A kromatográfia története

A kromatográfia története Legendák: Leslie S. Ettre Mózes: édesvíz készítése : fa merítése ioncsere : Arisztotelész édesvíz készítése: agyagon ioncsere Pliniusz: FeSO4 papiruszon papír

Kromatográfia elıfutárai 1.Ferdinánd RUNGE, XIX. sz közepe Pigmentek: cirkuláris papír vagy vékonyréteg kromatográfia koffein, fenol, anilin, kinolin mővészi színes alakzatok 2.Fridrich GOPPELSROEDER, XIX-XX.sz Kapilláris analízis: vizes oldatot cseppentve szőrıpapírra a víz gyorsabban mozog Adszorpció korlátozott diffúzió 3.LIESEGANG: 1927 1943: papirkromatográfia: oldatot papirra cseppantve, szárítás, kifejlesztés: alkohol, vagy víz kereszt-kapilláris analízis kétdimenziós kromatográfia Martin és Synge. Anglia 4.David Talbot DAY 1897-1911: Nyersolajat üledékeken, agyagpalákon vezet át a. elsıdleges nehézolaj b. másodlagos könnyőolaj Párizs 1900

Kromatográfia kialakulása Mихauл Ceмёновuч ЦВЕТТ (Cvett,Tswett) (1872-1919) Olaszország-Genf (egyetem botanika)-varsó-nyizsnij Novgorod-Tartu- Voronyezs 1903: Az adszorpciós jelenségek új kategóriái és ezek biokémiai alkalmazása Szorbens oszlopok-növényi pigmentek Kromatográfia chrom graph klorofil oldása zöld levélbıl: petroléter petroléter+alkohol 1%

Kromatográfia a 30-as években Oszlopkromatográfia Karrer Kuhn Ruzicka Svájc: karotének Németország: karotének, vitaminok Svájc: terpének Kuhn, Winterstein, Lederer karotén, xantofill Vékonyréteg kromatográfia Iszmailov: Harkov: Al 2 O 3 üveglemezen tinktúrák

1. Svájc: Karrer, Ruzicka 2. USA: Zechmeister, Pasadena Strain, Stanford Kromatográfia a háborús években 3. Svédország, Uppsala: Tiselius: Nobel díj Frontális kiszorításos eluciós refraktiv index (törésmutató) mérése az eluensben 4. Anglia: Martin-Synge: megoszlásos kromatográfia állófázis:szilikagélen kötött H 2 O mozgó fázis: 0,5% C 2 H 5 OH (kloroformban) gyapjú hidrolizátum: primér aminosavak elválasztása Bevezeti az elméleti tányérszám fogalmát Megjósolják: gáz-folyadék kromatográfia lehetıségét James-Martin Lejrják: papír kromatográfia alapelveit Bevezetik az Rf fogalmát Bevezetik a ninhidrin próbát

Kromatográfia a háború utáni években I. Fordított fázisú kromatográfia Martin-Howard: zsírsavak Állófázis: szilikagél dimetil-diklór szilánnal kezelve + n-oktán (70% vizes CH 3 OH-val telítve) Mozgó fázis: vizes CH 3 OH (n-oktánnal telítve) Gradiens elució kezdete: 70%-80% vizes CH 3 OH Gradiens elució : Tiselius Szén oszlop: - vizes C 2 H 5 -OH 0-20% folyamatos Papirkromatográfia 1944: Consden, Gordon, Martin szervetlen vegyületek, aminosavak (kétdimenzió). Eluens: fenol+0.3%nh 3 Réteg-vékonyréteg kromatográfia Egon STAHL: rétegkészítı, standardizálás

Kromatográfia a háború utáni években II. Ioncserés kromatográfia Taylor, Urey-Glueckauf Manhattan terv: Li, K elválasztása zeoliton, szintetikus gyanta (Amberlit IR-100) + citrát eluens: transzurán elemek elválasztása Gélkromatográfia Porath és Flodin (Uppsala) dextrán epiklórhidrinnel térhálósítva (Sephadex) Affinitás kromatográfia Gázkromatográfia szilikagél, aluminiumoxid, szén adszorbensek megosztó folyadékok HPLC 1956: van Deemter 1963: Giddings: 2-20-µm szemcsék GC-hez hasonló hatékonyság

Nobel díjasok Karrer 1937: karotének Kuhn 1938 : karotének Ruzicka 1939 : terpének Tiselius 1943 : adszorpciós analizis Martin 1952 megoszlásos kromatográfia Du Vigneaud 1955 oxytocin Sanger 1958 inzulin

A kromatográfia elméleti alapjai

Elválasztástechnikai megoldások 1. A különbözı fizikai-kémiai tulajdonságú komponensek megoszlása az álló- és mozgófázis között eltérı (kvázi egyensúly) 2. A töltéssel rendelkezı részecskék töltésüknek, méretüknek megfelelıen, elektromos erıtérben, eltérı sebességgel mozognak (Elektroforézis) Felosztás alapja: 1. Mozgó- és állófázis minısége 2. Kényszeráramot létrehozó erı: nyomáskülönbség elektromos erıtér

Elválasztástechnikai megoldások Kényszeráramlást okozó erı Nyomáskülönbség Elektromos erıtér Gáz kromatográfia GC Szuperkritikus kromatográfia SFC Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC Mozgó fázis gáz szuperkritikus fluid folyadék folyadék Szilárd GSC SFC TLC IC GPC,SEC Normal phase (HPLC-NP) CE GEL ELFO Álló fázis Folyadék GLC SFC PC Reversed phase (HPLC-RP)

A kromatográfiás elválasztások Frontális kromatográfia 1. Csak a legkisebb szorpciójú alkotó (A) (egy részlete) különíthetı el! 2. Regenerálni kell az oszlopot!

Kiszorításos kromatográfia A kiszorító anyag (K) telíti a rendszert: regenerálni kell a rendszert Alkalmazási terület: ionkromatográfia, preparatív elválasztás

Elúciós kromatográfia Analitikai információ: 1.minıségi: t (retenciós idı) 2.mennyiségi: A (csúcs területe) 1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció Az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny elhanyagolható az eluenséhez képest Nincs szükség regenerálásra

Kölcsönhatások a kromatográfiában 1. Fizikai kölcsönhatások -szorpciós: adszorpciós abszorpciós (oldódás, megoszlás) kemiszorpció -hidrofil- kölcsönhatások -hidrofób- kölcsönhatások -méret szerinti kölcsönhatások 2. Kémiai kölcsönhatások -sav-bázis kölcsönhatás -komplex képzıdés -H-hidas kölcsönhatások 3. Biokémiai kölcsönhatások -biokémiai affinitás

Fázis egyensúlyok (Partition coefficiens; distribution constant) K = C C s M K : megoszlási hányados C : egyensúly koncentráció K = C K = g K = s W W ( s) ( M) M i W W i ( s) / V s / V ( M ) M i W W i ( s) / W / V s ( M ) M i i / A / V s fázisok térfogat egységre vonatkoztatva szilárd fázis esetén : szilárd fázis tömegére vonatkoztatva adszorpciós kromatográfia : szilárdfázis felületegységére vonatkoztatva ahol W V ( s) i( M) i W S és W sés V M A S i komponens tömege az álló és mozgó fázisban álló és mozgó fázis térfogata álló fázis tömege álló fázis felülete

KROMATOGRÁFIÁS ALAPFOGALMAK

A kromatográfiás folyamat Következmény: A komponensek eltérı sebességgel vándorolnak (differenciális migráció) A kromatográfiás folyamat elırehaladtával a sávok kiszélesednek (band broadening)

Differenciális migráció áramlás szemcsés tölteten (üres csıben) L,t M pi,ui, Fi p0,u 0, F0 Lineáris áramlási sebesség nyomásgradiens Boyle törvény : p u 0 ( pi / po ) ( p / p ) 0 = 3 1 u = u o = u 0 j 3 2 1 i o 2 pu X és t dp dx u M = = u = L u j o p,u,f o K dp η dx L t M u: lineáris áramlási sebesség K : specifikus permeabilitás (cm 2 ) η: viszkozitás cp (10-3 Pa s) dp/dx: nyomásgradiens L: kolonnahossz t M : holtidı j: nyomáskorrekciós faktor ( Martin, James) Lineáris sebesség : u L Lq F F u = = = u = 2 t t q q r πε M M ( cm / min) ε : töltet porozitás ( szabad térfogat)

Retenciós adatok Retenciós idı: t R Holt idı: t M (t 0 ) Redukált retenciós idı: t R = t R - t M Retenciós térfogat: V R = Redukált retenciós térfogat: R R ( R M ) R M V V = t t R F F = t t F = V V Nettó retenciós térfogat: (GC) N R ( R M ) R M = jv = j t t F = jv jv Fajlagos retenciós térfogat: (GC) V g VN 273 = ml : m T L megosztófolyadék tömege

Retenciós faktor (k ) A komponens az elválasztás során mennyi idıt tartózkodott az állófázison viszonyítva a mozgófázisban eltöltött idıhöz képest. k : a kvázi egyensúly megoszlási hányadosa, ha az anyagmennyiséget mólban mozgófázis adjuk meg állófázis k = n S /n M

Retenció a kromatográfiában Az X sáv mozgása x u x = ur R=0 u x =0 u : cm/min : a mozgófázis lineáris áramlási sebessége u X : cm/min: az x sáv lineáris áramlási sebessége u x = ur 0<R<1 0<u x <u R = n s n + M ha : R = 0 ux = 0 ha : R = 1 ux = u n M R=1 u x =u R : az anyag mozgófázisbeli hányada R = n s n + M n M

M s n n k = n : x móljainak száma = + k 1 M M s M M M s n n n n n n n + = + k n n n R M s M + = + = 1 1 u u R x = k u u x = 1+ R X X R t L u u L t = = M M t u L u L t = = ( ) k t u ut t M x M R + = 1 M M R t t t k = M t = t 0 : retenciós faktor Retenciós faktor (k ): a kvázi egyensúly megoszlási hányadosa, ha az anyagmennyiséget mólban adjuk meg k

V R = t R F F : 3 cm / min V M = t M F V Figyelembe véve: állófázis térfogatát mozgófázis térfogatát t F M M = ( ) M VR = tr = VM 1+ k tm V S V M V k = n n S M 3 n = x V s M s M s M x s : mol / dm 3 n = x V : mol / dm x M k = V k = K V M xsv x V M s = s M K β K = x x S M β = V V M s k = K V V M ß: fázisarány s

k értékét a komponens megoszlására jellemzı termodinamikai folyamat szabja meg Több komponens elválasztása esetén a szelektivitási tényezı (elválasztási faktor) α az a paraméter, mely termodinamikai alapon megmutatja, hogy lehetséges-e az elválasztás α = 2 k ' 1 A megfelelı szelektivitási tényezıhöz megfelelı kinetikai hatékonyságnak kell párosulni

Az elúciós folyamat feltételei: 1. Dugószerő mintabevitel 2. A mozgófázis a kromatogram kifejlesztése alatt állandóan áramlik az állófázis felett 3. A mozgófázis szorpciója kisebb mértékő, mint a legkevésbé kötıdı minta komponensé

Elúciós kromatográfia: kvázi egyensúlyok sorozatán keresztül megy át a rendszer A szorpciós izoterma lineáris szakaszán dolgozunk A minta mennyiségének növelésével elérjük a nemlineáris szakaszt, ahol a stacioner fázis felületén adszorbeált anyagmennyiség nem növekszik arányosan. Ennek két következménye van: 1. A kromatográfiás csúcs kiszélesedik 2. A retenciós idı változik

A kromatográfiában arra törekszünk, hogy a megoszlási hányados független legyen a koncentrációtól és a csak a hımérséklettıl függjön. A megoszlási izotermák lineáris szakaszain dolgozunk. Egy mólnyi anyag mozgó fázisból az álló fázisba való kerülésére érvényes: G i = -RT ln K i

Az egyensúlyi elmélet alapján megadható: 1. A kromatográfia általános egyenlete, mellyel a retenció jellemezhetı (k ) 2. Kvalitatíve értelmezi a csúcstorzulásokat (megoszlási izoterma) 3. Értelmezi a megoszlási hányadost 4. Értelmezi a két komponens elválasztásához szükséges termodinamikai kritériumot. K = x S /x M Gi = -RT ln K i Nem ad választ: Milyen a koncentráció eloszlás a kolonnában való elırehaladás során Milyen tényezık befolyásolják ezt Milyen tényleges kölcsönhatások vezetnek az elválasztáshoz

Az elúciós kromatográfiás folyamat Következmény: A komponensek eltérı sebességgel vándorolnak (differenciális migráció) A kromatográfiás folyamat elırehaladtával a sávok kiszélesednek (band broadening)

A sávszélesedés szemléltetése jel 1. j e l idı Sávszélesedés (band broadening) magyarázatául szolgáló elméletek: 1. TÁNYÉRELMÉLET 2. SEBESSÉGI ELMÉLET 3. KINETIKUS ELMÉLET

1. Tányérelmélet A különbözı kromatográfiás rendszerek összevetéséhez relatív zónaszélesedést adunk meg amit elméleti tányérszámmal (N) fejezünk ki. Elméleti tányér a kolonna azon szakasza, ahol a kvázi-egyensúly létrejön (hasonló a desztillációhoz).

