Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2

Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 1 lemez - 96 72561 5 lemez - 480 72562 KOMBINÁLT SZŰRŐVIZSGÁLATI TESZTKÉSZLET HEPATITIS C VÍRUS ANTI-HCV ANTITESTEINEK ÉS VIRÁLIS ANTIGÉNJEINEK VÉRSZÉRUMBÓL / EMBERI VÉRPLAZMÁBÓL TÖRTÉNŐ KIMUTATÁSÁRA ENZIM-IMMUNOASSAY MÓDSZERREL 862224 2014/09

TARTALOM 1. A FELHASZNÁLÁS CÉLJA... 3 2. A TESZT ÖSSZEFOGLALÓ BEMUTATÁSA... 3 3. A VIZSGÁLAT ELVE...3 4. REAGENSEK... 4 5. FIGYELMEZTETÉS ÉS BIZTONSÁGI ELŐÍRÁSOK... 5 6. HASZNÁLHATÓ MINTÁK... 6 7. VIZSGÁLATI PROTOKOLL... 7 8. A TESZT KORLÁTAI... 10 9. A TESZT TELJESÍTMÉNYÉNEK MUTATÓI... 11 10. IRODALOMJEGYZÉK... 14 2 [HU]

1. A FELHASZNÁLÁS CÉLJA A Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 vizsgálat a hepatitis C vírus (HCV) fertőzés kimutatására szolgáló kvalitatív enzim immunoassay, melynek alapja a HCV elleni antitestek és a kapszid antigének emberi vérszérumból vagy vérplazmából történő kimutatása. A jelen hepatitis C szűrővizsgálati tesztet diagnosztikai laboratóriumok és vérbankok is használhatják. 2. A TESZT ÖSSZEFOGLALÓ BEMUTATÁSA A hepatitis C-vírus (HCV) burokkal rendelkező, pozitív irányú RNS-vírus (9,5 kb), amely a Flavivírusok családjába tartozik, és amelynek hat fő genotípusa ismert. A HCV-rről bebizonyosodott, hogy ez a vírus a nem-a és nem-b típusú virális hepatitis-megbetegedések legfőbb okozója. A hcv-fertőzés akut és krónikus formában jelentkezik, és májzsugorhoz, valamint hepatocelluláris karcinomához vezethet. A HCV-vel való fertőzöttség szerológiai igazolása vérvizsgálattal történik, melynek során HVG antigéneket és/vagy antitesteket és/vagy RNS-t szűrünk. Az anti-hcv antitesteket és a HCV kapszid antigént egyaránt kereső kombinált szűrővizsgálati teszt előnye a csak anti-hcv antitesteket szűrő tesztekkel szemben, hogy csökkentheti a szerológiai lappangási időszakot, a fertőzés kimutatását pedig eredményesebbé teheti. 3. A VIZSGÁLAT ELVE A Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 teszteljárás alapjául szolgáló szilárd fázis a következő tisztított antigénekkel van bevonva: két rekombináns fehérje a hepatitis C vírus nem-strukturális régiójából (NS3 és NS4), egy peptid a strukturális régióból (kapszid), továbbá egy, a hepatitis C kapszid ellen termeltetett monoklonális antitest. A folyékony fázis két konjugátumból áll. Az első konjugátum (R6) a hepatitis C kapszid ellen egérben termeltetett biotinilált monoklonális antitestekből áll. Ez a monoklonális ellenanyag nem reagál a mikrolemez bevonására szolgáló mutáns C kapszid peptiddel. A második konjugátum (R7) peroxidázzal jelölt, humán IgG ellen egérben termeltetett antitestek és peroxidázzal jelölt streptavidin keveréke. A teszt kivitelezése a következő reakciólépésekből áll: 1) Az 1. sz. konjugátumot, a vizsgálandó mintákat és a kontroll-szérumokat bemérjük a mikrolemezen található tesztlyukakba. A HCV elleni antitestek - ha jelen vannak - kötődni fognak a szilárd fázison rögzített antigénekhez. Ha a hepatitis C vírus kapszid antigén jelen van, ezt az antigént mind a mikrolemezre felvitt monoklonális antitestek, mind a hepatitis C kapszid antigén ellen termeltetett biotinilált monoklonális antitestek (1. sz. konjugátum) megkötik. 2) 37 C-on 90 percig tartó inkubálást és egy mosási lépést követően a mikrolemez minden tesztlyukába bemérésre kerül a peroxidázzal jelölt, anti-humán IgG ellenanyag és a streptavidin-peroxidáz (2. sz. konjugátum). Humán IgG jelenléte és a szilárd fázissal történt reakciója - esetén az anti-humán IgG konjugátumok kötődnek a humán antitestekhez. A streptavidin-peroxidáz konjugátum kötődik az 1. számú konjugátum biotinjához, amennyiben a mintában hepatitis C kapszid antigén van jelen. 3) 37 C-on 30 percig végzett inkubálást követően a nem kötött enzimes konjugátumot egy mosási lépésben eltávolítjuk és az antigén-antitest-peroxidáz komplexet a szubsztrát hozzáadásával azonosítjuk. 4) Laboratóriumi hőmérsékleten (18-30 C) végzett 30 perces inkubálást követően a reakciót leállítjuk és a spektrofotométert 450/620-700 nm-en leolvassuk. A minták esetén mért abszorbancia-értékek lehetővé teszik a HCV elleni antitest és/vagy a HCV kapszid antigén jelenlétének vagy hiányának kimutatását. A kapott szín intenzitása arányos a szilárd fázison megkötött HCV-antitest és/vagy HCV kapszid antigén mennyiségével. 3 [HU]

