1 Kezdetek 2 Tömegspektrometria J. J. Thomson, 191, 1912 Kisülési csőbe különböző gázokat vezetett 2 Ne/ 22 Ne Izotópok létezésének bizonyítéka SzabóPál MTA Természettudományi Kutatóközpont (szabo.pal@ttk.mta.hu) Kezdetek 3 Az MS felépítése 4 F. W. Aston, 1919 Első spektrográf Ne, Cl, Hg, N izotópok Adatgyűjtő rendszer Mintabevitel Ionforrás Analizátor Vákuumrendszer Detektor Interface Ionforrás 5 Elektron ionizáci ció 6 Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: elektron ionizáció (EI) kémiai ionizáció (CI) gyors atom bombázás (FAB) lézerdeszorpció (LDI, MALDI) ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) légköri nyomású photoionozáció (APPI) deszorpciós electrospray (DESI) mágnes filament (fűtőszál) Filament (fűtőszál): W, Re T fil = 2 C M repeller trap mágnes Kamra: p= 1-5 Torr T= 1-2 C Repeller: U= néhány V 1
Elektronionizáció 7 Az elektronenergia hatása 8 Vizsgálhatóság feltétele: illékonyság Tömeghatár: 1 Dalton (Da) Kationok, gyökkationokképződnek Fragmentáció: gyakori és jellegzetes (spektrumkönyvtár) Sok esetben nincs molekulaion Az elektron energiának a szerepe Kémiai ionizáci ció 9 Kémiai ionizáci ció 1 CI forrás: az EI forrásnál zártabb Ion-molekula reakciók: Reagens gáz: metán, izobután, ammónia Nyomás:.1 Torr (EI 1-6 Torr) Minta parciális nyomása: 1-4 Torr Lágy ionizáció Fragmentáció: elhanyagolható Kvázi-molekulaion Metán: CH 4 e - CH 4 2 e - CH 4 CH 4 CH 3 CH 5 Izobután: CH 3 CH 4 C 2 H 5 H 2 CH 5 M CH 4 [MH] C 2 H 5 M [MC 2 H 5 ] (CH 3 ) 3 CH C 3 H 7 CH 3 C 3 H 7 C 4 H 1 C 4 H 9 C 3 H 8 C 4 H 9 M [MH] C 4 H 8 C 4 H 9 M [M C 4 H 9 ] CI reagens gázokg 11 Tipikus EI spektrum 12 Metán: szerves vegyületekre általánosan jó [MH] [MC 2 H 5 ] ionokat ad az adduktok intenzitása kicsi [M-H] M Izobután: Ammónia: enyhe fragmentáció figyelhető meg [MH] [MC 4 H 9 ] ionokat ad az adduktok intenzitása nagy nem olyan univerzális, mint a metán fragmentációnincs bázikus molekuláknál [MH] iont ad poláris vegyületeknél [MNH 4 ] iont ad egyéb vegyületekre nem jó 2
Tipikus CI I spektrum 13 Gyors atom bombázás 14 [MH] [2MH] Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe Mátrix: glicerin, NBA Tömeghatár: néhány ezer Da Fragmentáció: kismértékű Gyors atom/ion: Xe, Cs Kvázi-molekulaion: [MH], [MNa], Gyors atom bomb atom bombázás 15 zerdeszorpció 16 Lézerdeszorpci Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok: 4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA) 2,5-dihidroxi benzoesav (DHB) Mátrix-minta kristályok a targeten 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA) 17 18 Mintatartó pződés Mintatart MALDI ionképz Mintatartó 2 kv hn AH Rács Laser Rács 1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra. 2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba. 3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. 4. Repülési idő (TF) tömegspektrometriás detektálás. 3
