Mez Gábor. Peptidkémia

Mez Gábor Peptidkémia

Tartalom TÖTÉNETI IDALMI ÁTTEKINTÉS... 3 TÁGYALT TÉMAKÖÖK... 6 AMINSAVAK ELFDULÁSA ÉS SZINTÉZISE... 7 AZ AMINSAVAK ÖVID BEMUTATÁSA... 8 VÉDSPTK... 19 NEM UETÁN TÍPUSÚ NH VÉDSPTK... 21 AILSZULFENIL VÉDSPTK:... 27 UETÁN TÍPUSÚ VÉDSPTK... 28 PÉLDÁK... 34 KABXIL VÉDSPTK... 37 LDALLÁN VÉDSPTK... 41 PEPTIDKÖTÉS KIALAKÍTÁSA... 48 KAPSLÁSI ELJÁÁSK... 50 2

TÖTÉNETI IDALMI ÁTTEKINTÉS 1. E. Fischer: Berichte 39, 530 (1906) Peptidek, polipeptidek fogalma, elmélete, szintézise 2. J.S. Fruton: Advances in Protein hemistry Vol.5. (Academic Press, New York 1949) Felöleli az addigi peptidkémiát. 3. J.P. Greenstein, M. Winitz: hemistry of Amino Acids (J. Wiley, New York, 1961) Lexikális gyüjtemény aminosav- és kismolekulatömeg peptidszármazékokról. 4. E. Schröder, K. Lübke: The Peptides I-II. (Academic Press, New York 1965-1966) Peptidkémikusok bibliája. 5. M. Bodánszky, M.A. ndetti: Peptide Synthesis (J. Wiley and Sons, New York, 1966) 6. Medzihradszky Kálmán: A természetes peptidek szintézise. A kémia újabb eredményei 3 (1970) 7. Bajusz Sándor: Peptidszintézis. A kémia újabb eredményei 47 (1980) 8.. B. Merrifield: J. Am. hem. Soc. 85, 2149 (1963) Szilárdfázisú peptidszintézis elve 9. J.M. Stewart, J.D. Young: Solid phase peptide synthesis (Freeman and o., San Francisco, 1969), (Pierce hemical ompany, ockford, Illinois, 1984) Boc-technika 10. E. Atherton,.. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: a practical approach (IL Press, xford, England, 1989) Fmoc-technika 11. G.A. Grant: Synthetic peptides, a user s guide (Freeman and o., New York, 1992) 3

AMINSAVAK H 2 N H H Monoamino-monokarbonsavak: Gly (G): H Trp (W): H 2 NH Ala (A): H 3 Ser (S): H 2 H Val (V): H H 3 H 3 Thr (T): * H H 3 H Leu (L): H 2 H H 3 H 3 Tyr (Y): H 2 H Ile (I): * H H 3 H 2 H 3 ys (): H 2 SH Nle : H 2 H 2 H 2 H 3 Hcy : H 2 H 2 SH Phe (F): H 2 Met (M): H 2 H 2 S H 3 Pro (P): H 2 H 2 H 2 H NH nem csak H Hyp : H H H 2 H 2 H NH nem csak H Monoamino-dikarbonsavak (savas): Asp (D): H 2 H (pk: 2,98) Asn (N): H 2 NH 2 (pk: 5,41) Glu (E): H 2 H 2 H (pk: 3,22) Gln (Q): H 2 H 2 NH 2 (pk: 5,65) 4

Diamino-monokarbonsavak: Lys (K): Arg (): H 2 H 2 H 2 H 2 NH 2 rn : H 2 H 2 H 2 NH 2 (pk: 9,74) (pk: 9,70) H 2 H 2 H 2 NH NH 2 His (H): H 2 H NH NH N H (pk: 10,76) (pk: 7,58) 5

TÁGYALT TÉMAKÖÖK amino védôcsoportok oldallánc védôcsoportok 1 2 Z NH H + H 2 N H X Y karboxilcsoport aktiválás kapcsolási eljárások - HX karboxil védôcsoportok (szilárdfázisú szintézisnél gyanta tölti be ezt a szerepet) 1 2 Z NH H NH H Y védôcsoportok hasítása ldatfázisú és szilárdfázisú peptidszintetikus eljárások 6

AMINSAVAK ELFDULÁSA ÉS SZINTÉZISE Bruckner Gyz: Szerves kémia I/2 Pl. H + NH 4 N -H 2 H NH 2 N H 2, H + hidrolízis H NH 2 H H + NH 3 NH H + H 2 H 2/kat. H NH 2 H α-ketokarbonsav α-iminosav α-aminosav (=H 3, piroszlsav) (alanin) acém termék rezolválás - N-acetil származék enzimes hidrolízise: L-konfigurációjú hasad, D nem - N-védett származék brucin sójának szétkristályosítása 7

AZ AMINSAVAK ÖVID BEMUTATÁSA Glicin (G): nincs aszimmetria centrum nincs oldallánc mellékreakciók nagy flexibilitás 1. H HN NHH 2 Bzl ' könny reakcióba vinni konformációs változatosság H - H HN N H 2 nincs racemizáció H H 2 NH H 2 NH H 2 H H Z-Aaa-Gly- hidantoin származék karbamid származék Megoldás: Gly-NH 2 kiindulás, hidrolízis nem dipeptid fázisban (Z-Aaa-Gly-Gly- )! 2. Szukcinimid gyûrûzárás: Asp()-Gly, Asn-Gly H 2 NH H H NH H 2 ~30% H 2 1 N H 2 NH H 2 1 2 ~70% H 2 H H 2 NH H 2 H NH H NH H 2 NH H α-aszpartil-glicin β-aszpartil-glicin 8