4. REAGENSEK 4.1. Leírás Megjelölés a címkén Leírás Kiszerelés 72561. ítmény Kiszerelés 72562. ítmény R1 Microplate Mikrolemez 12 db, egyenként 8 db, a HCV monoklonális anti-kapszid antitestével, tisztított rekombináns hepatitis C antigénekkel (NS3, NS4) és HCV kapszid peptiddel bevont tesztlyukat tartalmazó csík. Egyedi azonosítószám = 93 1 lemez 5 lemez Azzonnal használható R2 Concentrated washing solution (20X) Mosóoldat-koncentrátum (20X) Tris NaCl puffer ph 7.4 Tartósítószer: ProClin 300 (0.04%) 70 ml Feloldandó 235 ml Feloldandó R3 Negativ control Negatív kontroll BSA (marha szérualbumin) tartalmú Tris HCI puffer. Tartósítószer : ProClin 300 (0.1%) 1 ml 1 ml R4 Positiv control Pozitív kontroll H termeltetett antitesteket tartalmazó humán szérum, HBs antigénre illetve anti-hiv1 és anti-hiv2 antitestekre negatív; BSA-t tartalmazó Tris HCl pufferban hígítva, fotokémiai úton inaktivált formában. Tartósítószer: ProClin 300 (0.1%) 1.5 ml 3 ml R5a Antigen positiv control Antigén pozitív kontroll Antigén pozitív kontroll (kapszid szintetikus fehérje), liofilizált állapotban. q.s. ad 1 ml Rekonstituálandó q.s. ad 1 ml Rekonstituálandó R5b Antigen diluent R6 Conjugate 1 Hígító az R5a reagenshez ProClin 300 (0.5 %) tartósítószert tartalmazó desztillált víz. 1. számú konjugátum Kapszid HCV antigén ellen egérben termeltetett, biotinilált monoklonális antitestek. Lila színnel jelölve. Tartósítószer: Nátrium-azid (< 0.1%), Cosmocil CQ (0.025%) 1 ml Rekonstituálandó 15 ml 1 ml Rekonstituálandó 2 fiola 2 x 30 ml R7 Conjugate 2 2. számú konjugátum Humán IgG/peroxidáz ellen egérben termeltetett antitest és streptavidin/peroxidáz. Zöld színnel jelölve. Tartósítószer: ProClin 300 (0.5 %) 15 ml 2 fiola 2 x 30 ml R8 Substrate buffer Szubsztrát Citromsav és nátrium-acetát oldata, ph 4,0; 0,015% hidrogén-peroxidot és 4% dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmaz. 60 ml Rekonstituálandó 2 fiola 2 x 60 ml Rekonstituálandó 4 [HU]

R9 Chromogen: TMB solution (11X) Kromogén: TMB-oldat Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat, 3.3, 5.5. 5 ml Feloldandó 2 fiola 2 x 5 ml Feloldandó R10 Stopping solution Leállító oldat 1 N kénsav-oldat. (H 2 SO 4 1N) 28 ml 3 fiola 3 x 28 ml 4.2. Tárolási és kezelési körülmények A tesztletet +2-8 C között kell tárolni. Ezen a hőmérsékleten tárolva a letben található minden reagens felhasználható a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig a felnyitás után is (kivéve a speciális eseteket). Felnyitás után, amenyiben szennyeződés nem lép fel, az R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 és R10 reagensek 2-8 C tárolva a címkén látható szavatossági ideig felhasználhatók. Azonosító kód R1 R2 R5a + R5b R8 + R9 Tárolási mód A visszazárható tasak felbontása után a tesztcsíkok az eredeti tasakban ragasztószalaggal gondosan visszazárva, +2-8 C -on tárolva 1 hónapig felhasználhatók. A kihígított mosóoldat (R2) +2-30 C 2 hétig tárolható. A koncentrált mosóoldat +2-30 C-on tárolható. Rekonstituálás után a pozitív antigén (R5) kontroll munkaoldata +2-8 C-on 1 hónapig, -20 C-on 2 hónapig felhasználható (-20 C-ról legfeljebb 5 alkalommal felolvasztva és visszafagyasztva). Rekonstituálás után a reagensek szobahőmérsékleten (18-30 C), sötétben tárolva 6 órán át felhasználhatók. 5. FIGYELMEZTETÉS ÉS BIZTONSÁGI ELŐÍRÁSOK Csak in vitro diagnosztikai célra, szakképzett egészségügyi dolgozó által alkalmazható. 5.1. Egészségügyi és munkavédelmi előírások Ezt a tesztet kizárólag laboratóriumi szakképzésben részesült személyzet használhatja, amely tisztában van a potenciális veszélyekkel. Viseljen megfelelő védőruházatot, amely laboratóriumi kesztyűből, szem/arcvédő maszkból áll, továbbá a reagenseket és a mintákat kezelje a helyes laboratóriumi gyakorlat szerint. A tesztlet humán vérkomponenseket tartalmaz. Az R4 (pozitív kontroll) ítéséhez használt humán eredetű anyagok ellenőrzésük során nem mutattak reaktivitást a hepatitis B vírus felszíni antigénjével (HBs Ag), és a humán immundeficiencia vírusok ellen termelt antitestekkel (HIV-1 és HIV-2 Ab), ugyanakkor pozitívak az anti-hcv antitestekre. Az R4 pozitív kontroll reagens melegítés által inaktivált állapotban van. Az ismert tesztmódszerek nem zárhatják ki teljes biztonsággal a fertőző ágensek jelenlétét. Ennélfogva minden emberi vérítrményt, derivátumot, reagenst vagy betegmintát úgy kell kezelni, mintha képesek lennének fertőző betegségek átadására; tartsuk be a vér útján terjedő kórokozókra vonatkozó általános biztonsági előírásokat abban a formában, ahogyan azokat a helyi, regionális és országos szabályozás tartalmazza. Biológiai szennyeződések: a humán eredetű anyagokkal történő szennyeződéseket potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A nem savtartalmú kiömléseket, beleértve a kiömlés területét, az anyagokat és báremely érinttett felületet vagy berendezést, megfelelő kémiai fertőtlenítő szerrel azonnal semlegesíteni kell (általában 10%-ra hígított háztartási hypóval, 70-80% etanollal vagy izopropanollal, jodoforral [pl. 0.5% Wescodyne Plus stb.), majd szárazra kell törölni. A savat tartalmazó kiömléseket megfelelően fel kell itatni (fel kell törölni) vagy semlegesíteni kell, a területet vízzel le kell öblíteni, majd szárazra kell törölni, a kiömlés felitatására használt anyagokat adott esetben veszélyes biológiai hulladékként kell ártalmatlanítani. A szennyezett területet ezután valamelyik vegyi fertőtlenítőszerrel meg kell tisztítani. FIGYELMEZTETÉS: Ne helyezzünk nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatot az autoklávba! 5 [HU]

