BME VIK MIT Els éves doktoranduszi beszámoló Agyi mikroelektródás rendszerek kiértékelése Cserpán Dorottya Témavezetõk: Horváth Gábor és Somogyvári Zoltán Budapest, 2012
Absztrakt Munkám során agyi mérések kiértékelésével foglalkozom, különös tekintettel az egyes idegsejtek, vagy kisebb idegsejtcsoportokra összpontosítva. Az egyik f kutatási vonal egy olyan módszer fejlesztése, mely az in vivo extracelluláris mérésekb l rekonstruálja az idegsejt áramforrásainak tér és id beli eloszlását. A módszer lehet vé teszi pl. egyes idegsejtek szinaptikus bemeneteinek vizsgálatára, a dendritek terjed jel meggyelésére a többi mérési eszköznél jobb felbontással térben és id ben. A másik kutatási vonal célja a párhuzamosan, egymástól 50-100 µm-re lév mérési pontokban rögzített jelek összehasonlítása különféle mértékek szerint. Az agy nagyobb területei között már ismertek a kapcsolatok, de a kisebb egységek közöttiek még nem. Az extracelluláris potenciál Az idegsejtek rendkívül változatos alakban jelennek meg, de alapvet en sejttestb l és az abból kiinduló nyúlványokból, a dendritekb l illetve axonokból állnak.a bemeneti jelek összegy jtésére szolgál a dendritfa, melyen akár mikrométerenként 2 szinaptikus bemenet is lehet. A 10-50 mikrométeres szóma segítségével az axon iniciális szegmentumon kialakult jel pedig az axonon terjed az axon terminálisig, ahol az idegsejttel szinaptikus kapcsolatban álló többi idegsejtre továbbítódik a jel neurotranszmitterek segítségével. Ezen folyamatok részletesebb megértéséhez szükséges az idegsejtben zajló elektromos jelenségek tárgyalása. Nyugalmi állapotban az idegsejt belseje és a sejten kívüli tér között körülbelül -70 mv feszültség mérhet (nyugalmi membránpotenciál), melyet a membrán két oldalán eltér koncentrációban jelenlév ionok okoznak (Na +, K +, Cl, Ca 2+ ) Az extracelulláris potenciál az idegsejtek membránjain keresztül folyó transzmembrán és a membránok kapacitásából adódó kapacitív áramok ha tá sá ból adódik. Ezen áramok több jelenséghez is köthet ek [2] legfontosabb a szinaptikus aktivitás, de emellett a gyors akciós potenciálok, kálcium tüskék, bels áramok és rezonanciák, tüskék utáni hiperpolarizáció, réskapcsolatok és neuron-glia kölcsönhatások, ephaptikus hatás is hozzájárulnak. Az extracelluláris potenciálok vizsgálatára a leggyakrabban használt módszerek [2]: elektroencefalográa (EEG): a fejre helyezett elektródák segítségével az EP-k egy térben és id ben simított változata mérhet, id és térbeli felbontása gyenge. magnetoencelográa (MEG): ugyancsak nem invazív eljárás, az idegse- 2
jtek áramai által keltett mágneses mez ket méri 1 ms-os id beli és 2-3 mm-es térbeli pontossággal elektrokortikográa (ECoG) az EEG-hez hasonló eljárás, de itt az elektródákat közvetlenül az agy felszínére helyezik, így jobb felbontású, a koponya torzításaitól mentes adatok nyerhet ek az LFP mérésére alkalmas eszközök általában üveg vagy fém elektródák, melyek segítségével az agy mélyebb területei is vizsgálhatóak akár 40 khz-es mintavételezési frekvenciával és pár 10 mikrométeres térbeli felbontással feszültségfügg festékes képalkotás: membránhoz kötött feszültségre érzékeny festékek optikai meggyelésével közvetlenül lehet ség nyílik a lokalizált membránfeszültségek vizsgálatára, hátránya pl. az alacsony jel/zaj arány Multielektródák Több elektródát tartalmazó mérési eszköz, mely változatos geometriájú, anyagú lehet a különböz kísérleti igényeknek megfelel en: tetródok, drótos sztereotródok, mikro-drótos kötegek. Ezek hátránya a nehéz behelyezés, az alacsony térbeli felbontás és a rossz reprodukálhatóság. A jobb térbeli felbontás érdekében elkezd dött a többcsatornás mikroelektróda rendszerek gyártása, melyek közül a gyárilag tömegesen gyártható, nagyon nagy precizitással gyártható szilikon elektródák kiemelkednek.[3]. Az adat Mivel vizsgálódásaim egyik része alapvet en multielektródával mért extracelluláris potenciálok feldolgozására és ezek felhasználásával egyes idegsejtekhez köt d jelek feltérképezésére összpontosulnak, a következ jelfeldolgozási lépések szükségesek [6]: sz rés, jeldetektálás, klaszterezés. Természetesen léteznek különféle szoftverek ezen lépések megvalósítására, pl.: SpikeO- Matic, Wave Clus, Klustakwick, Neuroscope. 3