A kromatográfiás csúcsra jellemzı koncentráció egyenlete: C 1 t F m e σ 2π t 0.5[( t R t )/ σ ] 2 Ahol: C F m σ t,, t t R a csúcs bármely pontjában jellemzı koncentráció térfogati áramlási sebesség a kolonnára adagolt minta mennyisége zónaszélesedés (variancia) idıben kifejezve választható idı a komponens retenciós ideje a variancia: σ = W 1/2.x4 vagy w = 4 σ

2 2 1/ 2 2 5,54 16 = = = W t W t t N R R R σ A w 1/2 a kolonna hosszának függvénye, akkor is, ha a két kolonna azonos kinetikai hatékonyságú Elméleti tányérszám (N) számítása

Elméleti tányérszám (N) számítása N = t 2 R 2 t σ = 2 L σ 2 L L: kolonna hossz σ t2 : idıben kifejezett variancia négyzet σ L2 : hosszúságban kifejezett variancia négyzet A számolásoknál a variancia (σ) helyett pontosabb, a csúcsalapon mért 4σ értéket (w) használata t t 2 R = 16 w = 5,54 w 1/ 2 N R 2

Elméleti tányérszám számítása aszimmetria faktor figyelembevételével Aszimmetria faktor = a/b N H t R 41,7 W N 0,1 = a 1,25 + b = [ 2]

Egy elméleti tányérnak megfelelı oszlophossz: HETP (H) (mm; cm) HETP (H) (height equivivalent to the theoretical plate): H = N

A tányérelmélet feltételezései: Az elméleti tányérokon pillanatszerően beáll az egyensúly A megoszlási hányados független a koncentrációtól A mozgófázis szakaszosan megy egyik tányérról a másikra A kolonna hossztengelye irányában a diffúzió elhanyagolható Ezek a feltételek nem mindig teljesíthetıek

2. Sebességi elmélet Kisérleti tapasztalat alapján: H függ a lineáris áramlási sebességtıl (u) A függvény alakja : hiperbola H [mm] u [cm/s]

H függése a lineáris áramlási sebességtıl (u) gázkromatográfiás töltet esetén

H függése a lineáris áramlási sebességtıl (u) folyadékkromatográfiás töltet esetén

H - u görbe (hiperbola) alakja függ : 1. - a töltet szemcseátmérıjétıl 2. - az eluens viszkozitásától 3. - az elválasztás hımérsékletétıl 4. - az elválasztandó molekula méretétıl (a minta mozgófázisbeli (D M ) és állófázisbeli (D S ) diffúziós állandójától) d p η T D M és D S

HETP függése a töltet szemcseméretétıl GC esetén

H u görbék különbözı szemcseátmérıjő (d p ) tölteteken H u

H-u görbe függése a viszkozitástól (η) η 1 < η 2 GC: H 2, He, N 2, Ar 1. HPLC: 2. NP: H 2 O, MeCN, MeOH 3. RP: n-hexán, etanol,propanol, butanol D 15 2 21/ 2 7,4x10 ( η ) M= 0.6 V M

H-u görbe függése az eluens minıségétıl (viszkozitástól, GC esetén)

H-u görbe függése a hımérséklettıl (T) D 15 2 21/ 2 7,4x10 ( η ) M= 0.6 V M

H-u görbe függése a megosztófolyadék mennyiségétıl (GC esetén)

H-u görbe függése a kolonna átmérıtıl (GC esetén)

A viszkozitás (η) és a hımérséklet (T) a minta mozgófázisbeli diffúziós állandóján keresztül (D M ) befolyásolja a H-u görbe alakját Wilke-Chang: η, T és D M összefüggése D 15 2 2 1/ 2 7,4x10 ( η ) M= 0.6 V Kisérletileg bizonyított: M M 2 : oldószer móltömege Ψ 2 : asszoc. konstans H 2 O : 2,6 V : minta móltérfogata CH 3 OH : 1,5 η : viszkozitás T: abszolút hımérséklet u= 1.0 cm/s η nı 2x H nı 20% η nı 2x t R nı 2x (elválasztási idı)

A sebességi elméletek feltételezései: A kolonnán az áramlási sebesség sugárirányban változik az eltérı keresztmetszető csatornák miatt (Eddy diffúzió) Az állófázisból a mozgófázisba való anyagátmenet gátolt (anyagátadási gátlás a mozgófázisban, a mozgófázis álló részében és az állófázisban) Longitudinális (hosszirányú) diffúzió történik, melynek zónaszélesítı hatása annál nagyobb, minél tovább tartózkodik a komponens a kolonnán

A sebességi elmélet szerint a csúcsszélesedés oka (van Deemter, Knox, Giddings): 1. Áramlási - nem egyensúlyi- folyamatok 2. Diffúziós folyamatok 3. Anyagátadási folyamatok A H-u görbe alakját befolyásoló részfolyamatok d p (d f ), η, D M, D s paraméterekkel kifejezve porózus tölteten

Csúcsszélesedést kiváltó folyamatok H értékei additívek: a H-u függvény (van Deemter, 1956) Örvénydiffuzió (Eddy-tag) Anyagátadási gátlás a mozgófázisban Longitudinális diffúzió Anyagátadási gátlás mozgófázis álló részében Anyagátadási gátlás az állófázisban H = C e d p + C m d p2 u/d + C M C sm d p 2 u/d + d D M /u + M C s d f2 u/d S Ahol: d p, szemcseátmérı; d f, folyadékfilm vastagsága a szemcsén; D M, a minta mozgófázisbeli diffúziós állandója; D s, a minta állófázisbeli diffúziós állandója; C e, C m, C d, C sm és C s állandók;

H = 1 C d+ 1 p e C M H-u függvény új alakja 1 d D 2 p M u C d M C S M d D M p u + + + C S d D 2 f s u A H-u függvény alakja jobban közelíti a valóságot, ha az elsı két tag reciprokát vesszük Általában H kicsi, ha: 1. - kicsi a szemcseátmérı 2. - kicsi az áramlási sebesség 3. - kicsi az eluens viszkozitás 4. - nagy az elválasztás hımérséklete 5. - kicsi az elválasztandó molekula d p u η T D M és D S (nagy)

A sebességi elmélettel számolt csúcsszélesedési adatok akkor igazak, ha teljesülnek a gázokra és folyadékokra jellemzı fiz.-kém. paraméterek paraméter gáz Szuperkrit. fluid folyadék Diffúziós koefficiens 10-1 10-4 10-3 10-5 (cm 2 sec -1) Sőrőség (g cm -3 ) 10-3 0,3 0,8 1 Viszkozitás (poise) 10-4 10-4 10-3 10-2 Reynolds szám 10.. 10 2

Redukált sebességi egyenlet (a sebességi egyenlet egyszerősítése) Redukált tányérmagasság (h): h = H/d p egy elméleti tányérnak megfelelı oszlophosszban (H) levı töltetszemcsék száma (d P ) H = C e d p + C m d p2 u/d M + C d D M /u + C sm d p2 u/d M + C s d f2 u/d S (/d p vagy d f ) H/d p = C e d p /d p + C m d p2 u/d M d p + C d D M /u d p + C sm d p2 u/d M d p + C s d f2 u/d S d f h = C e + C m d p u/d M + C d D M /u d p + C sm d p u/d M + C s d f u/d S

Redukált sebesség (ν): ν = d p u/d M A mozgófázis áramlási sebességének (u) és a komponens mozgófázisbeli diffúziós állandójának (D M ) aránya egy töltetszemcsére (d p ) vonatkoztatva h = C e + C m d p u/d M + C d D M /u d p + C sm d p u/d M + C s d f u/d S h = C e + C m ν + C d /ν + C sm ν + C s ν h = A + B/ν + Cν ahol: C e = A; C d =B és (C m +C sm +C s ) = C

A sebességi egyenlet a redukált mennyiségek figyelembevételével h 1 C+ 1 + C Mν ν + C ν = S M e C d h = A + ν Ha + C ν C νm elhanyagolható h ν

Knox egyenlet Knox figyelembe veszi az 1/C M ν tagot (mozgófázisbeli anyagátadás) h B = Aν 0, 33 + + Cν ν h min : ν = 0.1-10 ez megfelel 0.01 0.1 cm/s lineáris áramlási sebességnek Gyakorlatban: ν = 3-20

A redukált tányérmagasság (h) értékének változása a redukált lineáris sebesség (ν) függvényében ν h 0,1 1 5 10 20 50 100 500 1000 porózus 20 3,05 2,35 2,85 3,79 6,18 9,59 32,8 59,8 porózus felülető 20 3 2,12 2,37 2,85 3,83 4,89 9,28 12,8 Ha: 3 < ν < 10 h = 3-4 h >> rosszul töltött oszlop 30< ν < 1000 h ~ 20 h >> töltet nem megfelelı

A sebességi egyenlet különbözı alakjai h B = Aν 1/ 3 + + Cν ν h = A B + + ν 1+ E / ν ν C Knox Scott h = 1+ A E / ν B ν + + Cν + D 1/ 2 ν 1/ 2 Horváth h = 1+ A E / ν B ν + ν + + C D 1/3 ν 3/ 2 Giddings

Egyéb kromatográfiás alapfogalmak

A kolonnák jellemzése áramlástani szempontból Kolonna nyomásesése (Darcy) u = Ko η Δ PLε P: nyomásesés (bar; 10 5 Pa) η: viszkozitás (10-3 Pa s) K : specifikus permeabilitás (cm 2 ) ε: porozitás L: kolonnahossz A specifikus permeabilitás (K, áteresztı képesség) és a szemcseátmérı (d p ) Carman Kozeny-féle összefüggése K 0 = 180 d p 1 ε2 ε ( ) 2 GC: ε 0.5 HPLC: ε 0.7-0.8 (porózus) ε 0.4 (pellicular)

A specifikus permeabilitás (K, áteresztı képesség) és a szemcseátmérı (d p ) Kirkland-féle összefüggése K0 d d r p K0 p K0 c = 1 GC = 1 HPLC = 8 üres csı (rc sugár) 8 0 0 0 1. Ha d p kicsi, u úgy lehet állandó, ha: p nı vagy 2. ha L csökken

Áramlástani szempontból a kolonna jóságát áramlási ellenállásával (Φ) jellemezzük (flow resistance) Φ = Δ p d p 2 η L t M φ 250 pellicular φ 500 porózus gömb φ 1000 szabálytalan Specifikus permeabilitás (K ), szemcseátmérı (d p ) és áramlási ellenállás (φ ) összefüggése K0 = d p Φ

Ha a kolonnán kialakuló nyomásesést a redukált tányérmagassággal h=h/d p adjuk meg, akkor az elválasztási ellenálláshoz (E) jutunk (Bristow, Knox: separation impedance) Δ p = Φ d p 2 t M 2 u = t M H = L/N ebbıl L 2 = H 2 N 2 = N 2 h 2 d p 2 Δ p = Φ 2 N2 t M Ebbıl Φ h 2 dimenziómentes szám: E (elválasztási ellenállás) E = Φ h 2 töltött kolonnákra: h = 2 Φ = 500 E < 2000-5000

Töltött és üres csı kolonnák áramlása R e = d p uσ / η R e : Reynolds szám σ: sőrőség (g cm -3 ) R e < 10 (lamináris) 10< R e < 2000 (átmeneti) 2000 < R e (turbulens)

Összegezve egy jó kolonna minıségi jellemzıit: 1 < k < 10 α > 1,05 N > 1000 h min 2 ν opt 2 3 Φ 2000-5000

A kromatográfia kinetikus elmélete (Monolit töltet értelmezése)

Szabályos (gömb) és szabálytalan (irreguláris) töltetek

Monolit töltet Szilikagél töltet. Karakterisztikus paraméter : pórúsátmérı és falvastagság összege Polimer töltet. Karakterisztikus paraméter : pórúsátmérı és falvastagság összege

A van Deemter, Knox elmélet hátrányai: 1. Nem veszi figyelembe mekkora nyomásesés kell egy adott N eléréséhez 2. Különbözı morfológiájú töltetek összevetése nehéz: Szemcsés töltet: d p Monolit töltet: pórusátmérı, váz szélesség 3. Nem tartalmazza azt az ellenállást, melyet a nyomásesés ( p) és a viszkozitás (η) változása okoz adott elméleti tányérszám elérésekor 4. Ezt egy új paraméter, az elválasztási ellenállás (E) adja meg

Az új összefüggés alapot teremt a kolonnák összehasonlítására E = Δ pη t M N2 Az összehasonlításhoz rögziteni kell a p/η értékét, mert D M az η függvénye és az η függ a mozgó fázis összetételétıl. Másrészrıl E a d p vagyis a szemcseátmérı illetve struktúra (monolit oszlop) függvénye

A Knox összefüggés szemcsés és monolit kolonnákra h B = Aν 0, 33 + + Cν ν 5 µm monolit 3 µm Az ábra nem mutatja mekkora az E értéke a három kolonnára

Szemcsés és monolit töltető kolonnák összehasonlítása elválasztási ellenállás (E) alapján 5 µm monolit Áramlási ellenállás oldalról nézve: monolit jobb mint a szemcsés

Szemcsés és monolit töltető kolonnák összehasonlítása p F összefüggés alapján Nyomásesés ( p) szempontjából a monolit elınyösebb, mint a szemcsés. De redukált elméleti tányérmagasság (h) szempontjából nem egyértelmő.

Összefüggések az eltérı strukturájú kolonnák összehasonlítására 0 0 u N H t = = 2 0 0 0 u K η Δ p t 0 0 H η N K Δ p u = = H u K η Δ p N 0 0

Elérhetı elméleti tányérszám (N) és a hozzá tartozó t 0 idı összefüggése N H t 0= u 0 5µm monolit Elınyös: nagy N monolit gyors elválasztás kis d p Új információ, mely a van Deemter, Knox egyenletbıl nem következik Az y-tengely több nagyságrendet fut be. t 0 /N ábrázolás elınyösebb.

Elérhetı elméleti tányérszám (N) és a hozzá tartozó t 0 /N összefüggése N H t 0 = u 0 5µm monolit Elınyös: nagy N monolit gyors elválasztás kis dp Új információ, mely a van Deemter, Knox egyenletbıl nem következik. A görbe nem hasonlít a van Deemter egyenlethez. További transzformációk.