Minden betegmintát és a teszt elvégzésénél használt minden anyagot úgy kell kezelni, mintha azok fertőző ágenst tartalmaznának. A laboratóriumi, kémiai vagy veszélyes biológiai hulladékokat a helyi, regionális és országos szabályozásnak megfelelően kell kezelni és eltávolítani. A jelen tesztkitben található egyes kémiai összetevőkre vonatkozó bviztonsági és elővigyázatossági előírásokkal kapcsolatban lásd a címkéken jelzett piktogramo(ka)t, valamint a használati utasítás végén szereplő információkat. A biztonsági adatlap a www.bio-rad.com címen megtekinthető. 5.2. A protokollal kapcsolatos elővigyázatossági intézkedések 5.2.1. Előítés Az eredmények minősége függ az alábbi helyes laboratóriumi gyakorlat követésétől: Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Ne keverjünk vagy társítsunk egy adott teszt-futtatáson belül különböző gyártási sorozatokból származó reagenseket. Használat előtt várjunk 30 percet arra, hogy a reagensek a szobahőmérsékleten stabilizálódjanak (18-30 C). A teszt megnevezése, valamint a teszt egyedi azonosítószáma minden egyes mikrotiter lemez keretén szerepel. Ez az egyedi azonosítószám minden tesztcsíkon is szerepel. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2: egyedi azonosítószám = 93 Használat előtt ellenőrizzük az egyedi azonosítószámot. Ha az azonosítószám hiányzik, vagy az alkalmazni kívánt teszt fenti számától eltér, a tesztcsíkot nem szabad felhasználni. MEGJEGYZÉS: Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB 11x, lila színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. A reagensek rekonstitúcióját óvatosan, szennyezésmentesen végezzük. Használjunk alaposan elmosott és ioncserélt vízzel jól átöblített üvegedényeket, illetve lehetőleg egyszerhasználatos eszközöket. Ne hagyjuk a tesztlemezt a mosási művelet vége és a reagensek bemérése között kiszáradni. Az enzimreakció nagyon érzékeny a fémionokra. Ezért vigyázzunk, hogy fémes eszköz a különböző konjugátum és szubsztrát oldatokkal ne érintkezhessen. A színelőhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) rózsaszínűnek kell lennie. A rózsaszín árnyalatnak a rekonstitúciót követő néhány percen belüli megváltozása azt jelzi, hogy a reagens nem használható és azt ki kell cserélni. A színelőhívó oldatot olyan eldobható egyszerhasználatos műanyag tálcán vagy üvegedényben kell elíteni, melyet először 1N sósavval előre elmostunk és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. Ezt a reagenst fénytől elzárva kell tárolni. Soha ne használjuk ugyanazt a tartályt a konjugátum, illetve az előhívó oldat beméréséhez. 5.2.2. Eljárás közben A vizsgálati eljárás rendjén ne változtassunk. Ne végezzük el a tesztet a konjugátum enzimaktivitását potenciálisan megváltoztatni képes reaktív (savas, alkáli vagy aldehid) gőzök vagy por jelenlétében. Minden mintához használjunk új pipettahegyet. A tesztlyukak mosása kritikus lépés ezen eljárásban, ezért tartsuk be a mosási ciklusok ajánlott számát és bizonyosodjunk meg arról, hogy minden tesztlyukat teljesen feltöltöttünk. illetve később teljesen kiürítettünk. A helytelen mosás pontatlan eredményekhez vezethet. A teszt működési teljesítményének maximalizálása érdekében gondosan kövessük a fentebb ismertetett mosási eljárásokat. Egyes eszközök esetén azonban lehetséges, hogy szükségessé válik a mosási lépések optimalizálása (a mosási ciklusok számának és/vagy a ciklusonként felhasznált mosó puffer mennyiségének növelése) az elfogadható OD háttér elérése érdekében a negatív mintánál. Adaptációk és egyedi eljárások kérdésében keresse meg vállalatunkat. 6 [HU]