Nyitott kérdések scsd Áramforrás s r ségek meghatározása az extracelluláris potenciálból A piramissejtek a neocortexben rendezetten, az agykéreg felszínére me r le ge sen, egymással párhuzamosa párhuzamosan elhelyezked, hosszúkás dendritfákkal rendelkez idegsejtek. Idegsejtek csoportjainak elektromos jelenségeinek vizsgálatára egy bevett módszer a sejtek közé szúrt több csatornás elektródákkal történ mérés. A mért potenciál értékeket általában 2 tartományban vizsgálják: az alacsony frekvenciás komponens (LFP: Local Field Potential) az idegsejtek szinaptikus áramainak hatására alakul ki, a magas frekvenciás tartományban pedig az egyes idegsejtek akciós potenciáljainak lenyomata. Ezek nem függetlenek, a szinaptikus áramok egy sejtet tüzelésre (akciós potenciál kialakítására) késztethetnek, mely hatására újabb szinaptikus áramok alakulnak ki. Az agy egyes területein, például a neocortexben és a hippocampusban, egy réteges szervez dés is meggyelhet, ahol a rétegek különböz agyte rü le tek r l kapnak bemenetet, ezért az LFP-b l a idegsejt populációk rétegenkénti szinaptikus áramai meghatározhatóak A hagyományos CSD (Current Source Density) eljárás [8] esetén lineáris, többcsatornás elektróda mérései alapján határozzák meg pár 10 µm-es nagyságú idegszövet átlagos transzmembrán árams r ségét (C). Az elektródát a kéregre mer legesen (z irány) szúrják be, mert annak rétegeiben a változás kicsi, az elektródával párhuzamos irányban viszont nagy. Emiatt x-y sík irányában az extracelluláris potenciál (Φ) változását elhanyagolják, így a következ egyenlet alkalmazható: σ d2 Φ(z, t) = C(z, t), (1) dz 2 ahol d a mérési pontok közötti távolság, σ a közeg vezet képessége. Ez alapján az áramforráss r ségeket a j. elektróda magasságában z j a következ formulával közelíthetjük: C(z j ) = σ Φ(z j + h) 2Φ(z j ) Φ(z j h) h 2 (2) h az elektródák közti távolság [8]. Az inverz CSD (icsd) módszer [9] egy N paraméterrel leírható forrást tételez fel, az N pontban mért extracelluláris potenciálokból ez az N paraméter 4
(C i ) megbecsülhet. A két mennyiség közötti kapcsolatot egy F mátrix segítségével kifejezve a j. pontban mért potenciál: Φ i = N F ij C j (3) j=1 Az scsd módszer Az scsd [10] modell célja, hogy multielektródás extracelluláris mérések felhasználásával egyes idegsejtek áramforrásainak tér és id beli eloszlását határozza meg. Ez a módszer már nem csak a réteges szerkezetben elrendez d piramissejtekre koncentrál (lineáris szegmens modell), hanem más morfológiájú sejtekre (gömbszimmetrikus héjmodell) is, a cél egy általánosan használható modell megalkotása (általánosított gömbhéjmodell). Egyik f feladatom az utóbbi két modell fejlesztése és alkalmazása a mérési adatokra, valamint ezek kiértékeléséb l biológiailag releváns kérdések megválaszolása. Lineáris szegmens modell A sejtet n db egy vonalban, az elektródával párhuzamosan elhelyezked pontforrásként kezeljük, ezek áramforráss r sége meghatározható a sejt-e lek tróda távolság ismeretében, mely apriori tudás segítségével egy erre alkalmas mérték segítségével kiszámolható. Ez a modell hosszúkás dendritfákkal rendelkez s sejtek (pl. piramissejt) alkalmazható, bizonyos feltételek teljesülése esetén (2.