiroptikai méréseket Jasco J-720 típusú spektropolariméterrel (Jasco Ltd., Japán) végeztük. A vizsgált királis vegyületek CD spektrumait hullámhossz módban vettük fel. A CD spektroszkópiás meghatározások kidolgozásánál az ellipticitás értékeket az idő függvényében regisztráltuk, amely lehetőséget nyújtott a ketovegyületek oximképzési reakciójának követésére, valamint az ellipticitás értékek pontos meghatározására is. Az adatok feldolgozását az MS Excel 97 és a STATISTICA 5.0 for Windows szoftverek alkalmazásával végeztük el. 3.2. AGYHATÉKYSÁGÚ FLYADÉKKRMATGRÁFIA (HPLC) A vizsgált vegyületek elválasztásánál normál és fordított fázisú akirális, valamint normál fázisú királis folyadékkromatográfiás rendszereket alkalmaztunk. A kromatogramok rögzítésére és kiértékelésére a BRWI 1.2 for Windows kromatográfiás szoftvert használtuk. 3.3. KMBIÁLT CD/UV SPEKTRSZKÓPIA HPLC-CD/UV MÓDSZER A Jasco J-720 típusú spektropolarimétert detektorként is alkalmaztuk a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás vizsgálatoknál. Az elválasztás során a mért királis és abszorpciós jeleket az idő függvényében szimultán detektáltuk. SZIMULTÁ CD ÉS UV SPEKTRUMK FELVÉTELE A folyadékkromatográfiás elválasztások során a CD és UV spektrumokat a kromatográfiás csúcsokban, on-line regisztráltuk (stop-flow módszer). éhány esetben a vegyületek CD és UV spektrumait félpreparatív folyadékkromatográfiás elválasztást követően, off-line vettük fel. 3.4. 1 H-MR SPEKTRSZKÓPIA A 1 H-MR spektroszkópiás méréseket a Semmelweis Egyetem Szerves Vegytani Intézetének Bruker AM 200 típusú MR spektrométerén végeztük el. 6
4. ÚJ TUDMÁYS EREDMÉYEK 4.1. 4-3-KETSZTERIDK ÉS 6-KET-MRFISZÁRMAZÉKK MEGHATÁRZÁSA DIFFERECIA CD SPEKTRSZKÓPIÁS MÓDSZERREL Új, oximképzésen alapuló differencia CD spektroszkópiás módszert dolgoztunk ki 4-3-ketoszteroidok (levonorgesztrel, levonorgesztrel-acetát, noretiszteron, metiltesztoszteron, tesztoszteron-fenilpropionát, nortesztoszteron-fenilpropionát) [1] és 6- keto-morfinszármazékok (oxikodon, hidrokodon, 14-hidroxi-kodeinon) szelektív meghatározására [4]. A meghatározás alapja, hogy a vizsgált vegyületek és a belőlük képzett oximvegyületek CD spektruma jelentős mértékben különbözik. A módszer kidolgozása során meghatároztuk a hidroxilaminnal történő oximképzés optimális körülményeit, a reakció végbemenetelét fordított fázisú HPLC módszerrel és CD spektroszkópiás módszerrel követtük. A továbbiakban tanulmányoztuk, hogy milyen tartományban lineáris az összefüggés a mért differencia ellipticitások és a vizsgált vegyületek koncentrációja között. A mérendő vegyületeket különböző mennyiségben tartalmazó minták esetében statisztikai paraméterekkel jellemeztük a kidolgozott eljárás alkalmazhatóságát. A differencia CD spektroszkópiás módszert norgesztimát (levonorgesztrel-acetát oxim) minták levonorgesztrel-acetát szennyezésének meghatározására alkalmaztuk. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a módszer igen alacsony (0,02-0,1 %) levonorgesztrel-acetát szennyezés esetén is megbízhatóan alkalmazható a fenti feladat elvégzésére [1]. 4.2. XIM-IZMEREK VIZSGÁLATA HPLC-CD/UV MÓDSZERREL A vizsgált ketovegyületek oximképzési reakciója során kétféle sztereoizomer, E és Z oxim-izomerek keletkezhetnek (1. ábra). R C R' R' > R + H 2 H -H 2 R R' R R' C E C z H H 1. ábra: E és Z oxim-izomerek képződése 7