A MALDI előnyei 19 Tipikus MALDI spektrum 2 Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 3 kda) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors % Intensity 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 2467 [M3H] 3 49813 [M2H] 2 74667 Voyager Spec #1=>NR(2.)=>RSM1[BP = 14989.4, 3562] [MH] 149131 [2M3H] 3 99694 1 pmol lineáris mód 25 kv gyors. fesz [2MH] 298434 3562.3 2 8 14 2 26 32 Mass (m/z) Ionizáci ció légköri nyomáson 21 Electrospray ionizáci ció 22 Poláros ESI IonSpray: Pneumatikusan segített electrospray Nagyfeszültség (5-6 kv) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!). Polaritás Apoláros APPI APCI 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 Ionforrások koncentrációtartományai: TurboV (2µL/min 3mL/min) Turbo-IonSpray (2µL/min 1mL/min) IonSpray (2 to 2µL/min) Micro-IonSpray (5 to 1 nl/min) NanoSpray (~1µL-5µl in tip, 2-5 nl/min) Kis áramlás fi nagyobb érzékenység! IonSpray TM 23 TurboIonSpray TM 24 Áramlási tartomány: 2 2 µ L/min Áramlási tartomány: 2 1 µ L/min 4
Turbo V TM 25 Microelectrospray 26 Áramlási tartomány: 2 3 µl/min Áramlási tartomány: 5 1 nl/min Nanospray 27 Nanospray 28 Áramlási tartomány: 2 5 nl/min Microtechnikák másként 29 3 nt pződés Sprayképz légköri nyomás 1. töltött cseppek képződése 3. Coulomb robbanás vákuum 2. oldószereltávolítás 5
Többszörösen sen töltt ltött tt ionok 31 számítás 32 minden egyes csúcsra igaz: Lysozyme MW = 14,35.14 m/z = (MW nh) n m/z = tömeg/töltés értékek a spektrumban MW = a fehérje móltömege n = töltésszám (egész) H = a hidrogén ion tömege(1.8 Da) számítás 33 Rekonstruált tömegspektrumt 34 A töltés és a móltömeg is ismeretlenek Két szomszédos csúcs töltöttségi foka közti különbség:1 1435.7 1431.6 = (MW nh) n 131.4 = (MW [n1]h) [n1] 2 ismeretlen két egyenlet először n-re oldjuk meg n = 13.4/13.2 = 1 majd behelyettesítve a móltömeg: MW = 14316 - (1x1.8) = 1435.9 14,35.14 1442.8 Eluensmódos dosítók 35 Sóhatás 36 Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp 3 N-tartalmú) protonálódását. Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat..1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-1 mm koncentrációban. Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!! 6
APCI 37 Ionképz pzés s mechanizmusa 38 Az APCI nagy áramlást is (.1-2. ml/min.) tolerál Poláros, termikusan stabil vegyületek vizsgálatára Molekulatömeg MW < 1 Da Intenzív fűtés hatására az oldószer elpárolog Porlasztó- és segédgáz alkalmazása szükséges Korona kisülés hatására következik be az ionizáció primer folyamat: N 2 e - N 2 2e - szekunder folyamat:n 2 H 2 H 2 N 2 H 2 H 2 H 3 H adduktképződés: H 3 M [MH] H 2 APCI ionképz pződés 39 Kombinált forrás 4 légköri nyomás vákuum 1. 1. oldószermolekulák ionizációja Forrásház ESI probe 2. adduktképződés, klaszterképződés APCI probe Légköri nyomású fotoionizáci ció 41 Photospray forrás 42 Eluens áramlási sebessége:1µl-2ml/min Fordított fázis MeH/víz előnyös ACN csökkenti az érzékenységet Normál fázis Izooktán/Izopropanol/Diklórmetán Dopant: Toluol (HPLC grade) 5-15% külön pumpával Hőmérséklet: 3-45 C (APCI) 7