ábra). Gömbszimmetrikus héjmodell Bizonyos idegsejtekre, azok dendritfáinak morfológiája miatt nem használható a lineáris szegmens modell, ezért bevezettünk egy másik megközelítést, melyben a sejtet koncentrikus gömbhéjak rendszerével modellezzük. Ez például a thalamusban a relé sejtek esetén azért egy jó megközelítés, mert a dendritfa a sejttest gömbszer en körülveszi, továbbá a sejttesthez közelebbi illetve távolabbi részekre különböz inputok jönnek [7]. Különböz megközelítéseket vizsgáltunk a koncentrikus gömbhéjak vastagságát illet en: a gömbhéjak vastagságát az elektródák elhelyezkedése szabja meg, minden egyes elektródához egy gömbhéj tartozik a gömbhéjak azonos vastagságúak 5
z y Cortical depth x A β d z y d x α xi xj Neuron as a linesource Linear multi electrode array B Tilting angle (α) and direction (β) 1. ábra. Az idegsejt és a multielektróda pozíciója ideális esetben (bal oldal), illetve mikor az az elektróda nem párhuzamos az idegsejttel (jobb oldal). A multielektródán a fehér foltok az elektródákat jelölik, az idegsejteken lév fekete foltok pedig a feltételezett pontforrást. 6
EC Potential Neuron Electrode Current Source Density 2. ábra. Lineáris multielektródás mérés sematikus ábrája. A 16 csatornán (100 µm-e elektródaközökkel) rögzített extracelluláris potenciálból (EC) a lineáris szegmens modell számolt az áramforráss r ség tér- és id beli eloszlását a színkódolt ábra mutatja. A meleg színek az idegsejtbe folyó áramot jelzik, a hideg színek pedig az ellentétes irányú áramot. Az EC-ket és az scsd-t mutató ábrán is függ leges tengely az elektróda pozícióját, a vízszintes tengely az id t jelzi. [1] 7
a gömbhéjak azonos térfogatúak Utóbbi két esetben a gömbhéjakhoz tartozó potenciálokat harmadrend spline interpolációval határoztuk meg, melyekb l az adott héjakhoz rendelhet áramforrások az scsd módszerrel már kiszámíthatóak (3.ábra). Általánosított gömbhéjmodell Az el z két modell er s szimmetriafeltevéseinek enyhítését célzó modell a Legendre-polinomok segítségével felírható forrásokat tesz fel és ezek terét a gömbi multipól sorfejtéssel határozza meg. A modellben a 0. és az 1. rend gyelembevételével a gömbszimmetrikus tag mellet már egy aszimmetriát bevezet tag is szerepel. Agyi kapcsolatok elemzése Az agy összekötöttsége több szinten értelmezhet : Beszélhetünk az idegsejtek (mikroskála), idegsejtcsoportok (mezoskála), illetve agyterületek közti (makroskála) kapcsolatokról. Az anatómia kapcsolatok tanulmányozása már az el z század elején felkeltette a tudósok (Cajal, Brodmann) érdekl dését Ezeket a kapcsolatokat értelmezhetjük ziológiai oldalukról és statisztikai megfontontolások segítségével is. Ez utóbbi szemszögb l vizsgálva számos mennyiséget használhatunk az id sorok közötti összefüggések felfedezésére [11]: koherencia kölcsönös információ entrópiák spike-triggerd szórás Párhuzamosan több mikroelektródarendszerrel történ mérés esetén, mint a jelen esetben is, adott a lehet ség a elektródák segítségével mért id sorok közti összefüggések vizsgálatára makro- és mezoskálán. Az egymáshoz közeli (els illetve másodszomszédok, a kontaktpontokhoz képesti távolságot gyelembevéve) alapvet en korrelálnak, mivel pl. az egyikhez közelebbi sejttest idegsejt jeleit a másik is látja, csak eltér amplitúdóval (4.ábra). Az agyi kapcsolatok elemzése alapvet információkat hordoz a funkcionalitás megértésében minden szinten. Míg a makroskálás kapcsolatok már ismertek (pl.:[5, 4]), a mezoskálás összekötettések felderítetlenül maradtak megfelel technikai eszközök hiányában. Célom mikorelektródás mérések segítségével 8