A 4-3-ketoszteroidok oximszármazékai esetében mindkét izomer jelenlétét igazoltuk. Az oxim-izomereket akirális, normál fázisú folyadékkromatográfiás rendszerben választottuk el, szimultán kettős CD és UV spektroszkópiás detektálást alkalmaztunk. Az E és Z oxim-izomerek CD és UV spektrumait a HPLC-CD/UV módszer segítésével a kromatográfiás csúcsokban vettük fel, az izomerek preparatív elválasztása nélkül. Az izomereket 1 H-MR spektroszkópiás módszerrel azonosítottuk a 4-es helyzetű proton kémai eltolódása alapján, valamint ezzel a technikával az izomerek arányát is meghatároztuk. A tiszta és a vegyes izomerek CD-UV spektrumai, valamint a vegyes izomerek izomer arányai alapján az E és Z oxim-izomerek moláris CD és UV spektrumai a paraméter illesztés módszerével meghatározhatók. A paraméter illesztésen alapuló módszernél a vegyes izomereknél mért ellipticitás és abszorbancia értékeket ( v, A v ) a két tiszta izomer ellipticitás és abszorbancia értékeiből kaphatjuk meg: v = n E + m Z A v = n x A E, + m A Z ahol E, Z és A E, A Z az E és Z izomerek kromatográfiás csúcsokban felvett CD és UV spektrumainak ellipticitás és abszorbancia értékei ugyanazon a hullámhosszon, n és m illesztési paraméterek. Az eljárás alkalmazhatóságát bizonyította, hogy a rendelkezésünkre álló levonorgesztrel oxim-izomer standardokból felvett és az általunk számolt moláris CD- UV spektrumok igen jó egyezést mutattak [2]. A 6-keto-morfinszármazékok oximvegyületeit 1 H-MR spektroszkópiás és nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerrel tanulmányoztuk. Az oximok nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás vizsgálata alapján a telített származékoknál csak az egyik izomer keletkezett, míg a 14-hidroxi-kodeinonnál két kromatográfiás csúcsot detektáltunk. Az oximokvegyületek 1 H-MR spektroszkópiás vizsgálata során a C 5 metinproton kémiai eltolódás értékei alapján megállapítottuk, hogy az oxikodon és a hidrokodon esetében az E izomer keletkezett, a 14-hidroxi-kodeinon oximvegyületében pedig mindkét izomer jelenlétét igazoltuk. 8
4.3. SPIRCIKLUSS VIIL-ÉS PIRIDPIRIDAZI SZTEREIZMEREK VIZSGÁLATA C H 3 2 + 1a: R = H 1b: R = Ph 6' 5' 4' 1' 2 3 2' 1 4 3' 6 5 R H 3 C 6 1 2 3 3a: R= H 3b: R= Ph i 4 5 1' 1 6' 2 5' 3 4 5 1 2' 6 4' 3' R ii H 3 C 2" 4a: R= H 4b: R= Ph 1' H 5' 3" 4" 5" 6" 1" 10" 6' 9" 6"a 7" 2 3 1 2' 4' 6 3' H 4 5 R 2. ábra: Piridopiridazinok szintézise; i: etanol, piperidin, 25 C, 2.5 h, ii.: dimetilformamid, 100 C, 6 h A Semmelweis Egyetem Szerves Vegytani Intézetben előállított spirociklusos piridopiridazin típusú vegyületek sztereokémiai tulajdonságait vizsgáltuk HPLV-CD/UV módszerrel [3]. A piridopiridazinok előállítása, piridazinkarbaldehidből (2) és ciklikus malonátokból (1a, 1b) kiindulva, két lépésben történt (2. ábra). Az első lépésben keletkezett vinil-származékok (3a, 3b) melegítve piridopiridazinokká (4a, 4b) rendeződtek át. Az első lépésben keletkezett 3b vinilpiridazin vegyület esetében a fenilcsoporttal szubsztituált ciklohexán-szénatom (C-4) és a vinilcsoport C-1 atomja olefines hídfőatomokat alkotnak, amelyek körül a fenil- és piridazinil csoportok cisz (Z izomer) vagy transz (E izomer) elhelyezkedésűek lehetnek. A vegyület 1 H-MR spektrumában két jelsorozat látható, ennek alapján megállapítható, hogy a Z és E izomerek aránya 55:45. A 3b vegyület akirális, normál fázisú rendszerben történő folyadékkromatográfiás vizsgálata is két izomer jelenlétét igazolta. A csúcs alatti területek aránya 54:46, ami jó egyezést mutat a 1 H-MR spektroszkópiás adatokkal. A 4a vegyület egy királis centrummal rendelkezik (C-6''a), tehát egy enantiomerpár jelenlétével kellett számolnunk. A 4b molekula viszont két sztereogén centrumot tartalmaz, a 6''a királis szénatomot és egy királis tengelyt, az utóbbit a C-1,2' és a C-5',6'' szénatomok alkotják. Ennek következtében a 4b négy sztereoizomerrel rendelkezhet, amelyek két 9