Kinetikus elmélet igazítása a van Deemter egyenlethez Két transzformációt hajtunk végre t 0 /N 2 - N Abszcissza megfordítása monolit 5µm monolit 5µm t E : az elválasztás ellenállása, egy adott elválasztáshoz szükséges ráfordítás

A kinetikus görbe végleges transzformációja t 0 /N 2 (t E ) N összefüggés Zónaszélesedés: minimumtól balra: a hosszirányú diffúzió szabja meg (B tag) minimumtól jobbra: anyagátadási ellenállás (C tag)

E min és N opt szerepe monolit 5µm Kinetikus görbéknél E min és N opt együtt kell megadni Bonyolult elválasztások: monolit (nagy N opt ) Gyors elválasztások: szemcsés (nagy E 0 )

Adott elméleti tányérszám eléréséhez szükséges ellenállási idı monolit 5µm Kinetikai görbék megadják mennyi idı szükséges 10000 vagy 20000 elméleti tányérszám eléréséhez szemcsés vagy monolit tölteten. Sebességi elmélet nem ad választ.

Oszlopon kívüli sávszélesedés A komponens V x térfogata Az oszlopon V B (V B =t B F) Összekötı vezetékekben Detektorcellában Egyéb csatlakozóelemekben V k V i V j térfogatúra szélesedik V i : térfogategységben kifejezett sávszélesedés

Detektorban V B sávszélesség Cél: Ehhez: V B 2 = V V X = V 2 B / 3 + V V 2 x 1 F w + V2 i + V 2 j +K F= 2 ml / min (u = 0,03 ml / s) V p = 20 x 0,03 = 600 µl V x =1/3 x 600= 200 µl

Sávszélesedés számitása V = F π L L 4 D 2 i 2 2 M N Detektorcella: 10 µl V i 100 µl Varianciával kifejezve: σ 2 méret =σ 2 kol+σ 2 külsı

Kromatográfia termodinamikai összefüggései 0 S = Δ H Δ G 0 0 K l n R T Δ G 0 = S M 0 V V k l n R T Δ G = S M 0 0 V V l n R Δ S R T Δ H k l n + + = Van t Hoff: 1 / T l n mechanizmus kutatás M s V V k = K

A Van t Hoff összefüggés ábrázolása ln k Δ 0 Δ 0 l k HR S n = + R + T V l M n V S tgα = - H /R 0 S Δ R + Δ H 0 l n V M V S 1/T

A kromatográfia elméleti alapjai

Elválasztástechnikai megoldások 1. A különbözı fizikai-kémiai tulajdonságú komponensek megoszlása az álló- és mozgófázis között eltérı (kvázi egyensúly) 2. A töltéssel rendelkezı részecskék töltésüknek, méretüknek megfelelıen, elektromos erıtérben, eltérı sebességgel mozognak (Elektroforézis) Felosztás alapja: 1. Mozgó- és állófázis minısége 2. Kényszeráramot létrehozó erı: nyomáskülönbség elektromos erıtér

Elválasztástechnikai megoldások Kényszeráramlást okozó erı Nyomáskülönbség Elektromos erıtér Gáz kromatográfia GC Szuperkritikus kromatográfia SFC Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC Mozgó fázis gáz szuperkritikus fluid folyadék folyadék Szilárd GSC SFC TLC IC GPC,SEC Normal phase (HPLC-NP) CE GEL ELFO Álló fázis Folyadék GLC SFC PC Reversed phase (HPLC-RP)

A kromatográfiás elválasztások Frontális kromatográfia 1. Csak a legkisebb szorpciójú alkotó (A) (egy részlete) különíthetı el! 2. Regenerálni kell az oszlopot!

Kiszorításos kromatográfia A kiszorító anyag (K) telíti a rendszert: regenerálni kell a rendszert Alkalmazási terület: ionkromatográfia, preparatív elválasztás

Elúciós kromatográfia Analitikai információ: 1.minıségi: t (retenciós idı) 2.mennyiségi: A (csúcs területe) 1. nem szorbeálódó eluens folyamatos átáramoltatása 2. minta bevitele 3. elúció Az állófázisra juttatott minta mennyisége igen kicsiny elhanyagolható az eluenséhez képest Nincs szükség regenerálásra

Kölcsönhatások a kromatográfiában 1. Fizikai kölcsönhatások -szorpciós: adszorpciós abszorpciós (oldódás, megoszlás) kemiszorpció -hidrofil- kölcsönhatások -hidrofób- kölcsönhatások -méret szerinti kölcsönhatások 2. Kémiai kölcsönhatások -sav-bázis kölcsönhatás -komplex képzıdés -H-hidas kölcsönhatások 3. Biokémiai kölcsönhatások -biokémiai affinitás

Fázis egyensúlyok (Partition coefficiens; distribution constant) K = C C s M K : megoszlási hányados C : egyensúly koncentráció K = C K = g K = s W W ( s) ( M) M i W W i ( s) / V s / V ( M ) M i W W i ( s) / W / V s ( M ) M i i / A / V s fázisok térfogat egységre vonatkoztatva szilárd fázis esetén : szilárd fázis tömegére vonatkoztatva adszorpciós kromatográfia : szilárdfázis felületegységére vonatkoztatva ahol W V ( s) i( M) i W S és W sés V M A S i komponens tömege az álló és mozgó fázisban álló és mozgó fázis térfogata álló fázis tömege álló fázis felülete

KROMATOGRÁFIÁS ALAPFOGALMAK

A kromatográfiás folyamat Következmény: A komponensek eltérı sebességgel vándorolnak (differenciális migráció) A kromatográfiás folyamat elırehaladtával a sávok kiszélesednek (band broadening)

Differenciális migráció áramlás szemcsés tölteten (üres csıben) L,t M pi,ui, Fi p0,u 0, F0 Lineáris áramlási sebesség nyomásgradiens Boyle törvény : p u 0 ( pi / po ) ( p / p ) 0 = 3 1 u = u o = u 0 j 3 2 1 i o 2 pu X és t dp dx u M = = u = L u j o p,u,f o K dp η dx L t M u: lineáris áramlási sebesség K : specifikus permeabilitás (cm 2 ) η: viszkozitás cp (10-3 Pa s) dp/dx: nyomásgradiens L: kolonnahossz t M : holtidı j: nyomáskorrekciós faktor ( Martin, James) Lineáris sebesség : u L Lq F F u = = = u = 2 t t q q r πε M M ( cm / min) ε : töltet porozitás ( szabad térfogat)

Retenciós adatok Retenciós idı: t R Holt idı: t M (t 0 ) Redukált retenciós idı: t R = t R - t M Retenciós térfogat: V R = Redukált retenciós térfogat: R R ( R M ) R M V V = t t R F F = t t F = V V Nettó retenciós térfogat: (GC) N R ( R M ) R M = jv = j t t F = jv jv Fajlagos retenciós térfogat: (GC) V g VN 273 = ml : m T L megosztófolyadék tömege

Retenciós faktor (k ) A komponens az elválasztás során mennyi idıt tartózkodott az állófázison viszonyítva a mozgófázisban eltöltött idıhöz képest. k : a kvázi egyensúly megoszlási hányadosa, ha az anyagmennyiséget mólban mozgófázis adjuk meg állófázis k = n S /n M

Retenció a kromatográfiában Az X sáv mozgása x u x = ur R=0 u x =0 u : cm/min : a mozgófázis lineáris áramlási sebessége u X : cm/min: az x sáv lineáris áramlási sebessége u x = ur 0<R<1 0<u x <u R = n s n + M ha : R = 0 ux = 0 ha : R = 1 ux = u n M R=1 u x =u R : az anyag mozgófázisbeli hányada R = n s n + M n M

M s n n k = n : x móljainak száma = + k 1 M M s M M M s n n n n n n n + = + k n n n R M s M + = + = 1 1 u u R x = k u u x = 1+ R X X R t L u u L t = = M M t u L u L t = = ( ) k t u ut t M x M R + = 1 M M R t t t k = M t = t 0 : retenciós faktor Retenciós faktor (k ): a kvázi egyensúly megoszlási hányadosa, ha az anyagmennyiséget mólban adjuk meg k

V R = t R F F : 3 cm / min V M = t M F V Figyelembe véve: állófázis térfogatát mozgófázis térfogatát t F M M = ( ) M VR = tr = VM 1+ k tm V S V M V k = n n S M 3 n = x V s M s M s M x s : mol / dm 3 n = x V : mol / dm x M k = V k = K V M xsv x V M s = s M K β K = x x S M β = V V M s k = K V V M ß: fázisarány s

k értékét a komponens megoszlására jellemzı termodinamikai folyamat szabja meg Több komponens elválasztása esetén a szelektivitási tényezı (elválasztási faktor) α az a paraméter, mely termodinamikai alapon megmutatja, hogy lehetséges-e az elválasztás α = 2 k ' 1 A megfelelı szelektivitási tényezıhöz megfelelı kinetikai hatékonyságnak kell párosulni

Az elúciós folyamat feltételei: 1. Dugószerő mintabevitel 2. A mozgófázis a kromatogram kifejlesztése alatt állandóan áramlik az állófázis felett 3. A mozgófázis szorpciója kisebb mértékő, mint a legkevésbé kötıdı minta komponensé

Elúciós kromatográfia: kvázi egyensúlyok sorozatán keresztül megy át a rendszer A szorpciós izoterma lineáris szakaszán dolgozunk A minta mennyiségének növelésével elérjük a nemlineáris szakaszt, ahol a stacioner fázis felületén adszorbeált anyagmennyiség nem növekszik arányosan. Ennek két következménye van: 1. A kromatográfiás csúcs kiszélesedik 2. A retenciós idı változik

A kromatográfiában arra törekszünk, hogy a megoszlási hányados független legyen a koncentrációtól és a csak a hımérséklettıl függjön. A megoszlási izotermák lineáris szakaszain dolgozunk. Egy mólnyi anyag mozgó fázisból az álló fázisba való kerülésére érvényes: G i = -RT ln K i

Az egyensúlyi elmélet alapján megadható: 1. A kromatográfia általános egyenlete, mellyel a retenció jellemezhetı (k ) 2. Kvalitatíve értelmezi a csúcstorzulásokat (megoszlási izoterma) 3. Értelmezi a megoszlási hányadost 4. Értelmezi a két komponens elválasztásához szükséges termodinamikai kritériumot. K = x S /x M Gi = -RT ln K i Nem ad választ: Milyen a koncentráció eloszlás a kolonnában való elırehaladás során Milyen tényezık befolyásolják ezt Milyen tényleges kölcsönhatások vezetnek az elválasztáshoz

Az elúciós kromatográfiás folyamat Következmény: A komponensek eltérı sebességgel vándorolnak (differenciális migráció) A kromatográfiás folyamat elırehaladtával a sávok kiszélesednek (band broadening)

A sávszélesedés szemléltetése jel 1. j e l idı Sávszélesedés (band broadening) magyarázatául szolgáló elméletek: 1. TÁNYÉRELMÉLET 2. SEBESSÉGI ELMÉLET 3. KINETIKUS ELMÉLET

1. Tányérelmélet A különbözı kromatográfiás rendszerek összevetéséhez relatív zónaszélesedést adunk meg amit elméleti tányérszámmal (N) fejezünk ki. Elméleti tányér a kolonna azon szakasza, ahol a kvázi-egyensúly létrejön (hasonló a desztillációhoz).

A kromatográfiás csúcsra jellemzı koncentráció egyenlete: C 1 t F m e σ 2π t 0.5[( t R t )/ σ ] 2 Ahol: C F m σ t,, t t R a csúcs bármely pontjában jellemzı koncentráció térfogati áramlási sebesség a kolonnára adagolt minta mennyisége zónaszélesedés (variancia) idıben kifejezve választható idı a komponens retenciós ideje a variancia: σ = W 1/2.x4 vagy w = 4 σ

2 2 1/ 2 2 5,54 16 = = = W t W t t N R R R σ A w 1/2 a kolonna hosszának függvénye, akkor is, ha a két kolonna azonos kinetikai hatékonyságú Elméleti tányérszám (N) számítása

Elméleti tányérszám (N) számítása N = t 2 R 2 t σ = 2 L σ 2 L L: kolonna hossz σ t2 : idıben kifejezett variancia négyzet σ L2 : hosszúságban kifejezett variancia négyzet A számolásoknál a variancia (σ) helyett pontosabb, a csúcsalapon mért 4σ értéket (w) használata t t 2 R = 16 w = 5,54 w 1/ 2 N R 2

Elméleti tányérszám számítása aszimmetria faktor figyelembevételével Aszimmetria faktor = a/b N H t R 41,7 W N 0,1 = a 1,25 + b = [ 2]

Egy elméleti tányérnak megfelelı oszlophossz: HETP (H) (mm; cm) HETP (H) (height equivivalent to the theoretical plate): H = N

A tányérelmélet feltételezései: Az elméleti tányérokon pillanatszerően beáll az egyensúly A megoszlási hányados független a koncentrációtól A mozgófázis szakaszosan megy egyik tányérról a másikra A kolonna hossztengelye irányában a diffúzió elhanyagolható Ezek a feltételek nem mindig teljesíthetıek

2. Sebességi elmélet Kisérleti tapasztalat alapján: H függ a lineáris áramlási sebességtıl (u) A függvény alakja : hiperbola H [mm] u [cm/s]

H függése a lineáris áramlási sebességtıl (u) gázkromatográfiás töltet esetén

H függése a lineáris áramlási sebességtıl (u) folyadékkromatográfiás töltet esetén

H - u görbe (hiperbola) alakja függ : 1. - a töltet szemcseátmérıjétıl 2. - az eluens viszkozitásától 3. - az elválasztás hımérsékletétıl 4. - az elválasztandó molekula méretétıl (a minta mozgófázisbeli (D M ) és állófázisbeli (D S ) diffúziós állandójától) d p η T D M és D S

HETP függése a töltet szemcseméretétıl GC esetén

H u görbék különbözı szemcseátmérıjő (d p ) tölteteken H u

H-u görbe függése a viszkozitástól (η) η 1 < η 2 GC: H 2, He, N 2, Ar 1. HPLC: 2. NP: H 2 O, MeCN, MeOH 3. RP: n-hexán, etanol,propanol, butanol D 15 2 21/ 2 7,4x10 ( η ) M= 0.6 V M

H-u görbe függése az eluens minıségétıl (viszkozitástól, GC esetén)