6. HASZNÁLHATÓ MINTÁK A vérmintát a szokásos gyakorlatnak megfelelően vegyük le. A teszt EDTA, nátrium-citrát vagy ACD antikoagulánsokkal gyűjtött, hígítatlan szérum vagy plazma mintákon végezhető el. Litium-heparinátot tartalmazó kémcsőből származó minta használata nem ajánlott. A HCV antigénre pozitív teszteredményt mutató mintáknál alacsonyabb jelszintet figyeltek meg. Az aggregátumokat tartalmazó mintákat vizsgálat előtt centrifugálással deríteni kell. A lebegő fibrin részecskék vagy aggregátumok tévesen pozitív eredményekhez vezethetnek. A mintákat +2 és 8 C között lehet tárolni, amennyiben a szűrést hét napon belül elvégezzük, ellenkező esetben a minták -20 C-on mélyfagyasztva tarthatók. A mintákat legfeljebb 3 alkalommal melegítsük fel és fagyasszuk le. A mintákat szobahőmérsékleten (18-30 C) kell felmelegíteni. Használat előtt ajánlott felfordítással összekeverni. Az eredményeket nem befolyásolja, ha a minták 120 g/l-nél kevesebb albumint, 50 µg/l-nél kevesebb biotint vagy 200 mg/l-nél kevesebb bilirubint tartalmaznak, illetve ha a lipémiás minták 33 g/l-nél kevesebb triglicerid ekvivalenst vagy a hemolizált minták 2 g/l-nél kevesebb hemoglobint tartalmaznak. Mindamellett ne használjunk szennyezett, hiperlipémiás vagy hiperhemolizált szérumot. A minták melegítése nem ajánlott, mivel az a HCV antigén kimutatásának esélyét számottevően csökkenti. Ha a mintákat szállítani kell, a csomagolást az etiológiai ágensek szállítására vonatkozó hatályos szabályok alapján kell végezni, lehetőség szerint fagyasztva szállítással. 7. VIZSGÁLATI PROTOKOLL 7.1. Szükséges, de nem mellékelt anyagok Desztillált víz. Nátrium-hipoklorit (háztartási hypo) és nátrium-bikarbonát. Szűrőpapír. Öntapadó fólia. Egyszerhasználatos védőkesztyű. Védőszemüveg. Eldobható kémcsövek. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl és 1 ml térfogat bemérésére. 10 ml-es, 200 ml-es és 1000 ml-es kapacitással rendelkező osztott mérőhengerek. Vortex típusú keverő Automata, félautomata vagy manuális mikrolemez-mosó rendszer Termosztatikusan 37 ± 1 C-ra beállított vízfürdő vagy azzal egyenértékű száraz mikrolemezinkubátor (*). Biológiailag veszélyes szennyezett maradványokat befogadó hulladékgyűjtő. Mikro-tesztlemez leolvasó 450, 490 nm és 620-tól 700 nm-ig szűrőkkel felszerelve (*). (*) Keressen fel minket a technikai osztályunk által támogatott felszerelésekkel kapcsolatos részletes felvilágosításokért. 7.2. A reagensek előítése 7.2.1. reagensek 1. reagens (R1): Tesztlemez Minden keret 12 tesztcsíkot tartalmaz, és visszazárható tasakba van csomagolva. Ollóval vagy szikével nyissuk fel a csomagolást 0.5-1 cm-rel a visszazárható csík fölött. Nyissuk ki a tasakot és vegyük ki a lemezt keretet. A fel nem használt tesztcsíkokat tegyük vissza a tasakba. Gondosan zárjuk vissza a tasakot ragasztószalaggal, és helyezzük +2-8 C-os hőmérsékletű tárolóhelyre. 6. reagens (R6): 1. számú konjugátum Használat előtt felfordítással keverjük össze. 7. reagens (R7): 2. számú konjugátum Használat előtt felfordítással keverjük össze. 7 [HU]