enantiomer-párt alkotnak, jelölésük: 6''aR,M; 6''aS,P és 6''aR,P; 6''aS,M. A 4b vegyület királis, normál állófázison történő HPLC-CD/UV vizsgálatakor mind a négy sztereoizomer detektálható volt. A kromatográfiás csúcsokból felvett CD spektrumok nem voltak megfelelő minőségűek, ezért hasonló kromatográfiás rendszert alkalmazva félpreparatív nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztást végeztünk, és az eluátumokból felvettük a tiszta sztereoizomerek CD és UV spektrumait. A CD spektrumok lefutása, a Cotton hatás maximuma, illetve minimuma, valamint az előjelváltás hullámhossza két enantiomer-pár jelenlétére utalt. A 4b sztereoizomerek egymáshoz való viszonyát egy új, általunk bevezetett módszerrel, az ellipticitás-abszorbancia hányados spektrum (röviden hányados spektrum) vizsgálata alapján egyértelműen igazoltuk. A hányados spektrumok a sztereoizomerek CD és UV spektrumaihoz tartozó ellipticitás és abszorbancia értékek hányadosai alapján nyerhetők. Az irodalomban eddig alkalmazott módszerek az ellipticitás-abszorbancia hányadost egy hullámhosszon határozzák meg, az általunk alkalmazott új módszer azonban sokkal biztosabb lehetőséget nyújt az enantiomer viszony igazolására, mivel a hányados értékeket az egész spektrumtartományra vonatkozóan határozza meg. A módszer további előnye, hogy a hányados érték nem függ a mintában lévő enantiomer koncentrációjától, tehát minden olyan esetben előnyösen alkalmazható, amennyiben a vizsgált izomerek pontos koncentrációja nem ismert. Az általunk vizsgált spirociklusos piridopiridazin vegyület esetében az első és a negyedik, valamint a második és a harmadik csúcshoz tartozó izomerek hányados spektrumai tükörképi párok, ezért nagy biztonsággal mondhatjuk, hogy a megfelelő sztreoizomerek egymás enantiomerjei. 10
5. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉYEK 1. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Szász Gy.: Determination of 4-3-ketosteroids based on oxime formation by difference circular dichroism spectroscopy Fresenius Journal of Analytical Chemistry 368 (2000) 384-388 IF: 1,418 2. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Mahó S., Mátyus P., Szász Gy.: Determination of circular dichroism and ultraviolet spectral parameters of norgestimate and other 4-3-ketosteroid oxime isomers via normal phase HPLC method Current Medicinal Chemistry 8 (2001) 1341-1347 IF (2000): 4,909 3. Beke Gy., Gergely A., Szász Gy., Szentesi A., yitrai J., Barabás., Harmat V., Mátyus P.: Synthesis and stereochemistry of dispiro substituted pyridazines. Application of ellipticity-absorbance ratio spectra for proving enantiomeric relationship by HPLC- CD/UV detection Chirality 14 (2002) 365-371 IF (2000): 1,603 4. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Hosztafi S., Szász Gy.: Determination of 6-oxo-morphinans based on oxime formation by difference circular dichroism spectroscopy Analytical and Bioanalytical Chemistry (közlésre elküldve) 6. ELŐADÁSK ÉS PSZTER BEMUTATÓK 1. oszál B., Szentesi A.: Chiral genetics of narcotic drugs Interdisciplinary Symposium on Biological Homochirality Modena, 1998. szeptember 6-12. 2. Szentesi A.: Fenil-alkil-amin típusú kábítószerek enantiomer tisztaságának vizsgálata CD spektroszkópiás módszerrel IV. Clauder ttó emlékverseny Budapest, 1998. szeptember 17-19. 11