3. Diacetilezôdés: α- atomon nincs térgátlás - önacilezés (Z-Gly) 2 Z NH Z H 2 N H 2 H 4. Diketopiperazin képzôdés: Gly-Pro, Gly-Gly 2 N H 2 NH H 2 H 2 N H 2 NH H 2 H 2 N 5. eakció D-vel: H 2 N H 2 Et + N N NH N N NH HN H 2 Et N H 2 1-ciklohexil-2-ciklohexil-amino- 4,5-dihidroimidazolin-5-on 6. Gly-NA (Leuchs-anhidrid) H 2 HN B - -BH H 2 - N izocianát-származék NH- H 2 H HN NH hidantoinsav-származék Alanin (A): aszimmetria centrum racemizáció (kis mérték) 9

gyors reakció, nincs nagy térgátlás sok Ala apoláros karakter oldékonyság csökkenés α Valin (V): -atomon izopropilcsoport térgátlás lassú reakciók mellékreakciók fokozódása Z-Val-H > Boc-Val-H, H-Val- t Bu > H-Val-Et karboxilcsoport reaktivitását jobban gátolja, mint az aminocsoportét aminosav analízis 48 óra 1. Azidos kapcsolás: 1 -N 2 1 N H 2N- 2 1 NH NH 2 N 3 azid izocianát-származék karbamid-származék 2. N acilvándorlás (migráció) NH H NH N HN Gyenge nukleofilek (pl. o,p-nitrofenol) esetén! Piridin oldószer növeli a nukleofilitást. 3. Savkloridos kapcsolás: X-Val-l + NH 2 - + H - X-Val-H + NH 2 - + l - 10

4. Észter hidrolízis, hidrazinolízis: X-Val-Me + NH 2 -NH 2 (NaH) lassú racemizáció 5. Acilezés Tyr jelenlétében: Tyr H-csoportja is acilezdhet 6. Vegyes anhidrides kapcsolás: H 3 H 3 H 3 H 3 H Z H 2 H H H 2 + H 2 N- H 3 H 3 H Z H 2 H NH H 3 H 3 H H 2 NH Z-Val-H + klórszénsav izobutil észter vegyes anhidridje 5-8% fordítottan acilezett származék normális esetben <1% Izoleucin (I): a valinra leírtak fokozottan igazak még egy aszimmetria centrum alloizoleucin Leucin (L): az alaninhoz hasonló, de nagyobb oldallánc (térgátlás) lassabb reakciók Norleucin (Nle): nor egyenes lánc, metionin helyettesítése peptidekben H 2 H 2 S H 3 H 2 H 2 H 2 H 3 Met oldallánc Nle oldallánc Fenilalanin (F): benzilcsoport az oldalláncban 11

katalitikus hidrogénezés benzolgyr telítdése hosszú hidrogénezést kerülni kell ( His(Bzl), Arg(N 2 ) ) Z-Phe- - Na + p.: 133-134, Z-Phe-H p.: 88-89 megfelelen végzett savanyítással elkerülhet (Z-Gly-H, Z-Ala-H, Z-Lys(Z)-H, Z-Val-H, Z-Ser-H) Prolin (P): iminosav, nem racemizálódik, merev struktúrában törés 1. Prolin körüli kötések labilitása: Z-Pro-Gly-Me + 1M NaH β-turn szerkezetben Z-Pro-H (0,1M NaH jó) Tyr-Pro, Thr-Pro, Ser-Pro, Lys-Pro (Na/NH 3 ) közeli proton katalizálja a hasadást Asp-Pro híg savakra hasad 2. Diketopiperazin képzdés: lásd Gly Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Pro, D-Aaa és nagy oldallánc elsegíti SPPS (szilárdfázisú peptidszintézis), aktivált származékok tárolása 3. Szekunder amin alkilezdése: könnyebben N-alkilezdik, mint a primer amin SPPS lánc letörés: H 2 l H 2 H 2 NH bázis -Hl H 2 H 2 N H 2 12

4. D-s kapcsolás: N acilvándorlás DMF > DM 5. Prolin kapcsolása prolinhoz: H 3 H 3 HN H N H 3 térgátolt HN H H Triptofán (W): savas, oxidatív rendszereket nem bírja fémionok, napfény katalizál kinoidális átrendezdés 1. Aminosav analízis: enzimes hasítás, vagy metánszulfonsavas hidrolízis Tyr:Trp (UV meghatározás) Tyr (aminosav analízis) 2. Indolgyr alkilezdése: terc-butil kation (különösen veszélyes) H 2 x x NH x x HF hasítás eltt Boc-csoport eltávolítása! Irreverzibilis gyökfogók (scavanger) 3. Azidos kapcsolás: -NH 2 NH 2 +HN 2 közben az indolgyr nitrozálódhat 13

4. UV hatása hidrolízis közben: H H H H 2 NH 2 H NH NH NH H 5. N-terminális Trp viselkedése fragmenskondenzáció során: H 2 H H NH NH dimer vegyület keletkezik H 2 Metionin (M): oxidáció, alkilezdés 1. xidáció: savas közegben leveg hatására szulfoxid keletkezik. ers oxidálószer (pl. H 2 2 ) hatására szulfon keletkezik ox. S S S szulfoxid szulfon (védelem is) 2. Alkilezdés: ox. H 3 S H 2 + H 3 MSA H 3 +S H 3 H 2 + H H 2 H 2 NH H NH H 14

tioanizol gyökfogó alkalmazása szükséges (hard-soft, pull-push) ha benzil kation megy rá, metil fog lehasadni, S-benzil- homocisztein keletkezése közben 3. Katalizátor méreg: S atom miatt (cisztein is) BF 3 adalék segít vagy pótolni a katalizátort Szerin (S): hidrofil H-csoport funkciós csoport alternatív védelem (SPPS!) 1. H acilezdése: acilezszer nagy feleslege esetén NH > H nukleofilitás 2. Acilvándorlás: Gly-Ser N, N fenolok gátolják, HBt, imidazol segíti az acilezdést 3. Intramolekulris acilezés: Trt NH H X H 2 H -HX Trt NH H H 2 ez általában nem gond, mert tovább acilez 4. urtius átrendezdés: Z NH H N H 3 2 H -N 2 Z NH H N H 2 H Z H 2 NH H azid izocianát származék 2-oxazolidon származék 5. Leuchs anhidrid: NH 15