7.2.2. Rekonstituálandó reagensek 2. reagens (R2): Mosóoldat-koncentrátum (20x) 1:20 arányban hígítsuk desztillált vízzel, a felhasználásra oldat előállításához. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t ítsünk. 8. reagens (R8) + 9. reagens (R9): Enzim előhívó oldat. Hígítsuk az R9 jelű reagenst 1:11 arányban az R8 jelű reagenssel (példa: 1 ml R9-es reagens 10 ml Rb-as reagensben). 10 ml elegendő 1-től 12-ig terjedő számú tesztcsíkra. Keverjük össze. 5a reagens (R5a) + 5b reagens (R5b): mmunkaoldat (R5) Öntsük az R5b hígító tartalmát a liofilizált Ag R5 reagenst tartalmazó fiolába. Zárjuk vissza a fiolát és hagyjuk állni szobahőmérsékleten (18-30 C) 10 percig, eközben gyengén rázogassuk és néhányszor fordítsuk fejjel lefelé az oldódás elősegítésére. 7.3. A vizsgálat menete Szigorúan kövessük a protokollt. Minden tesztben használjunk negatív és pozitív kontrollszérumokat a teszt minőségének és érvényességének megállapítása céljából. Alkalmazzuk a következő, helyes laboratóriumi gyakorlat elveket. 1) Alaposan dolgozzuk ki a minták beosztásának és azonosításának tervét. 2) Készítsük el a hígított mosóoldatot (hígított R2) és az antigén pozitív kontroll munkaoldatot (R5a + R5b). (Lásd 7.2 szakaszt) 3) Vegyük elő a tesztlemez-keretet és a tesztcsíkokat (R1) a védőcsomagolásból. A fel nem használt tesztcsíkokat helyezzük vissza a csomagolásba. Zárjuk le a csomagolást, és helyezzük +2-8 C hőmérsékletű tárolóhelyre. 4) A következő sorrendben mérjük be a tesztlyukakba (ajánlott lemezkiosztás): 100 µl az 1. számú konjugátumból (R6) minden tesztlyukba, majd 50 µl negatív kontroll szérum (R3) az A1 jelű tesztlyukba, 50 µl pozitív kontroll szérum (R4) a B1, C1, D1 jelű tesztlyukakba, 50 µl antigén pozitív kontroll munkaoldat (R5a + R5b) az E1 jelű tesztlyukba, 50 µl az első vizsgálandó mintából az F1 jelű tesztlyukba, 50 µl a második mintából a G1 jelű tesztlyukba stb. Keverjük össze a reakcióelegyet (minimum háromszori aspirációval vagy tesztlemez-rázóval 5 másodpercig). Ha a minták bemérése 10 percnél hosszabb időt vesz igénybe, ajánljuk, hogy a negatív és pozitív kontrollok hozzáadása a tesztelendő minták bemérése után történjen. Az alkalmazott üléktől függően a kontrollok helye és a bemérések sorrendje megváltoztatható.. MEGJEGYZÉS.: A minták bemérése után a mintát (vagy kontrollt) tartalmazó tesztlyuk színe liláról kékre változik. Ekkor lehetségessé válik a minták és az 1. sz. konjugátum jelenlétének kimutatása 620 nm-en történő spektrofotometriás leolvasással (lásd a 7.7 szakaszt). 5) Amennyiben lehetséges, borítsuk be a lemezt új öntapadó filmmel. 6) Inkubáljuk a tesztlemezt 37 C ± 1 C-on, 90 percig (± 5 perc). 7) Távolítsuk el az öntapadó filmet. Távolítsuk el minden tesztlyuk tartalmát folyékonyhulladéktartályba történő leszívással és mérjünk be minimum 370 µ l mosóoldatot minden tesztlyukba. Aspiráljuk ismét, és ismételjük meg a mosási lépést minimum ötször. A maradék térfogatnak 10 µl-nél kevesebbnek kell lennie (ha szükséges, szárítsuk le a tesztcsíkokat szűrőpapíron fejjel lefelé történő fordítással). Ha automata mikrolemez-mosó berendezéssel rendelkezik, kövesse ugyanezt a működési ciklust. Ha szükséges, távolítsuk el az öntapadó filmet. 8) Gyors ütemben mérjünk be 100 µl -t a 2. sz. konjugátumból (R7) minden tesztlyukba. A konjugátumot használat előtt gyengén fel kell rázni. Ha lehetséges, borítsuk be egy új öntapadó filmmel és inkubáljuk 37 C ± 1 C-on 30 percig (± 5 perc). MEGJEGYZÉS: A konjugátum színe zöld. A konjugátum jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő spektrofotometriás leolvasással lehet igazolni (lásd a 7.7 szakaszt). 9) Távolítsuk el az öntapadó filmet, aspirációval ürítsünk ki minden tesztlyukat és mossuk legalább 5 alkalommal a fentebb ismertetett módon. 8 [HU]

10) Készítsük el az enzimes előhívó oldatot (R8 + R9 reagens). 11) Gyors ütemben mérjünk be minden tesztlyukba 80 µl -t az előbbi lépésben frissen elített előhívó oldatból (R8 + R9). Hagyjuk az előhívási reakciót lezajlani sötétben, szobahőmérsékleten (18-30 C) 30 ± 5 percen át. Ne használjunk öntapadó filmet ezen inkubálás alatt. MEGJEGYZÉS: A rózsaszín színű előhívó oldat bemérését a vizsgálat ezen lépésében vizuálisan ellenőrizhetjük: jól látható színezetbeli különbség van az üres és a rózsaszínű szubsztrátoldatot tartalmazó tesztlyukak között (lásd a 7.7. szakaszt) 12) Az előhívó szubsztrátoldat-bemérés sorrendjének és sebességének megfelelő ütemezésben adjunk 100 µl leállító oldatot (R10) a tesztlyukakba. MEGJEGYZÉS: A színtelen leállító oldat bemérését a vizsgálat ezen lépésében vizuálisan ellenőrizhetjük. A leállító oldat hozzáadását követően a szubsztrát rózsaszín színezete eltűnik (a negatív minták esetén) vagy kékről sárgára változik (a pozitív minták esetén). 13) Óvatosan töröljük le a tesztlemez alját. Olvassuk le az optikai denzitást 450/620-700 nm-en lemezleolvasóval legalább 4 perccel a leállító oldat hozzáadását követően és a reakció leállítását követő 30 percen belül. 14) Az eredmények rögzítése előtt ellenőrizzük a megfelelést a leolvasás és a tesztlemez illetve a mintabemérési és azonosítási terv között. 7.4. A minőség ellenőrzése A teszt érvényességének megállapítására használjuk az R4 és R5 pozitív és az R3 negatív kontrollokat. (Lásf a 7.5 pontot) 7.5. A teszt érvényességének kritériumai A jelen teszt a következő feltételek teljesülése esetén érvényes: 1) Az R3 jelű negatív kontroll esetén: A mért abszorbancia-értéknek kisebbnek kell lennie, mint a cut-off 60 %-a. O.D. < cut off x 0.6 2) Az R4 jelű antitest kontroll pozitív esetén: 0,800 átlag O.D. R4 2,700 (Az átlagos mért abszorbancia-értéknek egyenlőnek vagy nagyobbnak kell lennie 0,800-nál, és egyenlőnek vagy kisebbnek kell lennie 2,700-nél.) Ha az R4 jelű antitest pozitív kontrollok valamelyik egyedi értéke az átlagos értéktől 30%-nál nagyobb mértékben különbözik, az értéket figyelmen kívül kell hagyni és a számítást a maradék két pozitív kontroll-érték használatával kell újból elvégezni. 3) Az R5 jelű munkaoldat esetén: O.D. > 0.500 (A mért abszorbancia-értéknek 0,500-nél nagyobbnak kell lennie.) 7.6. Számítások és az eredmények kiértékelése A cut-off értéket az R4 pozitív kontrollal határozzuk meg. Számítsuk ki a mért átlag abszorbancia-értéket az R4 pozitív kontroll esetében. A cut-off érték kiszámítása:: OD R4 átlagértéke CO = -------------------------- 5 Az anti-hcv antitestek és/vagy HCV kapszid antigének jelenlétét vagy hiányát az egyes minták rögzített abszorbancia-értékének és a kiszámított cut-off értéknek az összehasonlításával kapjuk meg. Számítsuk ki a következő arányt minden minta esetében: Mintaarány = a minta optikai denzitása / cut-off érték A cut-off-értéknél kisebb optikai denzitással rendelkező mintákat negatívnak (arányérték < 1) tekintjük a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztvizsgálattal. 9 [HU]