3. Szentesi A., Gergely A.: 4-3-ketoszteroidok differencia CD spektroszkópiás meghatározása STE Ph.D. Tudományos apok Budapest, 1999. május 31. 4. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Szász Gy., Mátyus P.: 4-3-ketoszteroidok differencia CD spektroszkópiás meghatározása STE Gyógyszerészi Kémiai Intézet alapításának 50. Évfordulója Budapest, 1999. június 17. 5. Gergely A., Hegedűs H., Horváth P., oszál B., Szász Gy., Szentesi A., Zobin Á., Zsila F.: A CD detektálás néhány előnyös alkalmazása a nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiában Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI. Siófok, 1999. október 6-10. 6. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Szász Gy.: 4-3-ketoszteroidok differencia CD spektroszkópiás meghatározása MKE Fiatal Kémikusok Előadóülése Budapest, 1999. november 23. 7. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Szász Gy.: 4-3-ketoszteroidok differencia CD spektroszkópiás meghatározása SE Ph.D. Tudományos apok Budapest, 2000. február 16-17. 8. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Mátyus P., Szász Gy.: ew data about oxime formation reaction by 4-3-ketosteroids EUFEPS 2000 (összefoglaló: European Journal of Pharmaceutical Sciences 2000 11 S72) Budapest, szeptember 16-19. 9. Szentesi A.: 4-3-ketoszteroid oxim-izomerek vizsgálata HPLC-CD/UV módszerrel V. Clauder ttó emlékverseny Budapest, 2000. szeptember 21-23. 10. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Mátyus P., Szász Gy.: Szteroid-oxim izomerek moláris CD és UV értékeinek meghatározása a vegyületek izolálása nélkül MET Elválasztástudományi Vándorgyűlés Visegrád, 2000. november 8-10. 12
11. Horváth P., Gergely A., oszál B., Szentesi A.: A CD/UV detektálás néhány előnyös alkalmazási lehetősége MET Elválasztástudományi Vándorgyűlés Visegrád, 2000. november 8-10. 12. Szentesi A., Gergely A., Horváth P.: 6-oxo-morfinszármazékok differencia CD spektroszkópiás meghatározása SE Ph.D. Tudományos apok Budapest, 2001. február 21-22. 13. Szentesi A., Gergely A., Horváth P., Szász Gy., Mátyus P., Beke Gy.: Analytical application of chiroptical detection XXII. Kromatográfiás Vándorgyűlés, ACE 01 Budapest, 2001. június 25-26. 14. Horváth P., Gergely A., oszál B., Szentesi A., Szász Gy.: Advances in simultaneous dual detection Balaton Symposium 01 on High-Performance Separation Methods Siófok, 2001. szeptember 2-4. 15. Szentesi A.: 6-oxo-kodeinszármazékok differencia CD spektroszkópiás meghatározása MKE Fiatal Kémikusok Előadóülése Budapest, 2001. november 14. KÖSZÖETYILVÁÍTÁS Köszönettel tartozom: Dr. Gergely András egyetemi docensnek, témavezetőmnek, Dr. oszál Béla egyetemi tanárnak, Intézetünk igazgatójának, Dr. Szász György Professor Emeritusnak, Intézetünk korábbi igazgatójának, Dr. Horváth Péter egyetemi adjunktusnak, Dr. Mátyus Péter egyetemi tanárnak, a Szerves Vegytani Intézet igazgatójának, Dr. Beke Gyulának, Matalin Istvánné Foór Ilonának és Kovács Gézáné Derzsi Ilonának 13