H 2 HN H H HN H H H 2 az H-csoportot védeni kell 6. SPPS: HF hasítás N migráció láncszakadás NH H NH H H H 2 H + H 3 - NH H + H 3 N H 7. Szerin észterek lúgos hidrolízis dehidroalanin (Thr vízvisszavétel racemizáció allotreonin) H 2 Treonin (T): -- két aszimmetria centrum treo Thr Na sója nem oldódik alkoholban, az allotreoniné igen. Szerinhez hasonló viselkedés, de térgátlás miatt lassabb reakciók. Tirozin (Y): vízben oldódik a fenolos H miatt (lúgos kirázás!) 1. Alkilezdés: H segíti a gyr alkilezdését (Bzl védelem intramolekuláris alkilezdés) 2. Acilezdés: Tyr» Ser > Thr ( Z-l Z-Tyr(Z)-H ) átacilezés is könnyebb N migráció 3. Azidképzés: NaN 2 gyr nitrozálódása 4. H nukleofilitása összehasonlítható az NH-éval hosszú reakció vagy acilezszer felesleg -acilezés de bázissal bontható isztein (): cisztein ---- cisztin (oxidáció) 16

H 2 SH HS ox. H 2 S S H 2 NH H H 2 NH H red. NH H NH H ys ys ys dipeptid ys diszulfidhíd ys ys ciklocisztin 1. Könnyen oxidálódik, ph7, leveg jelenlétében. edukálása merkapto vegyületekkel (DTT, merkaptoetanol) 2. xidatív hasítás ciszteinsav (pl. aminosav analízis) NH 2 H 2 H S 3 H H 3. Acilezésben versenyez az NH-csoporttal, N S migráció pl. Npys-csoport 4. Alkilezdés: védcsoportok hasításánál (gyökfogók használata) 5. Katalizátor méreg, H 2 /kat. 6. Diszproporcionálódás: aszimmetrikus diszulfidhidak szimmetrikussá alakulása. Aszparagin (N), Glutamin (Q): oldallánc amid (NH 2 ) 1. Dehidratáció: karboxamid-csoport vízvesztéssel nitrillé alakul ( N). D, foszgén, Tos-l/piridin, Pl 3 Asn és Gln kapcsolása aktív észteres vagy in situ aktív észteres eljárással. Beépült Asn, Gln már nem módosul. 2. Gyrzárás: Asn: szukcinimidgyr (ezt követ transzpeptidáció), ld. Gly. Gln esetén a megfelel glutárimid kialakulása ritka. 17

Gln: piroglutaminsav képzdés a peptid N-terminálisán. H 2 H 2 N -NH 3 H 2 H 2 N H H 2 H 2 HN H Gln > Glu(X) > Glu, Hl/ecetsav > Hl/dioxán, TFA/DM Közeli His katalizál! Asn esetén a négytagú gyr miatt nem alakul ki. Aszparaginsav (D), Glutaminsav (E): ldallánc karboxilcsoportot védeni kell! E nélkül az aktiválás ciklikus anhidridhez vezet (α és γ-peptidkötés alakul ki). ldalláncban védett Asp és Glu hasonló gyrzárási mellékreakciót mutatnak, mint az Asn és Gln, bár kisebb mértékben (védcsporttol függ). Hisztidin (H): alkil- és acilátviv tulajdonsága okoz sok gondot. Nincs igazán jó védcsoportja (ld. védcsoportoknál). Lizin (K): ldallánc NH 2 -csoport védelme elengedhetetlen. Arginin (): Arg rn átalakulás bizonyos védcsoportok hasításánál. Szulfonsav-típusú védcsoportjainak hasításakor inkább más aminosavak (pl. Tyr sérül). 18

VÉDSPTK H 2 N H 1 H + H 2 N H 2 H sokféle termék X 1 NH H 2 H + H 2 N H Y -H 2 Amino védcsoportok (X): nem uretán típusúak, uretán típusúak X 1 2 NH H NH H Y NH H H NH H H amid uretán acemizáció: H N Akt H B: -AktH N H H-Aaa-Y LL és DL dipeptid Acil-Aaa-Akt oxazol-5-on H N H H Acil-DL-Aaa-H H 2 -H + +H + N : - N : - N pszeudo aromás rendszer H : - 19

- amidokban (--NH- ) a f nukleofil - uretánokban (---NH- ) N a f nukleofil - Pro, Pht, Tos nincs racemizació - direkt protonelvonás, rövid ideig dolgozni bázisos közegben 20

NEM UETÁN TÍPUSÚ NH VÉDSPTK Tozil (Tos): Du Vigneud H 3 S NH Bevitel: Tos-l formában Tos acemizáció: Tos-Aaa-H kapcsolásakor nincs, S a f nukleofil Hasítás: Na/NH 3 redukció ( ys(bzl), His(Bzl) ) Problémák: Lys-Pro, Thr-Pro kötés hasadása Arg(Tos) rn rn(tos) laktámgyr (Lys(Tos) kevésbé) H 2 N H H 2 NH H 2 H 2 Elektrolitikus redukció: Pb - (Tos-Peptid, 20%MeH, ph11), + (20% Hl) Ers sav: HF, TFMSA Kapcsolás: nem kapcsolható vegyes anhidrides módszerrel, mert jelents mennyiségben fordítottan acilezett termék. Savkloriddal csak Mg szuszpenzióban (azidoknál hasonlóan): 21

Tos NH H l Tos NH H - Tos N H H H 2 Aktív észteres kapcsolás: (Pro és pglu kivételével) Tos NH H Tos NH H H N NH H l - l - - H + Tos NH 2 piridin vagy N 2 vizes alkohol + H N2 Ftalil (Pht): N Bevitel: ftálsavanhidrid + Aaa (Gly esetén ömlesztés 150 ) 22