H-u görbe függése a hımérséklettıl (T) D 15 2 21/ 2 7,4x10 ( η ) M= 0.6 V M

H-u görbe függése a megosztófolyadék mennyiségétıl (GC esetén)

H-u görbe függése a kolonna átmérıtıl (GC esetén)

A viszkozitás (η) és a hımérséklet (T) a minta mozgófázisbeli diffúziós állandóján keresztül (D M ) befolyásolja a H-u görbe alakját Wilke-Chang: η, T és D M összefüggése D 15 2 2 1/ 2 7,4x10 ( η ) M= 0.6 V Kisérletileg bizonyított: M M 2 : oldószer móltömege Ψ 2 : asszoc. konstans H 2 O : 2,6 V : minta móltérfogata CH 3 OH : 1,5 η : viszkozitás T: abszolút hımérséklet u= 1.0 cm/s η nı 2x H nı 20% η nı 2x t R nı 2x (elválasztási idı)

A sebességi elméletek feltételezései: A kolonnán az áramlási sebesség sugárirányban változik az eltérı keresztmetszető csatornák miatt (Eddy diffúzió) Az állófázisból a mozgófázisba való anyagátmenet gátolt (anyagátadási gátlás a mozgófázisban, a mozgófázis álló részében és az állófázisban) Longitudinális (hosszirányú) diffúzió történik, melynek zónaszélesítı hatása annál nagyobb, minél tovább tartózkodik a komponens a kolonnán

A sebességi elmélet szerint a csúcsszélesedés oka (van Deemter, Knox, Giddings): 1. Áramlási - nem egyensúlyi- folyamatok 2. Diffúziós folyamatok 3. Anyagátadási folyamatok A H-u görbe alakját befolyásoló részfolyamatok d p (d f ), η, D M, D s paraméterekkel kifejezve porózus tölteten

Csúcsszélesedést kiváltó folyamatok H értékei additívek: a H-u függvény (van Deemter, 1956) Örvénydiffuzió (Eddy-tag) Anyagátadási gátlás a mozgófázisban Longitudinális diffúzió Anyagátadási gátlás mozgófázis álló részében Anyagátadási gátlás az állófázisban H = C e d p + C m d p2 u/d + C M C sm d p 2 u/d + d D M /u + M C s d f2 u/d S Ahol: d p, szemcseátmérı; d f, folyadékfilm vastagsága a szemcsén; D M, a minta mozgófázisbeli diffúziós állandója; D s, a minta állófázisbeli diffúziós állandója; C e, C m, C d, C sm és C s állandók;

H = 1 C d+ 1 p e C M H-u függvény új alakja 1 d D 2 p M u C d M C S M d D M p u + + + C S d D 2 f s u A H-u függvény alakja jobban közelíti a valóságot, ha az elsı két tag reciprokát vesszük Általában H kicsi, ha: 1. - kicsi a szemcseátmérı 2. - kicsi az áramlási sebesség 3. - kicsi az eluens viszkozitás 4. - nagy az elválasztás hımérséklete 5. - kicsi az elválasztandó molekula d p u η T D M és D S (nagy)

A sebességi elmélettel számolt csúcsszélesedési adatok akkor igazak, ha teljesülnek a gázokra és folyadékokra jellemzı fiz.-kém. paraméterek paraméter gáz Szuperkrit. fluid folyadék Diffúziós koefficiens 10-1 10-4 10-3 10-5 (cm 2 sec -1) Sőrőség (g cm -3 ) 10-3 0,3 0,8 1 Viszkozitás (poise) 10-4 10-4 10-3 10-2 Reynolds szám 10.. 10 2

Redukált sebességi egyenlet (a sebességi egyenlet egyszerősítése) Redukált tányérmagasság (h): h = H/d p egy elméleti tányérnak megfelelı oszlophosszban (H) levı töltetszemcsék száma (d P ) H = C e d p + C m d p2 u/d M + C d D M /u + C sm d p2 u/d M + C s d f2 u/d S (/d p vagy d f ) H/d p = C e d p /d p + C m d p2 u/d M d p + C d D M /u d p + C sm d p2 u/d M d p + C s d f2 u/d S d f h = C e + C m d p u/d M + C d D M /u d p + C sm d p u/d M + C s d f u/d S

Redukált sebesség (ν): ν = d p u/d M A mozgófázis áramlási sebességének (u) és a komponens mozgófázisbeli diffúziós állandójának (D M ) aránya egy töltetszemcsére (d p ) vonatkoztatva h = C e + C m d p u/d M + C d D M /u d p + C sm d p u/d M + C s d f u/d S h = C e + C m ν + C d /ν + C sm ν + C s ν h = A + B/ν + Cν ahol: C e = A; C d =B és (C m +C sm +C s ) = C

A sebességi egyenlet a redukált mennyiségek figyelembevételével h 1 C+ 1 + C Mν ν + C ν = S M e C d h = A + ν Ha + C ν C νm elhanyagolható h ν

Knox egyenlet Knox figyelembe veszi az 1/C M ν tagot (mozgófázisbeli anyagátadás) h B = Aν 0, 33 + + Cν ν h min : ν = 0.1-10 ez megfelel 0.01 0.1 cm/s lineáris áramlási sebességnek Gyakorlatban: ν = 3-20

A redukált tányérmagasság (h) értékének változása a redukált lineáris sebesség (ν) függvényében ν h 0,1 1 5 10 20 50 100 500 1000 porózus 20 3,05 2,35 2,85 3,79 6,18 9,59 32,8 59,8 porózus felülető 20 3 2,12 2,37 2,85 3,83 4,89 9,28 12,8 Ha: 3 < ν < 10 h = 3-4 h >> rosszul töltött oszlop 30< ν < 1000 h ~ 20 h >> töltet nem megfelelı

A sebességi egyenlet különbözı alakjai h B = Aν 1/ 3 + + Cν ν h = A B + + ν 1+ E / ν ν C Knox Scott h = 1+ A E / ν B ν + + Cν + D 1/ 2 ν 1/ 2 Horváth h = 1+ A E / ν B ν + ν + + C D 1/3 ν 3/ 2 Giddings

Egyéb kromatográfiás alapfogalmak

A kolonnák jellemzése áramlástani szempontból Kolonna nyomásesése (Darcy) u = Ko η Δ PLε P: nyomásesés (bar; 10 5 Pa) η: viszkozitás (10-3 Pa s) K : specifikus permeabilitás (cm 2 ) ε: porozitás L: kolonnahossz A specifikus permeabilitás (K, áteresztı képesség) és a szemcseátmérı (d p ) Carman Kozeny-féle összefüggése K 0 = 180 d p 1 ε2 ε ( ) 2 GC: ε 0.5 HPLC: ε 0.7-0.8 (porózus) ε 0.4 (pellicular)

A specifikus permeabilitás (K, áteresztı képesség) és a szemcseátmérı (d p ) Kirkland-féle összefüggése K0 d d r p K0 p K0 c = 1 GC = 1 HPLC = 8 üres csı (rc sugár) 8 0 0 0 1. Ha d p kicsi, u úgy lehet állandó, ha: p nı vagy 2. ha L csökken

Áramlástani szempontból a kolonna jóságát áramlási ellenállásával (Φ) jellemezzük (flow resistance) Φ = Δ p d p 2 η L t M φ 250 pellicular φ 500 porózus gömb φ 1000 szabálytalan Specifikus permeabilitás (K ), szemcseátmérı (d p ) és áramlási ellenállás (φ ) összefüggése K0 = d p Φ

Ha a kolonnán kialakuló nyomásesést a redukált tányérmagassággal h=h/d p adjuk meg, akkor az elválasztási ellenálláshoz (E) jutunk (Bristow, Knox: separation impedance) Δ p = Φ d p 2 t M 2 u = t M H = L/N ebbıl L 2 = H 2 N 2 = N 2 h 2 d p 2 Δ p = Φ 2 N2 t M Ebbıl Φ h 2 dimenziómentes szám: E (elválasztási ellenállás) E = Φ h 2 töltött kolonnákra: h = 2 Φ = 500 E < 2000-5000

Töltött és üres csı kolonnák áramlása R e = d p uσ / η R e : Reynolds szám σ: sőrőség (g cm -3 ) R e < 10 (lamináris) 10< R e < 2000 (átmeneti) 2000 < R e (turbulens)

Összegezve egy jó kolonna minıségi jellemzıit: 1 < k < 10 α > 1,05 N > 1000 h min 2 ν opt 2 3 Φ 2000-5000

A kromatográfia kinetikus elmélete (Monolit töltet értelmezése)

Szabályos (gömb) és szabálytalan (irreguláris) töltetek

Monolit töltet Szilikagél töltet. Karakterisztikus paraméter : pórúsátmérı és falvastagság összege Polimer töltet. Karakterisztikus paraméter : pórúsátmérı és falvastagság összege

A van Deemter, Knox elmélet hátrányai: 1. Nem veszi figyelembe mekkora nyomásesés kell egy adott N eléréséhez 2. Különbözı morfológiájú töltetek összevetése nehéz: Szemcsés töltet: d p Monolit töltet: pórusátmérı, váz szélesség 3. Nem tartalmazza azt az ellenállást, melyet a nyomásesés ( p) és a viszkozitás (η) változása okoz adott elméleti tányérszám elérésekor 4. Ezt egy új paraméter, az elválasztási ellenállás (E) adja meg

Az új összefüggés alapot teremt a kolonnák összehasonlítására E = Δ pη t M N2 Az összehasonlításhoz rögziteni kell a p/η értékét, mert D M az η függvénye és az η függ a mozgó fázis összetételétıl. Másrészrıl E a d p vagyis a szemcseátmérı illetve struktúra (monolit oszlop) függvénye

A Knox összefüggés szemcsés és monolit kolonnákra h B = Aν 0, 33 + + Cν ν 5 µm monolit 3 µm Az ábra nem mutatja mekkora az E értéke a három kolonnára

Szemcsés és monolit töltető kolonnák összehasonlítása elválasztási ellenállás (E) alapján 5 µm monolit Áramlási ellenállás oldalról nézve: monolit jobb mint a szemcsés

Szemcsés és monolit töltető kolonnák összehasonlítása p F összefüggés alapján Nyomásesés ( p) szempontjából a monolit elınyösebb, mint a szemcsés. De redukált elméleti tányérmagasság (h) szempontjából nem egyértelmő.

Összefüggések az eltérı strukturájú kolonnák összehasonlítására 0 0 u N H t = = 2 0 0 0 u K η Δ p t 0 0 H η N K Δ p u = = H u K η Δ p N 0 0

Elérhetı elméleti tányérszám (N) és a hozzá tartozó t 0 idı összefüggése N H t 0= u 0 5µm monolit Elınyös: nagy N monolit gyors elválasztás kis d p Új információ, mely a van Deemter, Knox egyenletbıl nem következik Az y-tengely több nagyságrendet fut be. t 0 /N ábrázolás elınyösebb.

Elérhetı elméleti tányérszám (N) és a hozzá tartozó t 0 /N összefüggése N H t 0 = u 0 5µm monolit Elınyös: nagy N monolit gyors elválasztás kis dp Új információ, mely a van Deemter, Knox egyenletbıl nem következik. A görbe nem hasonlít a van Deemter egyenlethez. További transzformációk.

Kinetikus elmélet igazítása a van Deemter egyenlethez Két transzformációt hajtunk végre t 0 /N 2 - N Abszcissza megfordítása monolit 5µm monolit 5µm t E : az elválasztás ellenállása, egy adott elválasztáshoz szükséges ráfordítás

A kinetikus görbe végleges transzformációja t 0 /N 2 (t E ) N összefüggés Zónaszélesedés: minimumtól balra: a hosszirányú diffúzió szabja meg (B tag) minimumtól jobbra: anyagátadási ellenállás (C tag)

E min és N opt szerepe monolit 5µm Kinetikus görbéknél E min és N opt együtt kell megadni Bonyolult elválasztások: monolit (nagy N opt ) Gyors elválasztások: szemcsés (nagy E 0 )

Adott elméleti tányérszám eléréséhez szükséges ellenállási idı monolit 5µm Kinetikai görbék megadják mennyi idı szükséges 10000 vagy 20000 elméleti tányérszám eléréséhez szemcsés vagy monolit tölteten. Sebességi elmélet nem ad választ.