A cut-off-értéket megközelítő eredményeket (cut-off OD - 10% < minta OD < cut-off, arányérték 0.9 és 1 között) azonban óvatosan kell értelmezni (amennyiben a ülék és a laboratóriumi eljárásrend ezt lehetővé teszi, javasolt az ilyen mintákat két párhuzamos tesztben újravizsgálni). A cut-off-értékkel egyenlő vagy azt meghaladó (arányérték 1) optikai denzitással rendelkező mintákat kezdetben pozitívként kell tekinteni a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztvizsgálattal. Két párhuzamos tesztben újra kell vizsgálni őket a végleges értelmezéshez. Ha az ismételt tesztet követően az arányérték a két párhuzamos teszt közül legalább az egyikben egyenlő vagy nagyobb, mint 1, az eredeti eredmény reprodukálható, a teszt pedig pozitívnak tekintendő a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztvizsgálattal. Ha a két párhuzamosan megismételt vizsgálat közötti arányérték 1- nél kisebb, az eredeti erredmény nem megismételhető, a minta pedig negatívnak tekintendő. Az ismételt teszteket követően egy mintát akkor tekintünk a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztvizsgálattal pozitívnak, ha a második vagy a harmadik mérés is pozitív, azaz a cut-off-értékkel egyenlő vagy annál magasabb értéket kapunk. A mintát negatívnak tekintjük akkor, ha mindkét érték kisebb, mint a cut-off-érték. Ha a mintákat kétszer újra teszteltük és a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztvizsgálattal negatívnak találtuk, de az egyik érték a cut-off érték közelébe esik (0,9 és 1 közötti arányértékkel), az eredményt óvatosan kell kezelni. Tanácsos a pácienst más módszerrel vagy más mintával újratesztelni. Amennyiben a tesztelt minták nagyon alacsony optikai denzitásúak (negatív OD), és ha a minták és a reagens jelenléte is kontrollált, az eredményt negatívnak lehet tekinteni. Ajánlott a pozitív mintákat az érvényben lévő nemzeti ajánlások és algoritmusok alapján megerősíteni. 7.7. A MINTA ÉS A KONJUGÁTUM BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS IGAZOLÁSA (OPCIONÁLIS) AZ ELSŐ LÉPÉS IGAZOLÁSA: AZ 1. SZ. KONJUGÁTUM (R6) ÉS A MINTA JELENLÉTE Az 1. sz. konjugátum (R6) és a minta jelenlétét a tesztlyukban 620 nm-en történő automatikus leolvasással lehet igazolni. A mintát és az 1. sz. konjugátumot (R6) tartalmazó valamennyi tesztlyuk OD értékének 0,800-nál nagyobbnak kell lennie. MEGJEGYZÉS: a minta hozzáadását követően az 1. sz. konjugátum (R6) liláról kékre változik. A MÁSODIK LÉPÉS IGAZOLÁSA: A 2. SZ. KONJUGÁTUM (R7) ÉS A MINTA JELENLÉTE A 2. sz. konjugátum (R7) zöld színű. A 2. sz. konjugátum (R7) jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük: minden tesztlyuk OD értékének 0,300-nál nagyobbnak kell lennie (ennél a normánál alacsonyabb érték a konjugált elégtelen bemérését jelzi). Az előhívó oldat pipettázásának igazolása A rózsaszín színű előhívó oldat jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással lehet Igazolni. Az előhívó oldatot tartalmazó tesztlyuk esetén az optikai denzitásnak 0,100-nél magasabbnak kell lennie (az ennél alacsonyabb OD érték az előhívó oldat elégtelen bemérését jelzi). Az elített szubsztrát kromogén oldat hozzáadását követően látványos színváltozás, az üres tesztlyukakban színtelenből rózsaszínűre változás történik. 8. A TESZT KORLÁTAI A hepatitis C vírussal fertőzött betegek által mutatott immunológiai reakciók változatosságából adódóan (különösen szerokonverziók idején) a tesztek között a kimutatásban kisebb különbségek lehetnek a használt antigéln-fehérjék fajtájától függően. Egy szűrőteszttel kapott negatív eredmény nem zárja ki a hepatitis C vírusnak valló kitettség vagy az általa történt fertőzöttség lehetőségét. A szakirodalom szerint az immunoszupressziós kezelésen áteső vagy HIV és HCV vírusokkal párhuzamosan fertőzött HCV hordozóknál az antitestek szintje különösen alacsony lehet, ami nem éri el a HCV-tesztek kimutatásának küszöbértékét. Minden ELISA eljárás közös hibája, hogy hamis pozitív reakciókat mutathatnak. Minden ismételten pozitívként mutatkozó minta esetén ezért javasolt a reakció specificitásának igazolása a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztkitben megadott értelmezési kritériumok alapján, a megfelelő módszer alkalmazásával, pl. a HCV ellen termelt antitestek jelenlétének bizonyításával ELISA anti-hcv antitest szűrőteszt alkalmazásával vagy immunblottoláson alapuló anti-hcv antitest-kimutatási teszt használatával. Ha szükséges, alkalmazzunk molekuláris biológiai tesztet a HCV vírusgenom kimutatására. 10 [HU]