Hl hô NH Nefkens: H N H N-karboxi-etil-ftálimid Sl 2 + hô H - N 2 H 5 H H N H Trp, Asn, Gln, Met, Asp-Pro! + H 2 N ph 7-8 Hasítás: hidrazinolízis (bár ez sem kvantitatív) NH NH + H 2 N + N H 2 N 2 H 5 etil-uretán 0,1M hidrazin/eth, 1óra reflux ftálhidrazid Hl hozzáadására kikristályosodik alkilészterek! Formil (For): vízoldékonnyá teszi a peptidet (ioncserés tisztítás) H NH Bevitel: hangyasav + ecetsavanhidrid + Aaa, For-Tcp For 23

Hasítás: hidrogén-peroxid H ys, Trp, Met NH H 2 2 H oxidálódik! NH - 2 NH 2 0,5M Hl (alkohol-víz elegy) melegítve Gly-Lys(For) kötéshasadás Hidrazin vagy hidroxilamin (enyhén savas közegben) ezisztens: HBr/jégecet, híg lúg, Na/NH 3 Trifluoracetil (Tfa): Lys(Tfa) F 3 NH Tfa Bevitel: Tfa-anhidrid (felesleg racemizáció) Tfa-anhidrid/TFA ( Tfa-Lys-H ) Tfa-Et ( H-Lys(Tfa)-H ) Tfa-Ph, F 3 --l 3 Hasítás: híg NaH, Ba(H) 2, NaBH 4 redukció Hl/EtH Tfa-Et + peptid-észter Hl-sója (más savakkal szemben stabil) Tfa-peptid-észter magas gztenzió 19 F NM gázkromatográfia Klóracetil (lac): szelektív hasíthatóság, ciklizálás 24

lh 2 NH lac Bevitel: klórecetsav-anhidrid, lac-pcp Hasítás: tiovegyületekkel 1. 2-merkapto-3-nitro-piridin N 2 + NaH 3 N 2 N H S lh 2 NH 40 N S H 2 NH NH 2 + - N + N 2 S H TFA, 1-4 óra 20 2. 1-piperidin-tiokarboxamid N S NH 2 acemizáció: utólagos bevitel iklizálás: klóracetilezett aminocsoport + ys SH-csoportja lh 2 PEPTID ys SH B: H 2 PEPTID ys S Konjugálás: BrAc-származék jobb Fehérje vagy polipeptid NH-csoportjainak módosítása BrAccsoporttal és ezt reagáltatni ys tartalmú peptiddel. 25

Alkil-típusú védcsoportok: H 2 NH H benzhidril (Bha) benzil (Bzl) NH H 3 H 3 NH NH NH tritil (Trt) 4-metil-tritil (Mtt) 4-metoxi-tritil (Mmt) Hasítás: savas hasítás, savérzékenység: Mmt>Mtt>Trt»Bha»Bzl Mmt és Mtt 1% TFA/DM, Trt 5% TFA/DM Bzl inkább H 2 /kat Savlabilitás fokozása: metoxi > metil Savstabilitás fokozása: nitro > klór Alkalmazásuk a nagy térgátlás miatt fleg oldallánc védelem. acemizáció: Bzl - racemizálódik, Trt-Aaa-X térgátlás miatt nem. 26

AILSZULFENIL VÉDSPTK: N 2 N 2 S NH N S NH 2-nitrofenil-szulfenil (NPS) 3-nitro-2-piridinszulfenil (Npys) Hasítás: 1. savas (Hl/éter, EtAc, MeH) (NPS) 2. nukleofil: tiovegyületek (NPS, Npys) l és Me szubsztituált NPS származékok a savstabilitás változtatása érdekében. Trp indolrésze, ill. Tyr szubsztituálódhat. N S átmenet ys esetében, HBt, His katalizálja. acemizáció: van 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxo-ciklohexililidén)-etil (Dde): H 3 H 3 NH H 2 N NH 2 H 3 H 3 H 3 H 3 N NH Hasítás: Speciális hasíthatóság miatt fleg oldallánc védelem. 2% hidrazin/dmf 2x3 perc ezisztens: TFA hatására 0,1% hasad 20% piperidin 3% hasad 2 óra alatt 6,5% hasad 4 óra alatt. 27

UETÁN TÍPUSÚ VÉDSPTK Aktivált aminosavszármazék nem racemizálódik. Nagy variációs lehetség (különböz hasítások). Kiszorították a nem uretán típusú védcsoportokat, elssorban az α-aminocsoportok védelmében. Benzil-oxi-karbonil (Z): H 2 NH Z Bevitel: Z-l (klórhangyasav benzilészter: 6 H 5 -H 2 ---l) foszgén + benzilalkohol (foszgén feleslegben) Z-l Termikus bomlással 2 -t veszthet + 6 H 5 -H 2 -l Nem tisztítják desztillálással (esetleg vacuum desztillálás)! Hasítás: 1. H 2 /kat. (Pd/) (ys, Met +TEA karbamilát+ 2 ) Z-PEPTID 6 H 5 -H 3 + H--NH- 2 + NH 2 - Nincs térfogatváltozás! H 2 2 (Ba(H) 2 Ba 3 követés) 2. Savas hasítás: HBr/jégecet, HF, TFMSA, TMSTf TFA/DM (1%) 28

H 2 NH H 2 NH H H 2 X X H 2 + H NH 2 + NH 2 HBr/THF v. dioxán éterkötés hasadás észterezés 2N Hl/hangyasav (Met) alkilezdés visszaszorítása 3. Na/NH 3 : már nem használják Problémák: 1. Z-védcsoport nem érzékeny bázisra, de H 2 NH H 2 NH H 2 Z-Aaa-Gly-... 2. Savklorid képzés: HN H NH + H - BzlH NH H 2 NH hidantoin-származék 29

H 2 NH H 2 hô H + H l 2 l HN Leuchs-anhidrid Bzl-l Tionil-klorid helyett Pl 5 a savklorid kialakításához. 3. Savas hasítás: Bzl-észter is hasad a Z-csoport hasításakor < 20 perc és < 20 szelektív Z-csoport hasítás Szubsztituált származékok: H 3 H 2 NH híg Hl/etanol p-metoxi-benzil-oxi-karbonil ( Z(Me) ) 2 N H 2 NH HBr/jégecet, igen erôs savak p-nitro-benzil-oxi-karbonil ( Z(N 2 ) ) l H 2 NH erôs savak, HF 2-klór-benzil-oxi-karbonil ( lz ) N N H 2 NH szines, de hasadás után szintelen katalitikus H 2! Ne! p-azofenil-benzil-oxi-karbonil ) 30