Oszlopon kívüli sávszélesedés A komponens V x térfogata Az oszlopon V B (V B =t B F) Összekötı vezetékekben Detektorcellában Egyéb csatlakozóelemekben V k V i V j térfogatúra szélesedik V i : térfogategységben kifejezett sávszélesedés

Detektorban V B sávszélesség Cél: Ehhez: V B 2 = V V X = V 2 B / 3 + V V 2 x 1 F w + V2 i + V 2 j +K F= 2 ml / min (u = 0,03 ml / s) V p = 20 x 0,03 = 600 µl V x =1/3 x 600= 200 µl

Sávszélesedés számitása V = F π L L 4 D 2 i 2 2 M N Detektorcella: 10 µl V i 100 µl Varianciával kifejezve: σ 2 méret =σ 2 kol+σ 2 külsı

Kromatográfia termodinamikai összefüggései 0 S = Δ H Δ G 0 0 K l n R T Δ G 0 = S M 0 V V k l n R T Δ G = S M 0 0 V V l n R Δ S R T Δ H k l n + + = Van t Hoff: 1 / T l n mechanizmus kutatás M s V V k = K

A Van t Hoff összefüggés ábrázolása ln k Δ 0 Δ 0 l k HR S n = + R + T V l M n V S tgα = - H /R 0 S Δ R + Δ H 0 l n V M V S 1/T

Gázkromatográfia

Kromatográfia felosztása Kényszeráramlást okozó erı Nyomáskülönbség Elektromos erıtér Gáz kromatográfia GC Szuperkritikus kromatográfia SFC Folyadék kromatográfia LC Folyadék kromatográfia LC Mozgó fázis gáz szuperkritikus fluid folyadék folyadék Szilárd GSC SFC TLC IC GPC,SEC Normal phase (HPLC-NP) CE GEL ELFO Álló fázis Folyadék GLC SFC PC Reversed phase (HPLC-RP)

Gázkromatográfia Gas chromatography-gc Gáz-folyadék (GLC) Gáz-szilárd (GSC) Gázkromatográfiával vizsgálható anyagok Bomlás nélkül elpárologtatható (származékképzés) Szilárd-folyadék-gáz 600 móltömegig (közvetlenül 200-300) Analitikai módszerek 50-70%-a kromatográfiás (20-30% ebbıl kb. a GC)

Gázkromatográfiás készülékek Típusai: Rutin elemzést szolgáló készülékek (reporting) Kutató készülékek (analitikai) Hordozható (portable) készülékek Preparatív Folyamat (process) Analitikai készülékek: Töltött kolonnás Vegyes kolonnás Kapilláris GC

Gázkromatográf (GC) tisztító patron injektor detektor PC oszlop gázpalack termosztát nyomásmérı áramlás-szabályozók Részei: 1. Eluensforrás, a gázáramlást biztosító és szabályozó rendszerrel, tisztítóval 2. Mintabeviteli rendszer 3. Kolonna a termosztáttal 4. Detektor 5. Detektorjel erısítésére szolgáló erısítı 6. Jelátviteli rendszer számítógéppel (jelrögzítés, tárolás, feldolgozás)

Vivıgázáram elnevezés tiszta nagy tisztaságú jelölés 2.5 3.0 3.5 4.0 % 99,5 99,9 99,95 99,99 ppm 5000 1000 500 100 Vivıgáz minıségét megszabja: Kolonna: -töltetes: N 2, Ar D M kicsi -kapilláris: He, H 2 ultra 4.5 5.0 6.0 7.0 99,995 99,999 99,9999 99,99999 50 10 1 0,1 Detektor: -TCD: H 2, He -FID: He, Ar, N 2 -ECD: N 2, Ar+CH 4 Acél, alumínium palackok, 100-150 bar nyomással, max. 5 m 3 térfogattal Reduktor: nyomáscsökkentı (a gáz anyagi minıségének és a nyomásnak megfelelıt választani) 100-150 bar-t kell 1-5 bar-ra lecsökkenteni 2 lépésben 1 membránszelep nyomásmérı: 100-150 bar 2 tőszelep nyomásmérı: 1-5 bar

Áramlási sebesség szabályozása Nyomásszabályozás tőszelep Tőszelep: T növekedésébıl eredı áramláscsökkenést nem kompenzálja Áramlási sebesség finom szabályozása membrános áramlásszabályozó T növekedés hatására az áramlási sebesség csökken Membrános áramlásszabályozó, integrált áramkörös nyomásérzékelı fixen tartja az áramlást Áramlási sebesség mérése: szappanhártyás buborékmérı

Mintabemérı (Injektor) A mintabemérés kritikus pont Pillanatszerő, kvantitatív és reprodukálható legyen Minta gáz/gız halmazállapotba kerüljön (főthetı) Eluenssel való elkeveredés Oldószer fókuszálás viszonylag kicsiny térfogat 0,1 µl-1 ml folyadék elpárologtatva: 100-10000 X térfogatnövekedés Bevitt minta mennyiség: töltetes kolonna: 1 mg 1 µg kapilláris kolonna: 50 100 ng

Gáz halmazállapotú minták bemérése Gázmintabemérı csap - mintahurok térfogatának 5-10-szeresét átengedve a mintából biztosítható, hogy a csap elfordításával valóban a minta kerüljön a gázkromatográfba - különbözı térfogatú mérıhurkok (0,25 ; 0,5 ; 1 ml) - bemérıhurok főthetı is, de nem szükséges

Gáz halmazállapotú minták bemérése Fluidisztor - nagysebességő gázkromatográfiában használatos - gyors mintabevitel - számítógépes vezérléssel mőködtethetı

Folyadék halmazállapotú minták bemérése Mikromennyiségő minták bevitele dugattyús mikrofecskendıkkel történik Mintabevitel két fı eleme: - mikrofecskendı - gázkromatográf mintabemérı, elpárologtató része Mikrofecskendık Általában 5-50 µl térfogatúak Teflon végő rozsdamentes acél dugattyú, üvegtest, kalibrált térfogat Hamilton, SGE a leggyakoribb gyártmány

Gázkromatográf mintabemérı része (üveg) betétcsıvel ellátott fémcsı szeptum vivıgáz bevezetés INJEKTOR 1. minta befogadása 2. elpárologtatása 3. oszlopba történı bejuttatása főtıblokk (25 300 o C) liner (betétcsı) kolonna Töltetes oszlopok: nagyobb átmérı: nagyobb mintatérfogat Kapilláris oszlopok: kisebb mintatérfogat

Gázkromatográf mintabemérı része Flash elpárologtató - pillanatszerő elpárologtatás, ha injektor T = Fp+50-70 C - belsı rész üvegbetét korrózió ellen - injektor térfogat kellıen nagy, hogy az elpárologtatás ne okozzon nyomás növekedést, de nem túl nagy mert csökken a hatékonyság

Injektálás Injektor mőködése Elpárologtatás 1. fecskendıvel átszúrjuk a szeptumot 2. minta bevitele mikrofecskendıvel 3. eltávolítjuk a fecskendıt 1. elpárolog a minta 2. kitölti az injektor teljes térfogatát (100 1000 X térfogatnövekedés) 3. elkeveredik a vivıgázzal

gyors injektálás oldószer lassú injektálás A vivıgáz a beadagolt (és elpárologtatott) mintát bejuttatja az oszlopra. 1 µl metanol illetve hexán térfogata 200 C-on 1 illetve 2 ml

Gázkromatográf mintabemérı része Mintaáram elosztó (splitter) - kis mintamennyiség (0,1-0,001 µl) bevitele kapilláris kolonnára - az injektált mennyiség nagyobb (1-2 µl) de a splitter csak 1/10-1/100- ad részét engedi a kolonnára - expanziós tér szükséges - split és splitless üzemmód

Split-splitless injektálás Purge Off Splitless zárva Purge On Split nyitva

Split-splitless technika lépései: 1. Zárt szelepek mellett a mintát az adagolóba juttatjuk. Adagoló hımérséklete 30-40 C-kal kisebb mint az oldószer forráspontja 2. Szelepek zárva (splitless time): 20-120 sec 3. Szelepek nyitva: split és purge ág. A minta 1/10 vagy 1/100 része jut a kolonnára. Szelepek az analízis ideje alatt nyitottak. 4. Kolonna főtése a szelepek nyitásával kezdıdik. A slit-splitless technika nem küszöböli ki a fecskendıben bekövetkezı diszkriminációt.

Splittelés hátrányai A minta alkotói közötti diszkrimináció A splitarány mérés közbeni ellenırizhetetlen megváltozása A flash párologtatás okozta drasztikus termikus hatásra bekövetkezı esetleges termikus degradáció

Oldószerhatás jelentısége: olyan oldószert használunk, mely elegyedik az állófázissal, duzzasztja Adagoló hımérséklete: 30-40 C-al alacsonyabb az oldószer forráspontjánál: minta kondenzálódik az oszlop elején 5:1 200:1 Poláris állófázis: poláris oldószer Apoláris állófázis: apoláris oldószer

Gázkromatográf mintabemérı része On-column injektor - adagolás közvetlenül a kolonna elejére (üveggyapotra) - kolonna elsı 5-10 cm-es része csak töltetet, megosztófolyadékot nem tartalmaz - elpárolgással egyidejőleg az elválasztás is elkezdıdik - expanziós tér lecsökkenthetı - fıleg kapilláris kolonnáknál használják

Gázkromatográf mintabemérı része Cold on-column - hideg injektor, hideg a kolonna eleje - illékony, kevésbé hıálló vegyületek injektálására - kolonna elsı része hideg (hőtés) majd fokozatosan melegszik - nincs lehetıség splittelésre

Gázkromatográfiás detektorok

Gázkromatográfiás detektorok csoportosítása I. Koncentráció érzékeny: a jel arányos a detektorba jutó minta koncentrációjával Tömegérzékeny: a jel arányos a detektorba idıegység alatt jutó minta tömegével II. Univerzális: minden molekulára ad jelet Szelektív: bizonyos vegyülettípusokra ad jelet Specifikus: csak bizonyos molekulákra ad jelet III. Destruktív Nem destruktív

A DETEKTOROK JELLEGGÖRBÉJE Az a (tgα) érzékenység függ az anyagi minıségtıl a kromatográfiás elrendezéstıl (készülék, kísérleti körülmények)

Koncentrációérzékeny detektor: A jel arányos a detektorba kerülı minta koncentrációjával (mg/ml) Érzékenység: a= mv/mg/ml = mv/ml mg Érzékenység (a) helyett egyszerőbb LOD megadása: mg/ml vagy mg Tömegérzékeny detektor: A jel arányos az idıegység alatt a detektorba jutott minta tömegével (mg/s) Érzékenység: a= mv/mg/s = mv/smg Érzékenység (a) helyett egyszerőbb LOD megadása: Koncentrációérzékeny: mg/ml vagy mg Tömegérzékeny: mg/s vagy mg

A jel és zaj viszonyának (s/n) szemléltetése

Folyadékkromatográfiás detektorok jelleggörbéje Dinamikus tartomány: a jel arányos az anyag mennyiséggel Lineáris tartomány: a jel lineárisan arányos az anyagmennyiséggel (5%) Detektálás alsó határa (DAH, LOD): a jel 3x nagyobb, mint a zajszint Mennyiségi mérés alsó határa (LOQ): a jel 10x nagyobb mint a zajszint

A detektor érzékenysége a = s / c illetve a = ds / dc A detektor érzékenysége: az analitikai egyenes meredeksége illetve nem lineáris tartományban a jel koncentráció szerinti deriváltja Az érzékenység alapján nehézkes a detektorok összehasonlítása. Kedvezıbb LOD és LOQ megadása: A kimutatási határ (LOD): az a mintamennyiség, melynek mérésénél a detektor válaszjele egyértelmően megkülönböztethetı a háttértıl (s/n=3/1) A meghatározási határ (LOQ): az a legkisebb anyagmennyiség, amely megfelelı precizitással és pontossággal meghatározható (s/n=10/1)

Gázkromatográfiás detektorok TCD (thermal conductivity detector hıvezetıképességi detektor) FID (flame ionization detector lángionizációs detektor) ECD (electron capture detector elektron befogási detektor) FPD (flame photometric detector lángfotometriás detektor) PID (photo-ionization detector foto-ionizációs detektor) MS(D) ( molecule selective detector tömegspektrometriás detektor)

Hıvezetıképességi detektorok Hıvezetés: 1 sec alatt, 1 m hosszon, 1K hımérsékletkülönbség hatására átáramoltatott hımennyiség (Joule). Mértékegysége: J/msK Anyagi minıségtıl függ.

Gázok hıvezetési tényezıje Gázok hıvezetési tényezıje 0 C-on Gáz J/msK H 2 17.4 He 15 CH 4 3.0 Ar 1.7 O 2 2.4 N 2 2.5 CO 2.3 C 2 H 2 1.9 C 2 H 6 1.9 CO 2 1.5 MeOH 1.4 n-hexán 0.9 Aceton 0.9 Benzol 0.9 H 2 O 2.3 (100 C-on )

Hıvezetıképességi detektor mőködési elve Csak vivıgázáram állandó hıvezetés főtött szál ellenállása állandó Mintát tartalmazó eluens változó hıvezetés főtött szál hımérséklete változik változik az ellenállás detektorjel Tömb hımérséklete: 100-200 C Szál hımérséklete: 800 C vivıgáz vivıgáz+minta Főtött szálak: W, W-Rh, W-Ir, Pt, Pt-Ir Hideg ellenállás: 20-25 Ω; Főtıáram: 10-200 ma

Hıvezetıképesség mérı detektor Wheatstone-híd: ellenállásmérés

Hıvezetıképesség mérı detektor ellenállás megváltozása hıvezetıképesség-mérı detektor (Thermal Conductivity D) (katarométer) hídkapcsolás W-szálak: 100-200 ma főtıáram nem destruktív univerzális dinamikus tartomány: 10 5 LOD: 5-50 ng Vivıgáz: H 2, He N 2

Detektorcellák kialakítása Átáramlásos Vegyes Diffuziós Áramlási sebesség érzékenység nagy közepes kicsi Válaszidı kicsi közepes nagy

Hıvezetıképességi detektorok konvencionális: 0,5-3 cm 3 cellatérfogat (töltött kolonna) félmikrocellás: 25-100 mm 3 cellatérfogat (wide bore kolonna) mikrocellás: 5-10 mm 3 cellatérfogat rétegcellás: 1-10 nl cellatérfogat (integrált mikoráramkörökhöz hasonló, LOD = 10-10 -10-9 g)

Mikrocellás hıvezetıképességi detektor A referencia és mérıágban váltakozva megy a gázáram (10-20 Hz) Váltakozó elektromos érzékelés. LOD kicsiny: 10-8 g

Ionizációs detektorok U =ir Ha: i=10-12 A R=10 10 Ω U=10-2 V elektródok között akkor folyik áram, ha ionokat hozunk létre a mintából

Ionizációs detektorok Az ionizációhoz használt energia típusa: - termikus energia (FID) - kinetikus energia (ECD, MS) - fényenergia (PID) - elektromos energia (kisülési ionizációs detektor DID)

Ionizációs detektorok Lángionizációs detektor (FID) hidrogén/levegı eleggyel táplált mikroégı, amely fölé elektródpárt helyeznek el

Lángionizációs detektor (FID) hidrogén/levegı eleggyel táplált mikroégı, amely fölé elektródpárt helyeznek el kevésbé ionizálható eluens: N 2, Ar, He, H 2 A kolonnát elhagyó szerves komponensek a lángba jutva többlépéses reakcióban, oxigén közremőködésével ionizálódnak, elektronok keletkeznek. a képzıdött ionok (elektronok) hatására áram folyik, ami erısítés után mérhetı C-detektor: minden éghetı anyagra ad jelet destruktív dinamikus tartomány: 10 5-10 6 LOD: 0,05-0,5 ng