XIC of M RM (4 pairs): 28 9.3/97.2 amu from Sample 3 (SM 4 1-1p g/ul 1 ul inj NP APCI) of SM4 Q1... Max. 2.e4 cp s. 5. 1.e 5 9.5e 4 9.e 4 8.5e 4 8.e 4 7.5e 4 7.e 4 6.5e 4 6.e 4 5.5e 4 5.e 4 4.5e 4 4.e 4 3.5e 4 3.e 4 2.5e 4 2.e 4 1.5e 4 1.e 4 XIC of M RM (4 pairs): 27 9.5/133. am u from Sample 1 ( SM4 1-1 pg/ul 1u L injnp PI) of SM4 Q1 M... Max. 2.e4 cp s. 9. 8. 7. 6. 5. 4. 3. 2. 1. 2.e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.e4....5 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 Tim e, min 1 2 3 4 5 6 7 8 Tim e, min PSI alkalmazás 43 Deszorpciós Electrospray 44 Testosterone PhotoSpray Source CH 3 H CH3 H APCI H H Ethynyl Estradiol PhotoSpray Source H CH 3 H CH H H H APCI DESI alkalmazások sok 45 volítás 46 ldószerelt szereltávol Nitrogén gázfüggöny Gázfügg ggöny interface 47 48 interface Robusztusság Robusztuss légköri nyomás CUR DP SK vákuum Q 2.E5 1.8E5 1.6E5 Methomyl3.1% Carbaryl 3.3% Aldicarbsulfone 3.6% Aldicarb 3.6% 1.4E5 FP Response 1.2E5 1.E5 8.E4 6.E4 4.E4 N 2 2.E4.E 2 4 6 8 1 12 Injection Number Szpájkolt talajminta (5ng/mL); 12 injektálás(3.5nap) 8
Karbantartás 49 volítás 5 Karbantart ldószerelt szereltávol Fűtött kapilláris HPLC eluens Párologtató gáz Spray Fűtőegység Szárítógáz Fűtött kapilláris Analizátorok 51 Mágneses analizátor 52 Cél: Töltött részecskék szétválasztása Analizátor típusok: mágnes (B) elektrosztatikus (ESA) kvadrupol (Q) ioncsapda (trap) repülési idő (TF) lineáris ioncsapda (LIT) Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia MS (FT-ICR) rbitrap Lorentz erő: 1. ½ mv2 = eu 2. veb =mv 2 /R v= erb/m 1. 2. Pásztázás (scan) : mágnesáram gyorsító feszültség m e = B2 R 2 2U Tömegspektrometria alapegyenlete Mágneses analizátor 53 54 tor tor Elektrosztatikus analizátor Szektormező 1. ½ mv2 = eu 2. mv 2 /R = ee ϕ 1. 2. R = 2U / E Független a tömegtt megtől!!! - 9
ESA 55 kuszálás 56 ESA Kettős s fókuszf mágnes Z-rés ESA forrásrés kollektorrés ionforrás detektor Kettős s fókuszf kuszálás 57 Felbontás 58 Cél: a mágnes és az ESA kölcsönös hiányosságainak kiküszöbölése m Felbontás: R = m A forrásból kilépő ionok sebesség- és irányszoródást szenvednek Mágnes: impulzus szerint szeparál. Azonos tömeg, különböző energia kiszélesedik a csúcs Rések: érzékenység csökken Nagyfelbontás!! 1 % völgy m 1 % Dm Full Width at Half Mass Dm (5% magasságnál) m Kvadrupol analizátor 59 Kvadrupol analizátor 6 Felbontás: egységnyi A rendszer méréshatára: néhány ezer DC = - ±5 V RF = 6 V 1. 2. 3. 4. 5. 6. Egy Electrical Ion RF-voltage Movement... adott enters AC repulsion the of / changes of DC quadrupolesystem the érték ion and polarity into esetében attraction, direction and csak electrical respectively, of of egy the nearest repulsion ion between nearest and quadrupolerod számára attraction, quadrupolerods stabil respectively, az with ionpálya. the with opposite and between the ionopposite charge quadrupole charge rods and ion 1
Kvadrupol analizátor tor 61 tor 62 Ioncsapda analizátor belépő ionok belépő elektróda gyűrűelektróda kilépő elektróda kilépő ionok Előny: érzékenység, kis méret, MS n Ioncsapda analizátor 63 RF pásztázás Q TRAP Radiális csapdázás kilépő potenciálgát EXB változtatása 64 Ionok mozgása: az elektródákra kapcsolt egyenilletve váltófeszültség hatására Az összes ion egyszerre tartózkodik a csapdában Kis méret, könnyű kezelhetőség MS n funkció (n=1, elméletileg!) Q2 Axiális csapdázás Axiális csapdázás Segéd RF pásztázás. Radiális csapdázás Kilépő oldali háló Repülési idő analizátor 65 Repülési idő analizátor 66 Konstans potenciál (U) m 1, m 2 D m 1 m 2 Idő (ns) Detektor m 1 >m 2 azonos töltés esetén ½ mv 2 = eu m 1 v 1 v= (2eU/m) 1/2 m 2 v 2 t = D/v = (D 2 m/2eu) 1/2 m= 2U D 2 t 2 Az ionok energiaszórása miatt a felbontás kicsi Megoldás: iontükör (reflektor) késleltetett ionkieresztés (delayed extraction) 11