N 2 H 3 H 3 H 2 NH terc-butil-oxi-karbonil (Boc): H 3 H 3 H 3 hυ (350nm) NH terc-butil-oxi-karbonil (Boc) Bevitel: Boc-N 3, di-terc-butil-dikarbonát ( (Boc) 2 ) H 3 H 3 H 3 H 3 N 3 H 3 H 3 H 3 H 3 H 3 Hasítás: híg savakra; 25% TFA/DM, 2N Hl/dioxán, EtAc, hangyasav, 0,1N Hl/hangyasav Stabil: H 2 /kat. bázis, hidrazin, Na/NH 3 Probléma: t Bu kation alkilezi a Trp,Met, védett ys aminosavakat 31

Származékok: H 3 H 3 NH 80% AcH, 3 óra 5% TFA/DM 9 perc, hυ -1400x savlabilabb, mint a Boc H 3 H 3 α,α dimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxi-karbonil (Ddz) H 3 NH 80% AcH, <1 óra 0,5% TFA/DM 9 perc, -3000x savlabilabb, mint a Boc H 3 bifenil-izopropil-oxi-karbonil (Bpoc) 9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc): H H 2 NH H 3 NH 9-fluorenil-metoxi-karbonil (Fmoc) 9-metil-9-fluorenil-oxi-karbonil gyenge szerves bázisra hasad erôs savakra hasad Bevitel: Fmoc-l, Fmoc-Su 32

H H 2 l H H 2 N Fmoc-l Fmoc-Su H 2 H 2 Hasítás: gyenge szerves bázisok (szekunder aminok); piperidin, morfolin, DEA (dietil-amin), DBU: 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-én TBAF: tetra-butil-ammonium fluorid ezisztens savakra, H 2 /kat. (ellenvélemények is) Probléma: Hosszú hasítás esetén diketopiperazin képzdés a kritikus szekvenciáknál. A keletkez dibenzofulvén okozhat mellékreakciókat. H 2 Allil-oxi-karbonil (Aloc): H 2 H H 2 H 2 NH allil-oxi-karbonil (Aloc) Bevitel: Aloc-l Hasítás: Pd()/(Ph) 3 P ezisztens: sav, bázis (szelektív, ortogonális) védcsoport kombináció. iklohexil-oxi-karbonil (hoc, Hoc): 33

NH Bevitel: hoc-l, hoc-su ciklohexil-oxi-karbonil (hoc) Hasítás: HF, TMSTf (25 ), 0 -on 1-2% PÉLDÁK 1. Tuftsin-származékok szintézise: Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(N 2 )-NBzl Thr-Lys-Pro-Arg Z-Lys(Boc)-Pro-Arg(N 2 )-NBzl 1. Hl/EtAc 1. Hl/Etc 2. Boc-Thr-Pcp 2. Boc-Thr-Pcp Boc-Thr-Lys(Z)-Pro-Arg(N 2 )-NBzl Z-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg(N 2 )-NBzl 1. Hl/EtAc 1. Hl/EtAc H 2 /kat 2. H 2 /kat 2. For-Tcp u.a. 3. H 2 /kat 1 2 3 4 5 6 Boc-Lys(Boc)-Pro-Arg(N 2 )-NBzl 1. Hl/EtAc 2. Boc-Thr-Pcp Boc-Thr-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg(N 2 )-NBzl 7 8 9 34

1. Thr-Lys-Pro-Arg 4. Lys(Thr)-Pro-Arg 2. For-Thr-Lys-Pro-Arg 5. Lys(For-Thr)-Pro-Arg 3. Boc-Thr-Lys-Pro-Arg 6. Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg 7. Thr-Lys-Pro-Arg 8. For-Thr-Lys(For-Thr)-Pro-Arg 9. Boc-Thr-Lys(Boc-Thr)-Pro-Arg 2. hoc-lys(boc)-gly- hoc-lys(z-gly)-gly- hoc-lys(h-gly)-gly-h hoc-lys( Gly)-Gly H-Lys( Gly)-Gly 1. 33% TFA/DM 2. 10% DIEA/DM 3. Z-Gly-H + D +HBt 1M TMSTf-tioanizol/TFA BP-HBt-DIEA (3:3:6) HF-p-krezol (9:1) 3. Template Assembled Synthetic Protein (TASP): (Mutter et al.) Fmoc szintézis: 35

Boc Aloc P G K K P K K G Dde lz 4. Lysine-tree (lizin fa), Multiple Antigen Protein (MAP): (Tam et al.) Boc K Fmoc Boc K K Fmoc Boc K Fmoc K Boc K Fmoc K βa Szelektív hasítás után két különböz epitóp kapcsolható (esetleg további módosítás után pl. klór-acetilezés). 36

KABXIL VÉDSPTK - észterek (kevesebb fajta) - olcsó, veszélytelenebb Szintézisek oldatban: Boc NH H X + NH 2 H Y Boc NH H NH H X és Y is lehet észter. Minden észter aktiválás, de... t Bu < Et < Bzl < Me < All < Ph < Np < Pcp < Pfp Y Szilárdfázisú szintézis: -terminális karboxil védelem = gyanta Boc NH H + NH 2 H Boc NH H NH H X Metil-, etil-észter (Me, Et): Észter képzés: Aaa + alkohol (vízmentes) + Hl (gáz) Met, Trp, Tyr: kíméletesebb módszer tionilkloriddal Aaa alkoholos szuszpenzió + fölös tionilklorid: l S l MeH 2 Hl + H3 S Az észter Hl sója éterrel kicsapható. H 3 ez a metil átvivô Hasítás: enyhe alkalikus közeg; 0,1-1,5N NaH-aceton (1:1) < T, minimális bázis felesleg, < 1 óra Problémák: racemizáció (magasabb hmérséklet, bázis felesleg, hosszú id) NH 3 vesztés (Gln, Asn) elfordulhat ciklizáció 37