A hidrogén-oxigén láng égési mechanizmusa 1. H 2 + O HO 2 2 + H H 1 = 230 kj 2. H + O 2 OH + O H 2 = 68 kj 3. OH + H 2 H + H 2 O H 3 = -63 kj 4. O + H 2 OH + H H 4 = -4.5 kj Rekombinációs reakciók 5. H + OH + X H 2 O + X H 5 = -500 kj 6. H + H + X H 2 + X H 6 = -436 kj 7. O + O + X O 2 + X H 7 = -498 kj Σ H = -1435 kj A láng hımérséklete: 2400-2700 K

Sternberg: C-tartalmú vegyületek a lángban bomlanak, elektronok képzıdnek A képzıdött elektronok száma arányos a C-atomszámmal. 1. C n H m pirolízis n CH. + (m-n)h. 2. n CH. + n O. oxidáció ncho. 3. n CHO. ionizáció ncho + + n e

Tömegérzékeny detektor Detektorjel: arányos az idıegység alatt detektorba jutó C-atomszámmal Detektorjel függ a fajlagos széntartalomtól (R i ~ 12n c /M i ) és az iontermelés fokától a lángban, ahol n c : molekula C-atomszáma; M i : móltömeg A moláris ionizációs hatékonyság: q m q m : az elektródok közt mekkora a töltésátmenet, ha 1 mól anyag kerül a detektorba A detektor jele (R i ): arányos az ionizációs hatékonysággal (q M ), a molekula C-atomszámával (n c ) és az idıegység (t) alatt a detektorba jutó minta mólszámával (n i ) R i = q M 12n M i c A detektor érzékenysége (a D ): magasabb hımérsékleten nagyobb dn dt i

A detektor érzékenysége: 12n π a = γq c Asec/mg D M M 4ln 2 ahol: γ: konstans i A detektorjel (R i ) függ a vivıgáz (N 2, Ar) éghetı gáz (H 2 ) és égést tápláló gáz (levegı) arányától a i a i F levegı /F N2 F H2 /F N2

FID alkalmazhatósága: szerves vegyületek Kivétel: hangyasav, formaldehid Permanens gázok: N 2, O 2, CO, CO 2, SO 2, SO 3, H 2 S, NO, NO 2, N 2 O, NH 3, HX, H 2 O Effektív szénszám: 1 mól alifás C-atomra vonatkoztatott jelnagyság értéke Szénhidrogén Effektív szénszám Alifás C 1.0 Aromás C 1.0 Olefin C 0.95 Acetilén C 1.3 =C=O 0.0 -CH 2 -O-CH 2- -1.0 -CH 2 -OH -0.6 -CH 2 -Cl -0.12 Példa: 1 mól acetilén 1.3-szeres jelet ad mint 1 mól etán

Ionizációs detektorok Alkáli lángionizációs detektor Lényegében: FID Lánghoz közel Rb vagy Cs tartalmú kerámia Mechanizmus: nem tisztázott -a lángban a Rb, Cs atomizálódik -elektronok keletkeznek -ezek N és P tartalmú molekulákat ionizálnak Szelektivitás: P: 2.5x10 4 CH-ekhez viszonyítva N: 2.5x10 5 CH-ekhez viszonyítva

Ionizációs detektorok Ionizációs keresztmetszet detektor Jel: arányos az ionizációs keresztmetszettel (Q) Q= ionizációs potenciál/molekula átmérı Néhány atom ionizációs keresztmetszete: Atom Q H 1.0 He 0.7 Ar 11 Br 18 Detektor ionárama: (I) a minta (Q i ) és az eluens (Q e ) ionizációs keresztmetszetének összege I i = C müszer (m i Q i + m e Q e ) m: tömeg; C müszer : állandó; Gyakorlat: H 2 vivıgáz; LOD: 10-11 g/sec; Lin. din. tart.: 10 5

Ionizációs detektorok β-sugár ionizációs detektor Vivıgáz: Ar (argon dtektor) Lovelock, 1958 He (hélium detektor) Hartman, Dimick, 1966 Ar, He gerjesztése: metastabilis atomok 1. Ar + β- 15.8 ev Ar* + 2e 2. Ar* + Ar + e 2Ar* Metastabil Ar* ionizációs potenciálja: 11.6 ev 3. Ar* + M 11.6 ev M + + e + Ar Különbség az ionizációs keresztmetszet és β sugár ionizációs detektor között: 1: vivıgáz: H 2 illetve Ar 2: polarizációs feszültség: β sugár nagyobb

Ionizációs detektorok Elektronbefogási detektor (ECD) Vivıgáz: N 2 (nagytisztaságú)

Elektronbefogási detektor (ECD) F, O, Cl, Br β-sugárzó radioaktív forrás (pl. 63 Ni) Az elektron áramlás kicsiny (10-12 A) állandó elektromos áramot hoz létre a megfelelı feszültségre kapcsolt elektródok között nagy elektronegativitású elemet tartalmazó komponensek az elektromos térben az elektronokat befogják és így jelentısen csökkentik az áramot öblítıgáz bevezetés öblítıgáz kivezetés trikloridok vegyületcsoport szénhidrogének éterek, észterek alkoholok, ketonok, aminok monobromidok, dikloridok poliklórozott vegyületek (peszticidek) dinamikus tartomány: <10 3 LOD: 0,1-10 pg relatív válaszjel 0 10 100 1000 10000 100000 Vivıgáz: N 2 (nagytisztaságú) anód (+) 63 Ni fólia (-): 1-10 V polarizációs feszültség make up gáz kolonna

ECD detektor jelének alakulása I. 1-10 V polarizációs feszültség: kicsiny ionáram (I 0 =10-12 A) a N 2 ionizációja miatt II. Nagy elektronaffinitású elemek (F, Cl, Br, I) jelenléte ezt az ionáramot csökkenti (I i ) Az ionáram: I i = I e-κiϕici 0 Az ECD nem lineáris detektor, de kis koncentráció tartományban lineáris I i = I 0 (1-e-κ i ϕ i c i ) t (idı) Az ECD detektor jelének idıbeli alakulása A detektorjel: R i = I 0 I i =I 0 κ i ϕ i c i ahol: κ, elektronabszorciós együttható (ml/mól); ϕ i, konstans; c i, koncentráció

Az elektronbefogási mechanizmus nem tisztázott Kimutatási határ (LOD) növelés: pulzáló üzemmód Feszültség kikapcsolás: megnı az elektron koncentráció Feszültség bekapcsolás: nagy ionáram (elektronok befogódnak) Eluensgáz: N 2 Sugárforrás: 63 Ni Alkalmazás: növényvédıszer analízis Probléma: halogénmentes oldószer Extrakció: n-pentán n-hexán

Ionizációs detektorok Fotoionizációs detektor (PID) Fény: diszkrét energia specifikus detektálás nem destruktív Lámpa: Hg gız; Xe Polarizáló fesz: 200-400V LOD: 0.1 pg Lin. din. tart.:10 7 Alkalmazás: aromások olefinek

Ionizációs detektorok Kisülési ionizációs detektor (DID) Elektromos kisülésben a He vivıgáz atomok egy része ionizálódik, ütközéssel He* metastabilis atomok, melyek 24 ev-tal ionizálnak

Lángfotometriás detektor (FPD) Lángban: S-tratalmú vegyületbıl S 2, S 3, S 4, stb keletkezik P-tartalmúból: HPO S 2 : lángban gerjesztés után emisszió: 394 nm HPO: lángban gerjesztés után emisszió: 526 nm Szelektivítás: 10 4, 4 nagyságrenddel érzékenyebb S és P vegyületekre Hátrány: nem lineáris:lg A i = a i lg m i Kétlángos változat: elsı lángban S és P keletkezik, második lángban S 2 és HPO LINEÁRIS a jel és a S és P tartalom között

Plazma emissziós detektor (ICP C, H, N, O, halogén atomokat csak nagy energiával lehet gerjeszteni Ar, He plazma: 7000-12000 K

Kromatogram ICP detektálással Ólomtetraetil kimutatása Plazma emissziós kromatogram

Gázkromatográfiás kolonnák

Gázkromatográfiás kolonnák

Gázkromatográfiás oszlopok) Töltetes: fém vagy üveg töltetes kapilláris Kapilláris: üveg, (fém) Fémcsı: nemkívánatos katalitikus folyamatok Hossz (m) Belsı átmérı (mm) Áramlási sebesség (ml/perc) Tányérszám Kapacitás (µg/csúcs) Film vastagság (µm) töltetes 0,5-5 2-4 10 60 4000 10 1-10 kapilláris 5-100 0,1 0,7 0,5-10 250000 0,1 0,1-10

Töltelékes kolonnák I.D. 2-6 mm Hossz: 0.5 5 m Szemcseátmérı. 0.1 0.3 mm (mesh) Szemcseméret: mesh: 1 inch mentén lévı szitalyukak száma Szemcseátmérı: mesh µm 60 250 80 180 100 150 120 125 140 105

Kapilláris kolonnák csoportosítása mikrokapillárisok: d < 150mm standard kapillárisok: 150mm < d < 500mm makrokapillárisok: d < 0,5 mm

Kapilláris kolonnák típusai védıréteg (poliimid, 350 o C) kvarc d állófázis mikrokapilláris (microbore): d < 150 µm standard kapilláris: 150 µm < d < 500 µm makrokapilláris (widebore): d > 500 µm Kapilláris oszlopok: Adszorpciós: Megoszlásos: PLOT (porózus rétegő nyitott végő oszlop) WCOT (falborítású nyitott végő oszlop) (Porous Layer Open Tubular) (Wall Coated OT) SCOT (hordozóval borított nyitott végő oszlop (Support Coated OT)

SiOH SiOH SiOH SiOH SiOH SiOH Kölcsönhatás: CSAK AZ ÁLLÓFÁZISSAL üvegfelelület dezaktiválása Aktivitás: szilanol csoportok tailing nem szimmetrikus jelalak dezaktiválás: szililezı reagens üvegfelület Si-O-Si(CH 3 ) 3 Si-O-Si(CH 3 ) 3 SiOH Si-O-Si(CH 3 ) 3

Gáz-szilárd kromatográfia Gázkromatográfiás adszorbensek Porózus, nagy fajlagos felület: 200-1200 m 2 /g Típus: 1. Szerves eredető 2. Szervetlen eredető 3. Módosított adszorbensek 1. Szerves eredető -Aktív szén: csont, vér, kókuszdió -Gyöngypolimer: sztirol-divinilbenzol Porapak: Q, P, R, S, T, N, PS, GS Chromosorb: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 Aromás győrő jól polarizálható Poláris anyagok elválasztása: alkoholok, merkaptánok

-XAD gyanták Tenax: poli-(2,6-difenil-4-fenilénoxid): jó hıálló, kicsi fajlagos felület (10-20m 2 /g) -Teflon Aminok, S-tartalmúak analízise 2. Szervetlen adszorbensek -szilikagél: -Si-OH fajlagos felület, 100-200 m 2 /g -Al 2 O 3 allotróp módosulatok; PLOT kolonnák -Molekulasziták (zeolitok) 5A: 0.5 nm pórusátmérı 13X: 0.9-1.0 nm pórusátmérı fajlagos felület, 800-1200 m 2 /g Analizálható: Ar, O 2, N 2, CH 4, CO, CO 2, H 2 O, C 3 H 8, stb 3. Módosított adszorbensek Grafitizált aktív szén, szilikagél; Szénsziták: Carbosieve

Gáz-folyadék kromatográfia Hordozók Kívánalmak: a hordozó szemcsék egységes mérete a szemcsék geometriája a hordozó termikus és mechanikai stabilitása kémiai inertség Típusai: diatómaföld alapúak: Chromosorb W, Chromosorb P» Supelcoport Savas, lúgos kezelés, szililezés Chromosorb W fehér Chromosorb DMCS dimetil-klórszilánnal kezelt Chromosrb N nem kezelt Chromosorb AW savval mosott Chromosorb NAW savval nem mosott üveg alapúak: Chromosorb G aktívszén alapúak: Carbopack

Megosztófolyadékok Kívánalmak: hıstabilitás folyékony hallmazállapot jól definiált kémiai szerkezet kémiai inertség kellı nedvesítı képesség oldhatóság mérsékelt ár

Megosztófolyadék Típusai: szénhidrogén típusú megosztófolyadékok ftálsavak glikol-észterek poliglikolok (poliéterek) polietilén-glikol származékok nitrilek szilikon fázisok

Állófázisok (GLC) megosztó folyadékok Különféle polimerek: egyenletes bevonat a kapilláris belsı felületén (WCOT) viszonylag kevés állófázis: 12-15 Szubsztituált polisziloxánok (szilikonok): kedvezı tulajdonság: hosszú élettartam R R S i O S i O R R Fontosabb szubsztituensek: Metil Fenil Cianopropil Trifluoropropil n R: polisziloxánvázhoz kapcsolható szubsztituensek Feltétel: termikus stabilitást ne befolyásolja Metil: -CH 3 (abszorpció: gázok/folyadékok folyadékban történı oldódása) Fenil: Cianopropil: -CH 2 CH 2 CH 2 CN Trifluoropropil: -CH 2 CH 2 CF 3

O CH 3 Si CH 3 O O Si CH 3 Si CH 3 O Si CH 3 CH 3 metil-fenil cianopropil-fenil stb. helyettesítés: Si atomok hány %-a 100 % metil 5 % fenil & 95 % metil

Poli-dimetil-sziloxánok SE 30, OV1, OV101 Max. hımérséklet: 325 C HP-1, SBP-1, Ultra-1, CPSil-5CB Poli-fenil-metil-sziloxánok SE52, SE554, OV73, HP-5, Ultra-2, CPSil8CB 5% 95%