A felbontást befolyásol soló tényezők 67 Felbontást növeln velő megoldások 68 Forrás Eltérő helyen képződő ionok Detektor Az ionképződés helyének szórása Iontükör (Reflectron) R= m/dm=t/2dt Sebességszórás Dt t Sebességeloszlás (energiaszórás) Delayed extraction (MALDI) orthogonal TF Dt Iontükör 69 Iontükör r a valóságban 7 Iontükör detektor U gyorsító deflektor U= forrás U tükör Delayed Extraction (DE) 71 A DE hatása a felbontásra 72 2 kv A potenciálgradiens a lassabb ionokat jobban gyorsítja delayed extraction R=1,1 Linear mode continuous extraction R=125 delayed extraction R=11, Reflector mode continuous extraction R=65 2 kv A detektorig a lassabb ion utóléri a gyorsabbat 16 18 11 112 114 m/z Minta: DNS 36-mer 613 614 615 616 617 m/z Minta: DNS 2-mer 12
Felbontás 73 FT-ICR MS 74 Minimálisan szükséges felbontás Ar 39.96239 C 3 H 4 4.313 N 2 28.615 C 2 H 4 28.313 C 27.99491 N 2 28.615 13 CC 6 H 7 92.5813 C 7 H 8 92.626 58 11 249 26 A cellába bejuttatott és a nagy mágneses térerő hatására körpályára kényszerített ionok által indukált áramot méri. óriási felbontás tág időskála (nem destruktív detektálás) Ionpály lyák k az orbitrapban orbitrapban 75 rbitrap 76 Speciális rbitrap Teljesítőképess pesség 77 Analizátorok felbontása 78 1,147 5 1,148 5 m/ m = 7, 1,149 Instrument performance for Bovine Insulin 1,434 4 4 m/ m = 45, 1,435 1,436 1,911 1,912 3 m/ m = 4, 1,913 3 1,914 szektor (E,B) nagy >1, kvadrupol (Q) egységnyi (kivétel!) ioncsapda (trap) nagy (de: tömegpontosság?) repülési idő (TF) nagy >1, lineáris ioncsapda (LIT) közepes <1, orbitrap nagy > 2, FT-ICR nagy!!! >1,, 1,2 1,4 1,6 1,8 m/z 13
frequency of occurrence Az FT-ICR felbontása 779.5187 11 779.697 779.79 R=1,4,!!! 79 Elegendő-e e egy egyszerű LC/MS? 2 15 Több száz vegyület rendelkezik 25 körüli móltömeggel. 8 779.7924 1 779.3482 779.4282 779.884 5 779.9759 2 4 6 8 1 molecular weight Szerkezeti informáci ció nyerése se 81 MSMS spektrumok 82 MSMS spektrumok Benzocaine Ethenzamide CH 3 NH 2 H 2N CH 3 Egyező összegképlet : C 9 H 11 N 2 Eltérő fragmensek Egyező tömeg : 165.19 dalton Egyező számú kettős kötés : 4 Tandem tömegspektrometriat 83 Triple quadrupol felépítése 84 Célok: szerkezeti információ nyerése érzékenység növelése szelektivitás növelése Q Q1 q2 Ütközési cella Q3 DF CEM Megvalósítás: szektor: kombináció (EBE, BEB) kvadrupol: QqQ ioncsapda: MS n TF: Post SourceDecay (PSD), TF/TF hibrid: BEqQ, Q-Trap, Q-TF, 14
Lehetséges scanfunkciók 85 Q-Trap 86 Product Ion Scan Precursor Ion Scan 3D Trap Érzékenység a teljes tömegtartományban Q TRAP TM MS 3 (vagy több) kiválaszt: anyaion pásztáz: fragmension Neutral Loss Scan pásztáz: Q1 és Q3 a semleges tömegével eltolva pásztáz: anyaion kiválaszt: fragmension Multiple Reaction Monitoring (MRM) kiválaszt: anyaion kiválaszt: fragmension QqQ MRM lehetőség Semlegesvesztés Precursor Scan Érzékenység a teljes tartományban MS 3 MRM lehetőség Semlegesvesztés Precursor Scan Ha akarom: hármas h kvadrupol......ha akarom ioncsapda rmas kvadrupol... 