A minták, konjugátumok és előhívó oldat bemérésének igazolására szolgáló kolorimetriás módszer nem teszi lehetővé a bemért térfogatok pontosságának igazolását. E módszer csupán a minta, a konjugátum és az előhívó oldat tesztlyukakban való jelenlétét mutatja. Ezzel a módszerrel a hibás válaszok aránya szorosan összefügg az alkalmazott rendszer pontosságával (a bemérés és leolvasás 10%-nál magasabb kumulatív variációs koefficiense lényeges mértékben csökkenti az igazolás minőségét). A Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 teszt használata összeöntött vagy hígított minták esetében nem jóváhagyott. Az 1. számú konjugátumban (R6) kivételes alkalmakkor finom részecskék észlelése lehetséges, ezek jelenléte semmilyen esetben sem csökkenti a reagens minőségét. 9. A TESZT TELJESÍTMÉNYÉNEK MUTATÓI 9.1. Precizitás mérése A reprodukálhatóságot és a kibővített ismételhetőséget különböző anti-hcv antitest- és HCV antigénkoncentrációjú minátkkal határoztuk meg. Az ismételhetőség meghatározására a mintákat 30 alkalommal teszteltük ugyanazon tesztszérián belül. A kibővített ismételhetőséget a mintáknak 20 napon keresztül, naponta két egymástól függetlenül lefuttatott párhuzamos tesztjével értékeltük. Kiszámításra kerültek a következő értékek: az átlagok aránya, a szórások (standard deviation, SD) és a variációs koefficiensek (coefficient of variation, CV). 9.1.1. Ismételhetőség Minták Szám Átlagok aránya Szórás Variációs koefficiens % Negatív M1 30 0.23 0.024 10.4 HCV antigén pozitív Anti-HCV antitestek pozitív A 6 pozitív mintán kapott variációs koefficiens <10%. 9.1.2. Kibővített ismételhetőség M2 30 1.21 0.048 4.0 M3 30 1.43 0.053 3.7 M6 30 7.18 0.166 2.3 M4 30 1.42 0.046 3.2 M5 30 1.35 0.083 6.1 M7 30 6.73 0.153 2.3 Átlagok aránya Vizsgálaton belüli Vizsgálatok közötti / operator CV SD % Napok között Összes reprodukálhatóság Minták Szám CV CV SD SD SD CV % % % Negatív M1 80 0.22 0.017 7.5 0.028 12.5 0.029 12.7 0.043 19.4 HCV antigén pozitív Anti-HCV antitestek pozitív M2b 80 2.80 0.143 5.1 0.277 9.9 0.283 10.1 0.421 15.0 M3 80 1.56 0.124 7.9 0.129 8.2 0.083 5.3 0.197 12.6 M6 68 6.69 0.500 7.5 0.621 9.3 0.557 8.3 0.973 14.5 M4 80 1.57 0.062 3.9 0.125 8.0 0* N/A 0.140 8.9 M5 80 1.75 0.075 4.3 0.164 9.3 0* N/A 0.181 10.3 M7 80 7.69 0.285 3.7 0.531 6.9 0* N/A 0.603 7.8 *: A becsült negatív variancia-érték = 0. A 6 pozitív mintán kapott variációs koefficiens nem több, mint 15%. 9.2. A teszt klinikai működési teljesítménye A Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 teljesítményét véletlenszerűen kiválasztott véradó donoroktól, valamint kórházi betegektől, akut és krónikus hepatitis C vírus fertőzöttségben szenvedőktől, továbbá a hepatitis C vírussal nem összefüggő klinikai tüneteket mutató betegektől származó mintákon teszteltük. A vizsgálatokat két véradó-helyszínen, egy kórházi helyszínen és a Bio-Rad saját helyszínén végeztük.. 11 [HU]