Pht védcsoport Ammonolízis: peptid-amid Hidrazinolízis: peptid-hidrazid urea hidantoin gyr felnyílása miatt nem! peptid-azid Benzil-észter (Bzl): Észteresítés: Hl katalízis nem jó, mert Bzl-l Bzl-Aaa (aminosav függ) p-toluol-szulfonátos katalízis (Fp csökkenés) azeotropos desztilláció (kristályvíz!) Hasítás: ers savak; HF, TFMSA, TMSTf 2N HBr/jégecet (hosszabb id, magasabb hmérséklet) H 2 /kat. (Pd); nincs 2 fejldés H 2 fogyás mérhet (alkoholban (ekv. Hl) vagy ecetsavban) Szubsztituált benzil-észterek: p-nitro-benzil-észter (NBzl): Bevitel: X-Aaa-H + D + p-nitro-benzil-alkohol Hasítás: H 2 /kat. (Pd/), (HBr/jégecetre rezisztens) p-klór-benzil-észter (lbzl): savstabilitást növeli Bevitel: X-Aaa-H + D + p-klór-benzil-alkohol Hasítás: ers savakra; HF, TFMSA p-metoxi-benzil-észter: savlabilitás növelése Bevitel: X-Aaa-H + D + p-metoxi-benzil-alkohol Hasítás: gyenge savakra; TFA benzhidril-észter (Bh): 38

H Bevitel: X-Aaa- - Ag + + benzil-klorid Hasítás: sokféle; H 2 /kat. (Pd/), TFA, bázis, hidrazin 2,2-dinitro-benzhidril-észter: Hasítás: fotolitikus hasítás iklo-alkil-észterek (pentil, hexil, heptil) (cpen, chex, chep): Bevitel: X-Aaa-H + D + megfelel alkohol Hasítás: ers savak; HF (ciklopentil kicsit savérzékenyebb, míg a cikloheptil kissé bázis érzékeny, ciklohexil a legjobb) Allil-észter (All): H 2 H H 2 Hasítás: Pd(0) hasítható, savra, bázisra rezisztens terc-butil-észter ( t Bu): H 3 H 3 H 3 Bevitel: nem lehet savkatal ízissel elállítani, mert hasad savra Z Aaa H + H 2 H 3 H 3 DM kat. cc.h 2 S 4 H 3 H 3 H 3 39

Vastag falú lombikban, zárt térben, óránként rázogatni. Végén fölös izobutilént a lombik kinyitásával elpárologtatni. Z hasítás katalitikus hidrogénezéssel. Szabad N-terminálissal is eláll, mert a t Bu nem aktív észter. Hasítás: sok elektronküld csoport miatt híg savakra; TFA, HBr/jégecet, Hl/hangyasav (lassabban, mint a Boc). Bázisnak ellenáll (40% KH!, terc-butil-éter nem). 9-Fluorenil-metil-észter (Fm): H H 2 Bevitel: X-Aaa-H + D + 9-fluorenil-metanol Hasítás: mint az Fmoc-csoportot (szerves szekunder aminok; piperidin, morfolin, DEA, valamint TBAF, DBU) 40

LDALLÁN VÉDSPTK Szintézis oldatban: nem szükséges az oldalláncok védelme kivétel: H, NH 2, (SH) Szilárdfázisú szintézisek: acilezszer feleslege miatt kell! H funkciós csoport: Tyr > Ser > Thr (reaktivitási sorrend) Acil védelem (Thr, Ser): lúgos hasítás dehidratálás racemizáció ---N acilvándorlás Éter védelem: Me, Et nehezen leszedhet, ezért nem jó. Bzl, t Bu alkalmas Benzil-éter (Bzl): Bevitel: kialakítása nagyon nehéz, rossz kitermelés (totál szintézis) Boc-Ser-H NaH DMF Boc-Ser(Na)-H BzlBr Boc-Ser(Bzl)-H Hasítás: H 2 /kat. (Pd/), ers savak; HF, TFMSA, TMSTf, TMSBr, HBr/jégecet terc-butil-éter ( t Bu): Bevitel: X-Aaa-Y + izobutilén + kat. cc. H 2 S 4 X és Y olyan védcsoportok, amelyek más módon is hasíthatók, mint savas hidrolízis (Z, Fmoc, Bpoc, Nps, Alloc, NBzl, Me, Et, Fm, All) Hasítás: enyhe savakkal; TFA, Hl/jégecet, HBr/jégecet Ser és Thr esetén e két védcsoport elégséges és megfelel. 41

Szabad H acilezdése (oldat fázis) megakadályozható pentaklórfenol (PcpH) vagy pentafluor-fenol (PfpH) jelenlétével (aktív észteres kapcsolás), de HBt, illetve imidazol (His) jelenléte/közelsége elsegíti. Acilezett H elbontása: NH 3 /metanol. Tirozin: külön probléma Bzl: nem elég stabil savakra (50% TFA/DM 1-2% hasadás) intramolekuláris átrendezdés, mert gyökfogókkal (anizol, krezolok, tioanizol, DTT, etil-metil-szulfid) sem gátolható. H 2 H H 2 NH H 2 H NH H 2 Elektronszívó szubsztituensek segítenek: 2,6-diklór-benzil (2,6-l 2 Bzl) vagy p-bróm-benzil (p-brbzl) csoportok hasításkor stabilabb karbokation jön létre, ezért scavangerekkel jobban befoghatók (de nem teljesen, kb. 5% melléktermék, míg a Bzl esetén általában > 20%) Bevitel: X-Aaa-H + (Hlg)BzlBr + bázis 2-Bróm-benzil-oxi-karbonil (2-BrZ): H 42