87 88 Megtartva minden hagyományos funkciót : Single MS scans (Q1 and Q3 scans) Product Ion Scan (MS2) Precursor Ion Scan (Prec) Neutral Loss Scan (NL) Multiple Reaction Monitoring scan (MRM) Új pásztázási módokkal : -Enhanced single MS scan (EMS) -Enhanced Resolution scan (ER) - Enhanced Product Ion scan (EPI) -Enhanced Multiply Charged scan (EMC) -Time Delayed Fragmentation scan (TDF) - MS/MS/MS scan (MS3) Megnövelt leányion pásztp 89 9 sztázás EPI EPI Product Ion Scan Ion accumulation Q Q1 Q2 Q3 Exit lens Enhanced Product Ion Scan Anyaion kiválasztás Fragmentáció N 2 CAD Gas 1. Anyaion kiválasztása. 2. Intenzív fragmentációa LINAC-ban. 3. Fragmensionok csapdázása Q3-ban 4. Mass scan. linear ion trap 3x1-5 Torr 15
Érzékenységnövekedés 91 Q-Trap 92 Hagyományos product ion scan 3% 3D Ion Trap EPI > 55x Q TRAP System MS1 (3D trap) (3D trap) 93 QTrap) 94 EMS (QTrap( EMS: 4.521 to 5.3 min from Sample 56 (797-47/5 EMS ujbol) of CPF.wiff (Turbo Spray), subtracted (3.346 to 4.231 min) Max. 1.e7 cps. 538.5 1.e7 547.4 9.5e6 9.e6 8.5e6 8.e6 7.5e6 7.e6 6.5e6 6.e6 5.5e6 5.e6 4.5e6 4.e6 3.5e6 3.e6 2.e6 1.e6 5.e5. 529.6 684.3 133.4 54.4 566.3 58.6 666.2 52.7 649.4 945.5 1115.5 1131.4 815.5 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 115 12 125 m/z, Da 193.4 95 96 MS2 547 MS3 547/538 MS2 547 MS3 547/538 16
MS4 547/538/529 97 MS5 547/538/529/392 98 MS4 547/538/529 MS5 547/538/529/392 EPI 547 99 EPI 547 1 EPI (547.38) Charge (2) CE (35) CES (15) FT (25): Exp 3, 4.871 to 4.945 min from Sample 2 (9217 797-47/5 IDA) of CPF.wiff (Turbo Spray) Max. 1.2e5 cps. EPI (547.5) CE (5):.867 to.914 min from Sample 22 (9219 18 EPI 547) of CPF.wiff (Turbo Spray) Max. 1.3e7 cps. 1.2e5 538.3 1.15e5 3.4e6 1.1e5 1.5e5 1.e5 9.5e4 9.e4 8.5e4 CE:35eV 3.2e6 185.2 417.3 3.e6 435.3 2.8e6 167.2 392.4 287.3 2.6e6 35.2 CE:5eV 8.e4 2.4e6 7.5e4 2.2e6 7.e4 6.5e4 6.e4 5.5e4 5.e4 392.4 4.5e4 547.2 4.e4 287.4 3.5e4 417.4 3.e4 529.4 271.2 2.5e4 35.3 684.2 261.4 435.4 2.e4 666.1 1.5e4 213.4 256.6 5.2 52.4 565.2 63.1 277.3 389.3 1.e4 322.2 399.2 945.5 29.5 232.2 262.7 362.3 455.4 49.3 58.8 583.2 795.5 927.6 5. 334.4 42.2 594.4 777.5 815.5 867.8 133.3 115.4 2.e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.e6 8.e5 6.e5 4.e5 2.e5 154.2 215.3 238.4 5.3 536.4 271.3 518.3 256.4 261.2 63.4 547.4 244.1 226.2 288.1 299.3 565.4 194.3 46.3 648.5 232.3 29.3 277.4 529.4 4.2 282.3 252.2 322.4 171.2 23.3 362.4 548.3 384.4 474.4482.3 147.2 381.1 612.4 795.4 175.1 233.3 351.5 423.2 583.4 777.3 456.4 514.3 641.4 655.3 134.3 39.1 575.6 741.4 867.4 928.7 945.7 116.6 339.3 849.5 666.4 684.3. 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 m/z, Da. 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 1 15 11 m/z, Da Csatolt technikák 11 GC vs. HPLC (MS) 12 A mintabevitel speciális módja, amikor folyamatosan jut be a minta a készülékbe. GC-MS HPLC-MS CE-MS nagy GC kicsi apoláros HPLC Polaritás poláros GC: gáz/gőz minta, hőterhelés HPLC: folyadék/oldat minta LC/MS széleskörű alkalmazás, móltömeg információ Chemical Abstracts entry compounds Total ; 9,, GC applicable 13, (1.4%) target compounds for HPLC 8,87, (98.6%) 17