3. ábra. Az ábra egy gömbszer, talamikus idegsejthez tartozó EC-t és áramforráss r ségeket mutatja be különböz modellek használata esetén 4 ms-os id ablakban. Az els részáblán azon csatorna és két szomszédja látszik, melyen legnagyobb a mért jel, azaz az akciós potenciál "lenyomata", a második ábra az EC-k tér- és id beli eloszlását mutatja. A fels sor jobboldali ábráján a standard szórás látszik. A középs sor ábrái a lineáris szegmens modellel számolt CSD mutatja, az baloldali alsó ábra a gömhéjmodell alkalmazásával készült, a középs pedig a hagyományos CSD-vel. A különböz modellek által becsült áramforráseloszlások nem teljesen egyeznek meg, de mindegyiken felfedezhet a dendritkus terjedés az akciós potenciál kiváltódása el tt és után is 9
bizonyos agyterületeken belüli kapcsolatok feltérképezése, funkionális ér tel me zé se és ezen ismeret alkalmazása. Az in vivo elektródás méréseknél az elektróda pozíciójának pontos helye az agyi struktúrákhoz képest sokszor bizonytalan, hiszen a pozícionálás agyatlaszok segítségével történik, ám a különböz egyedek némileg eltérnek egymástól. A koherenciamátrix elemzésével összefügg egységeket találhatunk egyes területeken belül is, melyek összevetése az anatómiai atlaszokban találtakkal segíthet egy olyan eljárás kifejlesztésében, mely már a potenciálok rögzítése közben képes lenne az elektróda helyzetének beazonosítására. Célkit zések Doktoranduszi kutató munkám témája tehát alapvet en a agyi mikroelektródás mérések kiértéklése. Eddig f ként az scsd modell fejlesztésével foglalkoztam, mely egyes idegsejtek átamforráss r ség eloszlásának meghatározására szolgál. Vizsgálódásaim másik iránya pedig a mezoszkopikus kapcsolatrendszerek felderítését és annak alkalmazását az elektróda pozíciónálásban t zi ki célul a mérések és anatómia ismeretek összehasinlátását alapul véve. 10
4. ábra. Az s1 (1-16.csatorna), v1 (17-32.csatorna) és thalamikus (32-65.csatorna) elektródák koherencia mátrixa, a fekete vonalak agyterületek határát jelzik. Jól meggyelhet en az egy-egy multielektródával rögzített jelek közti koherencia nagyobb, az ezek közti koherenciában struktúrák ismerhet ek fel. 11
Irodalomjegyzék [1] Micro-electric imaging: Inverse solution for localization of single neuron currents based on extracellular potential measurements. Procedia Computer Science, 7(0):348 350, 2011. [2] György Buzsaki, Anastassiou Costas A., and Christof Koch. The origin of extracellular elds and currents eeg, ecog, lfp and spikes. Nat Rev Neurosci, 2012. [3] Richárd Fiáth, László Grand, Bálint Kerekes, Anita Pongrácz, Éva Vázsonyi, Gergely Márton, Gábor Battistig, and István Ulbert. A novel multisite silicon probe for laminar neural recordings. Procedia Computer Science, 7(0):310 311, 2011. [4] Edelman GM Izhikevich, EM. Large-scale model of mammalian thalamocortical systems. PNAS, 105:35933598, 2008. [5] Joshua R. Sanes Je W. Lichtman, Jean Livet. A technicolour approach to the connectome. Nature Reviews Neuroscience, 9:417422, 2008. [6] M. S. Lewicki. A review of methods for spike sorting: the detection and classication of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems, 9(4):5378, 1998. [7] Acsády László. A talamokortikális rendszer és a tudat. 2007. [8] Carla Nicholson and James A. Freeman. Theory of current source density analysis and determination of conductivity tensor for anuran crebellum. J. Neurophysiol., 38(2):356368, march,. [9] Ulbert I Dale AM Einevoll GT. Pettersen KH, Devor A. Current-source density estimation based on inversion of electrostatic forward solution: eects of nite extent of neuronal activity and conductivity discontinuities. J Neurosci Methods., 2006. 12
[10] Zoltan Somogyvari, Laszlo Zalanyi, Istvan Ulbert, and Peter Erdi. Model-based source localization of extracellular action potentials. J. Neurosci. Meth., 147(2):126137, 2005. [11] O. Sporns. Brain connectivity. Scholarpedia, 2(10):4695, 2007. 13