2-BrZ H 2 Br H 2 NH H SH-védcsoportok (ys): p-metoxi-benzil (Mob): H 3 H 2 S p-metoxi-benzil (Mob) 4-Metil-benzil (Meb): H 3 H 2 S 4-metil-benzil (Meb) Hasítás: ers savakra hasadnak (HF), de a Meb hasadása TFMSA szobahn nem tökéletes és 0 -on minimális, hasonlóan a TMSTf hasító reagenshez. A Mob azonban TFA-ban nem elég stabil, tehát utána már ne túl sok kapcsolás. Meb hasítás Tl(tfa) 3 majnem teljes Acetamido-metil (Acm): H 3 NH H 2 Acetamido-metil (Acm) S 43

Bevitel: ys Hl sója N-hidroxi-metil-acetamid (HH 2 NHH 3 ) +TFA Hasítás: Hg(II)-sók, Tl(tfa) 3, I 2, Ag-triflát stabil savakra és piperidinre. 3-Nitro-2-piridin-szulfenil (Npys): N 2 N S S 3-nitro-2-piridin-szulfenil (Npys) Hasítás: tiolokkal, bázisra (ph < 6), HBt?, piperidin, low-high HF. Stabil savakra; HF, TFA. Diszulfidhíd kialakítására alkalmas! Tritil (Trt): Bevitel: ys Hl só + Trt-H Hasítás: HAc, TFA, Hg(II)-sók, I 2 stabil piperidinre (Fmoc-szintézis) 9-Fluorenil-metil (Fm): Hasítás: piperidin, stabil szervetlen bázis, savak S-terc-butil (S t Bu): H 3 H 3 S S H 3 S-terc-butil Bevitel: t Bu-SN 44

Hasítás: tiolok, foszfinok stabil: savakra, piperidin Histidin (imidazol oldallánc): τ NH H H Szabad imidazol acilezdhet és/vagy enantioizomerizáció játszódhat le rajta. Acilezdés meggátolható átmeneti védelemmel is oldatfázisban (pl. Boc-His(Boc)-H), de fragmens kondenzáció és SPPS esetén végig védeni kell. Az enantioizomerizáció elkerülésére a N-t kell védeni, de a legtöbb védcsoport a N-t védi. Benzil (Bzl): Na/NH 3 redukcióra hasítható (már nem használják). Dinitrofenil (Dnp): Bevitel: 1-fluor-2,4-dinitrobenzol + bázis + X-His-H Hasítás: tiolok, tiofenol (DMF, DIEA), hidrazinra is (Dde!) Az utolsó aminovédcsoport hasítása eltt hasítani, mert alkilez (1. Dnp, 2. Boc, 3. többi védcsoport + gyanta) Ez talán a legbiztonságosabb védcsoport. Dinitrofenol eltávolítása gélszréssel. Stabil: savakra, bázisokra. Tozil (Tos): Bevitel: Tos-l + bázis + X-His-H Hasítás: ers savak (HF, TFMSA, TMSTf), Ac 2 -piridin, részben hasad HBt-re (D/HBt!) N π 45

TFA-ban sem elég stabil, ugyanakkor ers savas hasítása sem 100%-os. Benzil-oxi-metil (Bom): H τ π N N H H 2 H 2 benzil-oxi-metil (Bom) Bevitel: Bzl--H 2 -l + bázis + X-His-H Hasítás: ers savakra (HF, TFMSA, TMSTf) terc-butil-oxi-metil (Bum): H τ π N N H 2 H H 3 H 3 H 3 terc-butil-oxi-metil (Bum) Bevitel: t Bu--H 2 -l + bázis + X-His-H Hasítás: híg savakra (TFA) Probléma mindkettnél: formaldehid keletkezik (azonnal eltávolítani, mert számos mellékreakciót okoz). Különös gond az N-terminális cisztein: SH NH 2 H 2 H HH - H 2 H 2 S NH H 2 H tiazolidin-karbonsav 46

Tritil (Trt): Bevitel: TrtH + Ac 2 /H + Hasítás: TFA (Fmoc-eljárás), talán a legjobb erre, bár védelem. terc-butil-oxi-karbonil (Boc): Kevésbé hatékony, mint a Trt. Allil-oxi-karbonil (Aloc): H τ π N N H 2 H H 2 H H 2 allil-oxi-metil Bevitel: Boc-His(Boc)-Me + H 2 =H-H 2 --H 2 l Hasítás: Pd(0)/PPh 3 Triptofán (indol-oldallánc): Formil (For): Bevitel: hangyasav + ecetsav anhidrid + védett Trp Hasítás: piperidin, low-high HF, TFMSA(TMSTf)- tioanizol/tfa iklohexil-oxi-karbonil (Hoc): Bevitel: Hoc-l + X-Trp-H Hasítás: HF 47

-aminocsoport aktiválás PEPTIDKÖTÉS KIALAKÍTÁSA -karboxilcsoport aktiválás (egyszerbb, kíméletesebb) a) Step wise (lépésenkénti) szintézis: Z-NH-H 2 --X + NH 2 -H 1 --Y(NH 2 ) - HX Z-NH-H 2 --NH-H 1 --Y amino-védcsoport eltávolítása Z-NH-H 3 --X + NH 2 -H 2 --NH-H 1 --Y - HX Z-NH-H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --Y védcsoportok eltávolítása 1 vagy 2 lépésben NH 2 -H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --H Z védcsoport uretán típusú vagy Tos, Pht: nincs racemizációveszély a lépésenkénti kapcsolások esetén 48

b) Fragmenskondenzáció: Z-NH-H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --Y -YH Z-NH-H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --H - Z NH 2 -H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --Y 1+2 - H 2 Z-NH-H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --Y 2 védcsoportok eltávolítása 1 vagy 2 lépésben H-NH-H 3 --NH-H 2 --NH-H 1 --Y 2 Fragmenskondenzáció mindig racemizáció veszéllyel jár! Kiküszöbölés, csökkentés: - Gly, Pro (Ala) -terminálisú fragmensek alkalmazása - azidos kapcsolás - racemizációt csökkent adalékok (ul 2, HBt) 49