Abundance Time-> 28 27 26 25 24 23 22 21 2 19 18 17 16 15 14 13 12 11 1 9 8 7 6 5 4 3 TIC: VGL-1.D Fibronil und Metaboliten je 2 ng/ml 11.12.13.14.15.16.17.18.19.2.21.22.23.24. 4 Az LC-MS/MS rendszerek érzékenysége GC-ECD 2 1 3 4 4 GC-EI-MSD 35 (SIM-mód) 3 13 GC-MS 14 2 1 2 ng/ml =.8 ppb* 12 14 16 18 2 22 24 26 1Fipronil 2Fipronil-sulfide 3Fipronil-sulfone 4Fipronil-desulfinyl 4 2 GC-NCI-MSD (SIM-mód) 1 3 2 ng/ml =.8 ppb* min * 5g mintatömegre vonatkoztatva 3 25 2 15 1 Háttér: az egyre szigorodó EU normák következtében a bébiételekben 28 peszticid szermaradvány maximális értéke 1 ppb alá került (pl: fipronil és metabolitja 4 ppb) 4 1.11.12.13.14.15.16.17.18.19. 382 1.4e5 35 1.2e5 3 1.e5 25 8.e4 2 6.e4 15 4.e4 1 2.e4 5. 3 1 24 24 2 1 2 ng/ml =.8 ppb* LC-ESI-MS/MS (negatívmrm (negative mode) mód).2 5 pg/ml ng/ml = =.8 2 ppt* ppb* = 2 ng/kg!! 4.6 4.6 4.8 4.8 5. 5. 5.2 5.2 5.4 5.4 5.6 5.6 5.8 5.8 6. 6. Time, Time, min min Illékony minták jöhetnek szóba: EI/CI ionizáció Az analizátor sebességének szerepe szektor: lassú trap és quad közepes TF gyors A vivőgáz és a vákuumrendszer egymással ellentétes töltött kolonna: nagy gázáram szeparátor kapilláris kolonna: kis gázáram direktbe A kapott spektrumok könyvtárból jól kereshetők GC-MS szeparátorok 15 GC-MS tanácsok 16 Membránszeparátor Lassú a válasz membrán A komponensek kis része jut be a készülékbe A membrán szelektivitása függ a polaritástól és a móltömegtől Jetszeparátor vákuumszivattyú Megbízható Fokozottan ügyeljünk a vivőgáz tisztaságára A kolonna kellően beérjen az ionforrásba A GC és az MS közti átmenet transfer line fűtött legyen HPLC-MS 17 HPLC 18 Egyre kisebb a megkötés a vizsgálhatóság szempontjából Az eluens és a vákuumrendszer méginkább ellenségei egymásnak A mai ionforrások (API) egyben az interface szerepét is betöltik Az első interface egyike: moving belt Különböző oszlopátmérőkhöz tartozó áramlás elnevezés Hagyományos mikro kapilláris nano ID 4.6 mm 3.2 mm 1 mm 8 µm 5 µm 3 µm 18 µm 1 µm 75 µm 5 µm áramlás 1-2 ml/min 1 µl/min 2 µl/min 1 µl/min 4 µl/min 2 µl/min 3 nl/min 18 nl/min 8 nl/min Ionforrás TurboIonspray Ionspray Microelectrospray Nanospray A forrásoknak széles áramlási tartományban kell dolgozni 18
Kolonnaátm tmérő vs. érzékenység mau 2 1 c kapilláris = c normál ( ) 2 d normál d kapilláris 1. mm id 19 CE rendszer 11 mau 2 2 pmolmioglobin emésztmény.8 mm id 1 Absorption 26 nm mau 2 1 mau.3 mm id.18 mm id 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 Time (min) Kapilláris elektroforézis 111 CE-MS illesztés 112 Előnyök: Gyors (1-3 perc) Kis mintamennyiség (1-5 nl) Nagy tányérszám Számos mód a szelektivitás fokozására Vizes/nemvizes közeg egyaránt Egyszerű Nehézségek: Elektromos kapcsolat megvalósítása egy pufferedénnyel A stabil spray-hez szükséges folyadékáram biztosítása Megfelelő puffer kiválasztása, mely nem növeli az ionáramot (.2 % hangyasav, 15 mm ammóniumacetát) Megfelelő mennyiségű minta injektálása Az MS és az elválasztás sebességének összehangolása CE-MS interface 113 114 interface ICP-MS 19