9.2.1. Diagnosztikai specificitás A vizsgálatot 2 véradó-központban, véletlenszerűen kiválasztott véradóktól származó vérszérum és EDTA plazma mintákon végeztük. Kórházban ápolt betegeken szintén ült specificitás-vizsgálat. Valamennyi mintát EU-ban regisztrált anti-hcv tesztekkel vizsgáltuk. Populáció Helyszín Minta típusa Mennyiség Véradók #1 Ismételt reaktív minták (RR) Specifikusság (%) szérum 537 1 536/537 plama 2002 0 2002/2002 #2 szérum 2638 2 2636/2638 Konfidenciaintervallum 95% #1 + #2 5177 3 99.94% 5174/5177 99.83% 99.99% Kórházi betegek #3 szérum 502 1 99.80% 501/502 98.92% - 100.00% *: a referencia-vizsgálat során meghatározatlannak talált 3 donort kivettük a számításokból. 9.2.2. Diagnosztikai érzékenység vizsgálata A teszt diagnosztikai érzékenységét 575, hepatitis C vírussal fertőzött betegtől származó mintán vizsgáltuk. Az említett minták közül 25 mintát a vizsgálatot megelőző 24 órán belül vették le a páciensektől. 481 különböző genotipizált minta (1; 2; 3; 4; 5; 6) tesztvizsgálatára került sor. 1. táblázat: tesztelt genotípusok Minták száma 1 2 3 4 5 6 (1, 1a, 1b, 1a/b) (2 2a/c, 2a, 2b, 2b/3 (3, 3a, 3b, 3c) (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) (5, 5a) (6, 6a, 6a/b, 6n) Genotípusok Összesen 241 56 107 63 8 6 481 A tesztelt minták egészén a diagnosztikai szenzitivitás 100%-nak (575/575) igazolódott, 95%-os megbízhatósági intervallummal [99.4-100.0]. Akut fertőzött betegektől származó minták esetén 39 szerokonverziós panelt teszteltünk a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 tesztjével (10 kapszid profil, 10 NS3 profil és 19 többösszetevőjű profil), összehasonlítva azt egy kombinált antigén/antitest teszttel és egy anti-hcv antitest-tesztkittel (mindkét utóbbi teszt EU-ban regisztrált volt). Minden panel esetében korai kimutatás volt mérhető. Az említett 39 panel közül egy panelen a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 nem mutatott ki fertőzöttséget, három esetben pedig az összehasonlításként szolgáló kombinált Ag-Ab teszt nem mutatott ki fertőzést. A Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 által kimutatott 38 panel között 5 esetben korábban mutatta ki a fertőzöttséget, 27 esetben azonos volt a kimutatás ideje, míg 6 esetben később mutatta ki, mint a kombinált Ag-Ab tesztlet. Egy antitest kimutatására szolgáló másik anti-hcv tesztlettel összehasonlítva 28 panel esetében korábban, 9 esetben azonos időben, míg 1 esetben később mutatta ki a fertőzöttséget. Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 kontra kombinált Ag-Ab HCV tesztkit Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 kontra anti-hcv tesztkit Panelek száma 38 38 Korábbi kimutatás 5 28 Azonos kimutatás 27 9 Későbbi kimutatás 6 1 12 [HU]

9.3. Analitikai specificitás, keresztreakciók vizsgálata A kövekező 365, potenciálisan interferáló mintát vizsgáltunk a Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 teszttel: adott esetben fertőző megbetegedések kórokozói ellen antitesteket tartalmazó minták (cytomegalovírus, Epstein Barr vírus, VZV, kanyaró-vírus, rózsahimlő-vírus, mumpsz-vírus, herpesz-vírus, influenza-vírus, hepatitis A vírus, hepatitis B vírus, HIV 1/2, HTLV 1/2, szifilisz, Toxoplasma gondii, dengue-láz, Chagas-kór); a kockázati csoportbl származó minták (dialízisben részesülő betegek, nem hepartitis alapú cirrhosisban szenvedők, terhes nők, többszöri szülésen átesett nők), vagy immunrendszeri megbetegedésben szenvedőktől származó minták (autoantitestek, reuma-faktorok, egér ellenes antitestek, myelomák). A Monolisa HCV Ag-Ab ULTRA V2 teszttel két minta bizonyult ismétlődően pozitívnak. Az említett célcsoport populációján mért specificitás 99.45% (363/365), hasonló a klinikai minták esetében mért specificitás hoz. 9.4. Kioltási effektus (Hook effektus) A kioltási effektus esetleges létezését 5, magas titerű minta tesztelésével tanulmányoztuk különböző hígításokban. A hígítatlan és hígított minták után kapott eredmények egyezése mutatja, hogy nem áll fenn kioltási effekus. 10. IRODALOMJEGYZÉK Bhartia A.R., Letendrea S.L., Wolfsona T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52 : 328 332. Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, 36 : 211-218. Choo Q.L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby A., Barp P.J., Weiner A.J., Bradley D.W., Kuo G. and Houghton M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455. EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64. Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT for HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729. Lambert N. Value of HCV Antigen-Antibody Combined HCV Assay in Hepatitis C Diagnosis. Dev. Biol. (Basel), 2007, 127: 113-121. Laperche S., Le Marrec N., Girault A., Bouchardeau F., Servant-Delmas A., Maniez-Montreuil M., Gallian P., Levayer T., Morel P., Simon N. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-hcv antibodies improves the early detection of HCV infection. J. Clin. Microbiol. 2005, 43(8): 3877-83. Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1045. Rider P.J. and Liu F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32. Schnuriger A., Dominguez S., Valantin M.A., Tubiana R., Duvivier C., Ghosn J., Simon A., Katlama C. and Thibault V. Early Detection of Hepatitis C Virus Infection by Use of a New Combined Antigen-Antibody Detection Assay : Potential Use for High-Risk Individuals. J. Clin. Microbiol. 2006, 1561-1563. 13 [HU]

Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39 : 1147-1171. Widell A., Busch M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281. 14 [HU]

15 [HU]

16 [HU]

17 [HU]

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 2014/09 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 862224 www.bio-rad.com 18 [HU]