KAPSLÁSI ELJÁÁSK A. AZIDS KAPSLÁS (urtius, 1902) * H 2 N-NH 2 HN 2 Φ--NH-H-H 3 Φ--NH-H-NHNH 2 H 2 N-H'-Na Φ--NH-H-N 3 Φ--NH-H--NH-H'- Na + HN 3 *98 % hidrazin-hidrát metanolos oldata, 2 nap alatt kiválik az alkoholos oldatból. X-AAA-l + NaN 3 X-AAA-N 3 + Nal, ha X=Pht, Tfa Az eljárás lassú acilezést és ezáltal sok mellékreakciót eredményez. De oxazolonon át nincs racemizáció, csak direkt protonelvonással (aminoterminális semlegesítése, bázisfelesleg ne!) 1-dietil-amino-2-propanol<DIEA<NMM<TEA (a racemizáció szempontjából) aminosav típusa reakciósebesség racemizáció Z-Pro-Leu-N 3 + NH 2 -Pro-Me (0%); Z-Pro-Val-N 3 + NH 2 -Pro-Me (3%) Alkalmazás: lépésenkénti szintéziseknél nagyon ritkán (His), fragmenskondenzációnál néha. Védett hidrazidok: védcsoportként mködnek a szintézis alatt Boc-Aaa 1 -Aaa 2 -NH-NH-Z, Z-Aaa 1 -Aaa 2 -NH-NH-Boc (ellentétes, szelektíven hasítható védcsoportok alkalmazása) Mellékreakciók: 1. urtius-féle átrendezdés: -N 2 H 2 N-' --N3 -N== -NH--NH-' (karbamid) H (Ser) -NH-- AA hiányzik majd! Azidok használata feldolgozás nélkül! ' HN H δ + δ + δ - N δ N - δ N + δ - 50

2. Amidképzdés: -H 2 Z-NH-H--NH-NH-N Z-NH-H-N 3 -N 2 Z-NH-H-NH 2 3. Diacil-hidrazin képzdés: Z-NH-H-N 3 + H 2 N-NH--H-NH-Z Z-NH-H--NH-NH--H-NH-Z 4. Arg guanidino-csoport: Arg(N 2 ) Arg(NH 2 ), Arg(X) rn, Arg(Tos) Arg 5. HN 2 : Trp, Tyr N2 szubsztitúció; Met, cys(salk) szulfoxid savlabilis védcsoportok (Boc, Trt) hasadása (<-25 ) Megoldás: H + Φ 2 P 51

B. SAVKLIDS KAPSLÁS E. Fischer (oktapeptid), Fodor G. (nonapeptid) NaH 1. 2 H 5 ---NH-H-l + H 2 N-H'-Na 2 H 5 ---NH-H--NH-H'-Na + Nal 2. 2 H 5 ---NH-H-l + 2 H 2 N-H'- 2 H 5 2 H 5 ---NH-H--NH-H'- 2 H 5 + l - NH 3 + -H- 2 H 5 Igen reaktív racemizáció (oxazolon), diketopiperazin. Fleg addig alkalmazták, amíg csak az azidos kapcsolás volt a versenytárs. Újabban arpino Fmoc-AA-l(F) alkalmazását javasolja (SPPS). Elállítás: Acil-Aaa-H + Pl 5, Pl 3, Sl 2 (magas hmérséklet) Problémák: foszfor-szennyezés a peptidekben Sl 2 + alkoxikarbonil-aaa Φ-H 2 ---NH-H-l Φ-H 2 -l + HN H Leuchs-anhidrid Tos és Pht védelem esetén ez nem történik. 52

. VEGYES ANHIDIDES KAPSLÁS ' + H 2 N-Q --NH-Q + '-H '= 2 H 5 --; (H 3 ) 2 =H-H 2 --; (H 3 ) 3 - --l + X-NH-H'-H klórhangyasav észter klórszénsav észter - d31>> d+2 - gyors jó termelés, egyszer feldolgozás - racemizáció (TEA>>NMM>>N-metil-piperidin) δ +1 X-NH-H' (H 3 ) 2 =H-H 2 - δ +2 NH 2 -Q Vegyes anhidrid képzés: THF, dioxán oldat, -15, 2-4 15 perc, izolálás nélkül használni. Hmérséklet!!! 0 -on diszproporció történik ---- 2 H 5 ---- + 2 H 5 ---- 2 H 5 NH 2 -Q NH 2 -Q --NH-Q + H 2 H 5 --NH-Q + 2 + EtH láncletörés, hiányos szekvenciák alakulhatnak ki ennek következtében. Kapcsolás: -15-5 -ra melegítés közben kb. fél óra, majd T 2 eltávolítására (NMM Hl kiválik) Feldolgozás: egyszer extrakcióval Aminosavak hatása a vegyes anhidrides kapcsolásra: 1. X-Arg(Y)-H laktámgyr kialakulás, X-Arg(Y) 2 -H!! 2. Asn imid 3. X-Aaa 1 + Pro-Aaa 3... fordított acilezés 4. Boc-His-H + 2 ekv. savklorid egy az imidazol védelmére 5. Val, Ile, Thr (nagy oldallánc, β-elágazás) fordított acilezés 53

Más típusú vegyes anhidridek: 1. Difenil-foszfinsav számos egyéb foszforsavszármazékkal készítettek Z-NH-H vegyes anhidridet. Kén- és arzénsavszármazékok kuriózumok. P EMA (repetitive excess mixed anhydride) módszer. 1-2 AA/nap 1,5 mol savkomponens; 1,5 mol NMM; 1,4 mol izobutil-oxi-karbonil-klorid -15, 1 perc 1 mol aminokomponens (THF v. DMF); -15, 2 óra KH 3, peptid kicsapódik 2. EEDQ (1-etoxi-karbonil-2-etoxi-1,2-dihidrokinolin) let TEA EtH N 2 H 5 2 H 5 + Z-NH-H-H N 2 H 5 H-NH-Z (nem kell savmegköt ágens nincs racemizáció) N + Z-NH-H 2 H 5 - izobutanol származék is használatos 54