ICP-MS Felépítés 115 PE NexIN 3 ICP-MS 116 Ionforrás: ICP plazma Ionoptika Reakciócella Analizátor: Q, szektor Detektor Kvadrupol Univerzális cella Q deflektor Detektor ICP sugárforr rforrás 117 Triple cone interface 118 Minta aeroszol Kvarc cső Segédplazma gázok Tekercs Mágneses tér Plazma Lépcsőzetes nyomásesés Kisebb szóródás Kevesebb kondenzálódás Nagyvákuumtéren kívül van, tisztításkor nem kell fellevegőztetni Quadrupole ion deflector 119 Interferencia csökkent kkentése 12 Kis kvadrupol 9 fokos eltérítés töltött részecskék esetén ütközési cella (nem reaktív gáz) kinetikus energia és szórásának csökkentése, valamint ütközési disszociáció A semlegesek a vákuumtérbe kerülnek reakciócella (reaktív gáz) Elektron- vagy protontranszfer, oxidáció Ar NH 3 =>Ar NH 3 dinamikus reakciócella (reaktív és nem reaktív) nagy sávszélességű kvadrupol csak adott m/z tartományú molekulák vesznek részt a reakcióban 2
Univerzális cella technológia 121 Analizátor I. 122 1. Standard mód: ha nem áll fenn interferencia veszélye, ez biztosítja a legnagyobb érzékenységet. 2. Ütközéses mód: Kinetikus Energia Diszkrimináció elvén. 3. Reakciós mód pásztázó kvadrupollal: reagens gázok segítségével a nemkívánatos interferenciákat megszűnteti. Pásztázó kvadrupol 5 amu/sec pásztázási sebességgel peak hopping módban páratlan gyorsaság. Analizátor II. 123 LR vs HR ICP MS 124 Nagyfelbontású szektorok. 56 Fe: Környezeti mintákban kis HR-ICPMS mérések = koncentrációban megkülönböztethető a 56 Fe az Ar-tól előfordul. FNTS!: az elemek többsége egyszerű A 56 Fe és az Ar ( 4 Ar 16 )azonos kvadrupollal is megkülönböztethető tömegű Quadrupolekészülék =INTERFERENCIA! Detektor 125 Kimutatási határok 126 Szimultán analóg-digitális detektornak köszönhetően 9 nagyságrend dinamikus tartomány is elérhető. 21
Speciáci ciós vizsgálatok 127 128 GC-vel, HPLC-vel összekapcsolva módosulatanalitikai vizsgálatok elvégzése lehetséges. Izotópar parány-mérés Stabil izotóparány mérése se 129 13 A periódusos rendszer Szén-12 Szén-13 Szén-14 1 H 2 H 12 C 13 C 14 N 15 N 32 S 33 S (6P 6N) (6P 7N) (6P 8N) 34 S 36 S Stabil izotópok Radioaktív izotópok Előfordul fordulások 131 132 sok SIRMS SIRMS Element Hydrogen Carbon Nitrogen xygen Sulfur Isotopes 1 H, 2 H 12 C, 13 C 14 N, 15 N 16, 17, 18 32 S, 33 S, 34 S, 36 S Abundance 1 H = 99.985% 2 H =.15% 12 C = 98.89% 13 C = 1.11% 14 N = 99.633% 15 N =.366% 16 = 99.759% 17 =.37% 18 =.24% 32 S = 95.% 33 S =.76% 34 S = 4.22% 36 S =.14% 22
Izotópar parány mérésem 133 IRMS alkalmazások 134 13 C/ 12 C =.11225 13 C/ 12 C =.1171 13 C/ 12 C =.1918 Korás Eredetvizsgálat (borok, kábítószerek stb) Helicobacter Doppinganalitika Az eredményeket átszámolják delta (d) értékké: 13 C/ 12 C sample - 13 C/ 12 C standard d 13 C sample = x 1 13 C/ 12 C standard 135 Izotópok fajtái 136 Mérési technikák A: csak egy izotópja van F, P, I A1: két izotópja van, mindkettő intenzitása számottevő, tömegkülönbség 1 H, C, N A2: két izotópja van, mindkettő intenzitása számottevő, tömegkülönbség 2 Cl, Br, S, megadása 137 megadása 138 C 1 C 6 23
megadása 139 megadása 14 C 1 monoizotópos tömeg 556.277 nominál tömeg 556 felbontás 25 1 átlagos (kémiai) tömeg 556.64 Leu-enkefalin C 28 H 38 N 5 7 megadása 141 142 átlagos (kémiai) tömeg 8681.83 monoizotópos tömeg 8676.167 Protonált proinzulin C 381 H 586 N 17 114 S 6 rozása nominál tömeg 8672 1 8 felbontás 4.e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.e5 8.e4 6.e4 4.e4 2.e4. MH 123.4 124.4 Ionadduktok 22 17 38 MNH 4 122.5 1221.5 5 MNa 1225.3 1226.2 1227.1 1228.2 1229.3 123.2 MK 1241.3 1243.1 1244.2 1195 12 125 121 1215 122 1225 123 1235 124 1245 125 16 143 Ionadduktok,, tömegkt megkülönbségek APCI pos: H APCI neg: -H ESI pos: H, NH 4, Na, K (1, 18, 23, 39) ESI neg: -H, Cl, formiát, acetát, trifluoracetát (-1, 35, 45, 59, 113) Leggyakoribb tömegkülönbségek: 38, 22, 17, 5, 2 144 24