Poli-fenil-propilnitril-metil sziloxánok Nagyon poláris 7% 25% a b c 7% 25% 86% 50% OV-1701, CP-Sil 19B OV-225, HP-225, SP-2300 Legpolárisabb: dicianoallyl-sziloxán

Polietilénglikolok (PEG) speciális szeparációs karakterisztika HO CH 2 O CH 2 O H n Carbowax Hátrány: kisebb hıstabilitás oxigén-érzékenység

Állófázisok jellemzése Állófázis polaritása: állófázis szerkezete funkciós csoportok minısége az egyes funkciós csoportok száma Apoláris állófázisok: 100 % metil 95% metil + 5 % fenil Közepes polaritás: 35 % fenil 50 % fenil Poláris állófázis: PEG Szelektivitás: kölcsönhatás létrejötte az állófázis és a mintát alkotó komponensek között Kölcsönhatás: adott komponens minısége állófázis szerkezete

Kölcsönhatások 1. diszperziós 2. dipólusos 3. H-híd Diszperziós kölcsönhatás: apoláris-apoláris kh. (átmenetileg keletkezı dipólusok); mindegyik állófázisra jellemzı Molekula polarizálhatósága: méret függés Forráspont helyett inkább gıznyomás Kisebb gıznyomással bíró komponensek: erısebb visszatartás (sok esetben nem fellelhetı) Oldhatóság: nagyobb oldhatóság: hatékonyabb visszatartás (nehéz becsülni) ÁLLÓFÁZIS metil fenil cianopropil trifluoropropil PEG KÖLCSÖNHATÁS erıs nagyon erıs erıs erıs erıs

Dipólusos kölcsönhatás mind az állófázis mind a molekula rendelkezzen dipólus momentum PEG & cianopropil szubsztituált állófázisok Dipólus momentummal rendelkezı molekulák: egyenetlen töltéseloszlás O, N, S, P, Cl, F, Br, I tartalmú molekulák: általában rendelkeznek dipólus momentummal -OH,-NH csoportok: nagy dipólus momentum Szimmetrikus a molekula: kicsiny dipólus momentum Elválasztás: eltérı dipólus momentumok (a dipólus momentumok különbsége számít) Kicsi a dipólus momentum különbség az elválasztandó komponensek között: nagy dipólus momentumú állófázis alkalmazása szükséges

Dipólusos kölcsönhatás ÁLLÓFÁZIS metil fenil cianopropil trifluoropropil PEG KÖLCSÖNHATÁS nincs nincs nagyon erıs közepes erıs Hidrogén-híd kölcsönhatás az állófázis és a molekula között kialakuló H-híd OH, NH csoport jelenléte (a H-híd erısségének különbsége számít) Kicsi a H-híd erısségek különbség az elválasztandó komponensek között: erıs H-híd kialakítására képes állófázis alkalmazása szükséges

Hidrogén-híd kölcsönhatás ÁLLÓFÁZIS metil fenil cianopropil trifluoropropil PEG KÖLCSÖNHATÁS nincs gyenge közepes gyenge közepes Az állófázis kiválasztása: 1. tudomány 2. tapasztalat 3. (tipp) publikációk applikációs adatbázisok (internet) hasonló a hasonlóval választható el: apoláris molekula apoláris állófázis poláris molekula poláris állófázis

Elvárások: Szelektivitás: az elválasztó rendszer azon tulajdonsága, hogy különbséget tud tenni: az állófázis és a mintaalkotói között kialakuló kölcsönhatások révén jön létre Hatékonyság: minél rövidebb idı alatt minél több komponenst lehessen meghatározni kicsiny szélességő elúciós csúcsok

Megosztófolyadékok polaritása Polaritás: (+) és (-) töltéscentrum nem esik egybe Rohrschneider: 1965 Az egyes molekulák retenciója (retenciós indexe: I) additiven tevıdik össze a molekulát alkotó elemek inkrementumai -ból 5 modelvegyületett választott: Benzol: aromások és olefinek jellemzése Etanol: elektronpár-akceptor viselkedés Metil-etil-keton: elektronpár-donor viselkedés Nitropropán: nitrovegyületek jellemzése Piridin: aminok jellemzése (x) (y) (z) (u) (s) Az adott állófázison és szkvalánon mért I különbség jellemzi az adott kölcsönhatást: pl: benzolra I = I fázis benzol I sq benzol

E modellek adott állófázison és szkvalánon mért I-je (illetve ennek 1/100 része) az adott fázisra jellemzı x, y, z, u, s tulajdonságokat, míg 5 különbözı állófázison az a, b, c, d, e tulajdonságok az alkotóra jellemzı paramétereket jelentik: I F1 I sq = ax 1 +by 1 + cz 1 + du 1 + es 1 I F2 I sq = ax 2 +by 2 + cz 2 + du 2 + es 2.. I F5 I sq = ax 5 +by 5 + cz 5 + du 5 + es 5

McReynolds: Etanol helyett 1-butanolt, metil-etil keton helyett metil-n-propil ketont javasolt Az adott állófázison és szkvalánon mért indexkülönbség jellemzi az adott kölcsönhatást, pl. benzolra: I = I fázis benzol I sq benzol Mind az 5 modellvegyületre mért és számolt I indexkülönbségek együttesen alkalmasak az állófázisok polaritásának jellemzésére

Az 5 modell vegyületre együttesen mért és számolt I különbségek alkalmasak a polaritás jellemzésére Megosztó Benzol 1-butanol 2-pentanon 1-nitropropán Piridin Σ I CP-index folyadék (x) (y) (z) (u) (s) szkvalán 0 0 0 0 0 0 0 Carbovax 1500 371 639 453 666 641 2770 63 Carbovax 400 317 545 378 578 521 2339 55 SE-30 15 53 44 64 41 217 5 OV-1 16 55 44 65 42 222 5 OV-210 146 238 358 468 310 152 36 OV-215 149 240 363 478 315 1545 37 OV-225 228 369 338 492 886 1813 43 OV-275 629 872 763 1106 849 4219 100

Utolsó elıtti oszlop:az 5 indexkülönbség összege: Ha elfogadjuk, hogy: A squalan polaritása: 0 az OV-275: 100 definiálható egy polaritás skála 0-100 között A kromatográfiás polaritás: CP 5 i= 1 I CP = 5 i= 1 5 i= 1 ( I) ( I) F i OV 275 i

Megosztófolyadékok polaritásának megítélése: Különbözı márkanevek: OV 101 CP: 229 SP 2100 CP:229 Alkoholban kevés keton illetve ketonban kevés alkohol elválasztása: akkor jó ha a kisebb csúcs elıl van. Olyan állófázist kell választani, ahol I ketonra kisebb (kevésbé visszatartott; 1. eset) mint alkoholra illetve fordítva (2. eset). Alkoholban kevés keton Alkoholra nagyobb I Ketonban kevés alkohol Ketonra nagyobb I Carbowax 1500 y=639 OV-210 y=238 z=453 z=358 Carbowax 400 y=551 OV-215 y=240 z=375 z=336

Minıségi analízis

Minıségi analízis - Összehasonlítás elızıleg mért, ismert anyagok retenciós idejével - Relatív retenció alkalmazása - Addíció - Retenciós indexek - Tömegspektrométer

KOVÁTS-féle retenciós index Alapja: Szénhidrogén származékok homológ sorában a retenciós idık a C-atom számmal exponenciálisan növekednek Lg t R ábrázolva C-atom szám függvényében egyenest ad N alkán homológok retenciójához viszonyít

KOVÁTS-féle retenciós index I = 200* lgt lgt n+ 2 lgt X n x + R' R' lgt R' R' n 100n I x -ismeretlen komponens retenciós indexe t R n+2 > t R x (ismeretlen) > t R n n-páros szénatomszámú parafin szénatomszáma Jelentıssége: Ismeretlen komponens azonosítása

Mennyiségi analízis A detektor érzékeli az oszlopból kilépı gázáram valamilyen fizikai v. kémiai tulajdonságának megváltozását jelfeldolgozás Az elektromos jel Függhet: koncentrációtól (konc. érzékeny) idıegység alatt a detektorba jutó minta mennyiségtıl (tömegáram érzékeny) A jel és a konc. ill. a tömegsebesség közötti függvénykapcsolat keressük a mennyiségi elemzés során

Mennyiségi analízis - Csúcsterülethez (A) keressük az anyagmennyiséget (m) - Csúcsterület meghatározás integrálással (ma elektronikus integrátorokkal)

Mennyiségi értékelés Módszerek: Kalibrációs görbék felvétele Belsı standardok Addíciós módszer

Kalibrációs módszer A 3 A ism A 2 A 1 m 1 m 2 m ism m 3 Ismert koncentrációjú mintasorozat mérésével kalibrálva, azaz kalibrációs görbe felvétele után az ismertelen koncentrációja(tömege) a görbérıl visszaolvasva meghatározható

Addíciós módszer

Belsı standard módszer Relatív érzékenység f=ai/as*ms/mi a vizsgálandó mintához olyan anyagot (belsı standardot) adunk, amelyet a minta nem tartalmaz, de jól elváló jelet ad, és ehhez viszonyítjuk a mintakomponensek által szolgáltatott jeleket. Elızetesen meg kell határozni a minta-komponensek belsı standardra vonatkozó relatív érzékenységét.

Ipari oldószerek GC analízise Speciális feladatra tervezett állófázisokat is árulnak

A folyadékktomatográf (HPLC)

A folyadékkromatográfiás rendszerek felépítése I.

A folyadékkromatográfiás rendszerek felépítése II.

A folyadékkromatográf felépítése

Eluens tárolók Üvegedény (vizes rendszereknél: ionok oldódnak ki) Mőanyag edény (szerves eluensek lágyítókat, adalékokat oldanak ki) Eluensek gázmentesítése Forralás (differenciális párolgás) Vákuum alkalmazása (differenciális párolgás) Ultrahang alkalmazása He alkalmazása (leghatásosabb)

Szivattyúk Szivattyúkkal szemben támasztott követelmények: 1. Nagy nyomáson szállítson akár kis, akár nagy térfogati áramlási sebességgel 2. Pulzálás csökkentés akár mechanikusan akár elektronikusan 3. Cserélhetı nagynyomású szivattyúfej (analitikai-preparativ; acél-titán-teflon: biológiai minták) 4. Automatikus kompresszibilitás kompenzáció 5. Kompatibilis kis forráspontú oldószerekkel 6. Kompatibilis pufferolt eluensekkel 7. Kompatibilis ionpár-képzı anyagokkal 8. Gyors eluens csere biztosított legyen 9. Kis hold-up térfogat 10.Számítógépes vezérlés (mozgófázis összetétel, gradiens vezérlés, áramlási sebesség, stb)

Állandó nyomáson szállító szivattyúk 1. Pneumatikus szivattyú Elıny: - olcsó - egyszerő - pulzálás mentes Hátrány: - térfogat és végnyomás korlátozott - térfogati sebesség a viszkozitás és permeabilitás függvénye

2. Pneumatikus erısítéső szivattyú (Haskel type) Elıny: - olcsó - oldószercsere egyszerő - nagy térfogati sebesség érhetı el - szállítási nyomás gyorsan beáll Hátrány: - térfogati sebesség a viszkozitás és permeabilitás függvénye

Állandó áramlási sebességgel szállító szivattyúk 1. Fecskendı típusú szivattyú (Syringe-type) Elıny: - pulzálás mentes - térfogati sebesség független a viszkozitástól és a permeabilitástól - térfogati sebesség könnyen szabályozható - szállítási nyomás gyorsan beáll Hátrány: -drága - kapacitás korlátozott - oldószercsere bonyolult

2. Alternáló dugattyús szivattyú (Reciprocating piston pump)

Alternáló dugattyús szivattyúk szállítóteljesítmény görbéi

Alternáló dugattyús szivattyúk Elıny: - térfogati sebesség független a viszkozitástól és a permeabilitástól - térfogati sebesség könnyen szabályozható - a belsı szivattyú térfogata kicsi Hátrány: - pulzáló folyadékszállítás - a szállított folyadékmennyiségi tartomány korlátozott - a szállítási nyomást lassan éri el

A kompresszibilitás hatása a szállítóteljesítményre Szívóütem után: - folyadék térfogata: V = m / ρ (ρ = g/cm 3 ) - nyomás növelésével ρ változik - Darcy: u = Ko η Δ PLε - a térfogatcsökkenés a folyadékkromatográfiás körülmények függvénye - A kolonna bemenetnél a térfogati áramlási sebesség csökken - kompresszibilitás kompenzáció: -mechanikus -elektronikus

3. Membrán szivattyú (membrane piston pump) Elıny: az eluens nem érintkezik a tömítésekkel Pulzálás csökkentés: - több szivattyúfej alkalmazása - 500 1/min frekvencia alkalmazás -400 bar nyomás az acélmembránon

4. Egydugattyús gyors feltöltéső szivattyú szállítás Feltöltés 200 ms ko m pr es sz ibi lit ás szállítás

5. Sorba kötött két dugattyúfejes szivattyú Csak a szívófejen van szívó és nyomószelep Pulzálás mentesítés: elektronikusan: egyik ágban állandó nyomás másik ágban állandó áramlási sebesség

A nagynyomású szivattyúk mőködését befolyásoló tényezık 1. Szilárd részecskék hatása 2. Oldott gázok hatása 3. Korróziós hatás

1. Szilárd részecskék hatása a. eltömi az eluens szőrıt és a szelepek védı szőrıit b. rárakódik a szelepülésekre c. eltömi a nyomásmérı egységet d. eltömi a kapillárisokat e. Eltömi a mintaadagolót Következmény: - szállítóteljesítmény változása - pulzálás - nyomásnövekedés Kiküszöbölés: -eluens szőrése 0,4 0,5 µm pórusú szőrın -oldószer gyárilag szőrve: 0,2 0,4 µm pórusú szőrın

Szilárd részecskék eredete: a. Eluensbıl válik ki - kristálykiválás pufferekbıl eluensek elıre elkészítése izokratikus módban - algák, baktériumok elszaporodása: nagy víztartalmú eluensekben b. Szivattyú tömítések morzsolódása - dugattyúk mőködés közbeni mosása

2. Oldott gázok hatása 1. Oxigén oldódása vízben és szerves oldószerekben 2. Pulzálás: a szívóütem után addig nincs folyadékszállítás amíg a gázbuborék nyomása el nem éri a kolonna belépı nyomását 3. Oxigénbuborékok keletkezése víz-metanol (exoterm), víz-acetonitril (endoterm) oldószer párok keverésekor. 4. Levegımentesítés (lásd: eluenstárolók)

3. Korróziós hatás HPLC technika: rozsdamentes acél (SS 316) használata Haloid ion (Cl -, Br - ) korrózió Korróziós folyamatok víz-metanol, víz-acetonitril eluens rendszerekben: 0,1 ppm feletti Oxigén koncentráció jelenlétében az O 2 redukálódik: O 2 + 2 H 2 O + 4e - 4 OH - A vas anódos oxidációval oldódik: Fe Fe 2+ + e - Katódos és anódos reakciótermék reagál: Fe 2+ + 2 OH - Fe(OH) 2 Oxigén jelenlétében: 4 Fe(OH) 2 + O 2 + H 2 O 4 Fe(OH) 3 2 Fe 2 O 3 + 6 H 2 O Megjelennek a vasoxid különbözı formái: zöld, vörös, barna Passziválás: foszfát puffer, idınként salétromsav használata

Adagolók 1. Kézi adagolók

2. Automata adagolók

Oszlopok Anyaga: -acél -PEEK (poliéter-éter keton) -üveg Mérete: Oszlophossz (cm) 20-50 10-20 10-15 5-10 2-5 Oszlop belsı átmérı 5-10 4-6 4-6 2-4 2-4 (mm) Töltet szemcse átmérı 20-40 10-20 5-10 3-5 <2 (µm)

Oszlop csatlakozók

Oszlop- és összekötı csatlakozók

Folyadékkromatográfiás detektorok

Folyadékkromatográfiás detektorok felosztása és alkalmazásuk gyakorisága UV-Vis (80%) Fluoreszcens (5%) Elektrokémiai (5%) Törésmutató mérı (RI) (2-3%) Vezetıképességi (2-3%) Fényszórásos (ELSD) (2-3%)

Folyadékkromatográfiás detektorok összehasonlításához használt paraméterek Detektor zaj Dinamikus tartomány Lineáris tartomány Detektálás alsó határa Cella térfogat és kialakítása Idıállandó Nyomásváltozás hatása a jel/zaj viszonyra Áramlási sebesség hatása a jel/zaj viszonyra Hımérséklet hatása a jel/zaj viszonyra

Rövid távú zaj Statikus: 0.5-1.5x10-4 AU / perc Dinamikus: 0.5-1.0x10-4 AU / perc

Hosszú távú zaj Statikus: 1.0-4.0x10-4 Dinamikus: 1.0-5.0x10-4 AU / 10 perc AU / 10 perc Alapvonal mászás (drift) Statikus: 5.0-10.0x10-4 AU / óra Dinamikus: 2.0-6.0x10-4 AU / óra

A jel és zaj viszonyának (s/n) szemléltetése

Folyadékkromatográfiás detektorok jelleggörbéje Dinamikus tartomány: a jel arányos az anyag mennyiséggel Lineáris tartomány: a jel lineárisan arányos az anyagmennyiséggel (5%) Detektálás alsó határa (DAH, LOD): a jel 3x nagyobb, mint a zajszint Mennyiségi mérés alsó határa (LOQ): a jel 10x nagyobb mint a zajszint

Dinamikus tartomány: a jel arányos az anyag mennyiséggel Magában foglalja a lineáris tartományt Lineáris tartomány: a jel lineárisan arányos az anyagmennyiséggel (5% eltérésig) s = a c ahol: s detektorjel Fowlis és Scott: a c detektor érzékenysége a minta koncentrációja s = a c r ahol: r válasz index (0.98 < r < 1.02) r függ a készülék felépítésétıl Lineáris tartomány: a legnagyobb koncentráció és a DAH közti szakasz

A detektor érzékenysége a = s / c illetve a = ds / dc A detektor érzékenysége: az analitikai egyenes meredeksége illetve nem lineáris tartományban a jel koncentráció szerinti deriváltja Az érzékenység alapján nem lehetséges a detektorok összehasonlítása: Uv-Vis: AU / (mol dm -3 ) Elektrokémiai: na / (moldm -3 ) Gyakorlatban: Kimenı jel: mv/ koncentráció vagy Detektálás alsó határa (DAH, LOD)

A detektor érzékenység és a detektálás alsó határa Detektorra vonatkozó DAH: az adott anyagra jellemzı koncentráció mely a detektor cellában áthaladva a zaj kétszeresének megfelelı jelet ad Kromatográfiás rendszerre vonatkozó DAH: az adott anyagra jellemzı koncentráció mely a kromatográfiás rendszerben (adagoló, kolonna, detektor cella) áthaladva a zaj kétszeresének megfelelı jelet ad A kromatográfiás rendszer detektor érzékenysége (X D ) és a legkisebb kimutatható anyagmennyiség (m) függ: - Kolonnára jellemzı adatok a) geometriai méret (r, L) b) töltet jellemzık (ε, N, d p ) - Visszatartásra jellemzı adatok (k, N, mozgófázis összetétel) - Detektorra jellemzı adatok

Ha a kolonnára és a a visszatartásra jellemzı adatokat állandóan tartjuk a kromatográfiás rendszer detektorérzékenysége (X D ) X D = m / k ahol: X D detektor érzékenysége m minta tömege k retenciós faktor A detektorok érzékenységére ellentmondó adatok találhatók, ezért a javasolt terminológiák: Detektorra vonatkozó érzékenység (csak a detektorban mérve) A kromatográfiás rendszer tömeg-érzékenysége, m, a legkisebb detektálható anyagmennyiség tömegegységben (s/n = 2 mellett) A kromatográfiás rendszer koncentráció érzékenysége (X C ): legkisebb koncentráció, mely a zaj kétszeresét adja X C = 2n / a ahol: n zaj a s / c

A kromatográfiás rendszer detektor érzékenysége (X D ) és koncentráció érzékenysége (X C ) közti összefüggés: Scott: X C = 1.8 X D Minden olyan hatás, mely a zajt növeli, csökkenti a detektor érzékenységet és növeli a detektálás alsó határát. Ezért vizsgálni és optimalizálni kell: Detektor cella kialakítását Hımérséklet változás hatását Áramlási sebesség hatását Nyomás-ingadozás hatását Detektor kimeneten az elektronikus szőrı idıállandójának hatását (kromatográfiás csúcs torzulás)

Uv-látható (Uv-vis) detektorok Egyutas detektor Kétutas detektor

A detektorok fényforrása Deutérium lámpa Xenon lámpa alap 500 óra Alkalmazható hullámhossz tartomány: 190 800 nm 210-550nm

Állandó hullámhosszon mőködı lámpák Hg gız lámpa 253 nm (szőrı) Zn lámpa 213, 307 nm (szőrı) Cd lámpa 228.8 nm (szőrı)

Szerves oldószerek fényelnyelése

Az oldószer fényáteresztı képessége (Uv cut-off): Az a legkisebb hullámhossz, ahol a transzmittancia 10%-ra csökken Oldószer Acetonitril Metanol 2-propanol Dioxán tetrahidrofurán Uv cut-off (nm) 190 205 205 215 230

Fordított fázisú kromatográfiában használt oldószerek tisztaság vizsgálata gradiens elúcióval Elméleti görbe Gyakorlati görbe 100% 0 %

A detektor optikai felépítésének jellemzésére szolgáló paraméterek: 1. Hullámhossz beállítás torzítatlansága (accuracy) 2. Hullámhossz beállítás reprodukálhatósága (reproducibility) 3. Sávszélesség (bandwith) 1. és 2. Legtöbb készülék automatikusan végzi a hullámhossz kalibrációt 2. Sávszélesség hatással van az érzékenységre és a linearitásra -nagyobb sávszélességnél nagyobb lesz a fotodiódára jutó energia, jel/zaj viszony javul, kimutatási határ csökken. -De: nagy energia és sávszélesség hatására az intenzításkülönbség csökken és ezzel az abszorbancia (A) kisebb lesz

A fotodiódára jutó fényenergia és a fényelnyelés függése a sávszélességtıl I 01 A1 = lg I 01 I 01 I I 02 A2 = lg I 02 I 02 I ahol: I 0 a megvilágító sugárzás intenzitása, I a komponens fényelnyelése, és ha I 01 < I 02 akkor: A 1 > A 2

A kalibrációs egyenes meredeksége függ a sávszélességtıl λ λ+2x λ λ+2y y >> x A sávszélesség növekedtével, az abszorbancia csökkenés miatt, csökken a kalibrációs egyenes meredeksége

Minden olyan hatás, mely a zajt növeli, csökkenti a detektor érzékenységet és növeli a detektálás alsó határát. Ezért vizsgálni és optimalizálni kell: - Detektor cella kialakítását - Detektor kimeneten az elektronikus szőrı idıállandójának hatását (kromatográfiás csúcs torzulás) - Hımérséklet változás hatását - Áramlási sebesség hatását - Nyomás-ingadozás hatását

A detektor cella térfogatának és geometriájának hatása Hagyományos cellák: - hengeres furat - úthossz: 4-10 mm - térfogat: 4-8 µl Úthossz csökkentésével az RI hatás csökkenthetı (Lambert-Beer törvény)

Taper beam cella -RI hatás csökkentése -Jel/zaj viszony növelés: optikai úthossz növelés (határt szab a cellatérfogat növekedés, kolonnán kívüli zónaszélesedés)

A detektor idıállandójának hatása a jelre Az idıállandó (τ) (a jel mennyi idı alatt követi a detektorban bekövetkezı változást): τ növelése - csökkenti a jel/zaj viszonyt, de -torzítja a kromatográfiás csúcsot -változtatja a maximum helyét (minıségi analízis) -Általános szabály: az idıállandó nem lehet nagyobb, mint a hot idıhöz tartozó σ t zónaszélesedés tized része Nagyhatékonyságú, pl. 3 cm kolonnánál, ha a holtidınél mért zónaszélesedés σ t = 150 ms, a detektor idıállandója 15 ms kell legyen.

Hımérséklet változás hatása a jel/zaj viszonyra Modern detektoroknál, ahol a zajszint 10-5 AU, a hımérséklet változás törésmutató változást okoz az eluensben (RI hatás; ld. detektor) Általában: 1 C hımérséklet változás 10-4 AU változást okoz. Áramlási sebesség és a nyomás-ingadozás hatása a jel/zaj viszonyra Általában igaz, hogy a fényelnyelés független az áramlási paraméterektıl. Szők csıben az áramlási sebesség és nyomásesés változás nyíróerı változást okoz az eluensben az egyes rétegek között. Ez hımérsékletváltozást okoz, ami együtt jár a törésmutató megváltozásával.

Többcsatornás Uv-vis és diódasoros detektorok Többcsatornás detektorok: Különbözı hullámhosszakon egy idıben több kromatogramot képesek rögzíteni Maximum 8 hullámhosszon mőködnek (8 fotodióda) Az adatfeldolgozó szoftver kisebb kapacitású mint a diódasoros módban mőködı szoftveré Diódasoros detektor: helyesebben diódasoros detektálási mód (DAD, diode array detection) Többcsatornás detektorok, idı-, intenzítás- és hullámhossz adat együttest győjtenek, és az adatokat számítógépen tárolják (utólagos értékelés)

Többcsatornás Uv-vis és diódasoros detektorok 8-10 kb 100-200 kb

Diódasoros detektor felépítése Mintát fehér fénnyel világítjuk meg, fényfelbontás a küvetta után történik. 190-800 nm között általában 128-1024 fotodióda. Felbontás 1-5 nm. Diódák jele kombinálható, ekkor a felbontás csökken. A diódasor néhány msonként letapogatja a spektrumot.

Diódasoros detektor DAD (Dioda Array Detector) polikromátor fényforrás lencse cella (küvetta) diódasor Elıny: különbözı hullámhosszúságon mért elnyelések egyidejő mérése spektrum felvétele: minıségi információ

Gyors pásztázó és diódasoros detektorok összehasonlítása gyors pásztázó: egyetlen dióda, a rács mozog diódasoros: 128-1024 dióda, a rács helyzete állandó

A diódasoros (gyorspásztázó) detektor adatszolgáltatásai A: háromdimenziós kép; B: spektrum; C: kromatogram; D: izoabszorpciós vonalak

Diódasoros detektor nyújtotta szolgáltatások A t, λ, A mintavételezés sőrősége, mérés utáni korlátlan felhasználás lehetısége Változtatható paraméterek: Mérési idı: akár több óra is lehet Hullámhossz tartomány: (190-800 nm között) változtatható Mintavételezési idı: fotodiódák kiolvasási ciklusideje (néhány ms, ha túl nagy torzítja a kromatogramot) Optikai sávszélesség: alapvetıen befolyásolja a spektrumot Integráló program: a mennyiségi kiértékeléshez Spektrum feldolgozási lehetıségek: csúcstisztaság ellenırzés

Csúcstisztaság ellenırzés 1( 1) 2( ) A λ 2 1 1 ( ) ( ) ε 2 λ 1 2 c l 1( 1) 2( ) ε λ 2 t a n s k o n s Fontos: Mekkora a legkisebb minta koncentráció, ahol a spektrum még értékelhetı Jel/zaj viszony megfelelı Matematikai eljárás (szoftver) alapján egyértelmő legyen a csúcs tisztaság

Fluoreszcenciás detektálási mód Fluoreszcencia: besugárzás és az emisszió közti idı: 10-5 - 10-8 s Gerjesztı fény: fehér rács (prizma) λ 1 Emittált fény: rács (prizma) λ 2 λ 1 fekete test λ 2 Foszforeszcencia: az emisszió késleltetett (intersystem crossing)

Merck fluoreszcens detektor