rozás I rozása I s I 145 146 Q1:.2 min (8 scans) from MZ-91 ujbol 58.9 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.e5 9.e4 ACN-ból 318H 319. 1.35e5 cps Ciklo(Gly-Gly-εLys)-(Gly) 4 -Choc M=596.3 Q1:.29 min (6 scans) from MZ-91 ujra HMR 96. 1.2e7 1.1e7 1.e7 9.e6 21.9 318Na 341.1 x15 DMF-ből 1.26e7 cps 8.e4 8.e6 7.e4 6.e4 15.1 2x318H 636.7 7.e6 6.e6 5.e4 4.e4 3.e4 2.e4 1.e4 18.1 263.2 391.3 447.1 52.3? 79.9 781.9 96.4 5.e6 4.e6 3.e6 2.e6 1.e6 2x318Na 659.4 118.5 596 2x596Na 1215.9 Na 52.5 846.6 937.5 1372.5 776.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 4 6 8 1 12 14 rozása II sa II 147 s II 148 rozás II Q1: 1.72 min (21 scans) from S.225 ESI pos/1, subtracted (scans 12 to 19) 297.1 3.5e6 Normál MS LMR? 337.3 3.78e6 cps Q1: 1.72 min (21 scans) from S.225 ESI pos/1, subtracted (scans 12 to 19) 297.1 3.5e6 337.3 3.78e6 cps Normál MS HMR 3.e6 3.e6 2.e6 2.e6! 325.3 325.3 611.5 1.e6 1.e6 571.6 55. 87.1 119.2 173.2 224.2 269.2 379.3 43.3 465.4 55. 173.2 224.2 43.3 651.7! 885.7 925.6 965.8 845.5 88.8 5 1 15 2 25 3 35 4 45 1 2 3 4 5 6 7 8 9 rozása II 149 15 sa II sa II rozása II Product (611):.44 min (7 scans) from S.1.57 ESI pos 611=> 297.2 337.2 14 13 274Na 314Na 1.45e4 cps MSMS Q1: 1.72 min (21 scans) from S.225 ESI pos/1, subtracted (scans 12 to 19) 297.1 274Na 3.5e6 314Na 337.3 3.78e6 cps Normál MS HMR 12 3.e6 11 1 9 611=274314Na 8 7 6 5 4 3 2 1 2.e6 1.e6 55. 173.2 224.2 325.3 43.3 274314Na 611.5 2x274Na 571.6 2x314Na 651.7 3x274Na 845.5 2x274314Na 2742x314Na 885.7 3x314Na 925.6 965.8 211.2 463.2 61.4 88.8 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 25
sa III 151 152 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 296Na 319.3 Product (68):.2 min (2 scans) from Bat22/I/fo/67=> 26 253.2 68=> 2.75e4 cps 2.e6 311.2 1.e6 297.1 333.1 3.3 325.3 341.2 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 3.5e6 3.e6 2.e6 1.e6 296H 29631H 2x296Na 67.6 615.4 61.3 31H 2x31H 621.4 637.6 29631Na 629.5 643.3 65 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65? 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 31H 311.2 296H 296.8 11. 1 2 3 4 5 6 sa III 153 154 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 296Na 319.3 Product (615):.28 min (3 scans) from Bat22/I/fo/615=> 35 296Na 319.2 615=> 3.64e4 cps 2.e6 311.2 1.e6 297.1 333.1 3.3 325.3 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4)? 3.5e6 637.6 3.e6 296H 31H 629.5 29631Na 341.2 3 25 2 15 1 2.e6 1.e6 61.3 621.4 29631H 2x296Na 2x31H 67.6 615.4 643.3 65 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 5 286.4 399.2 491.6 1 2 3 4 5 6 155 156 sa III sa III Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 1.e6 296H 31H 311.2 296Na 319.3 297.1 3.3 325.3 333.1 341.2 Product (621):.5 min (2 scans) from Bat22/I/fo/621=> 253.2 6 55 5 45 4 621=> 6.46e4 cps 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4)? 3.5e6 637.6 35 3 31H 31.8 3.e6 29631Na 629.5 25 2 2.e6 1.e6 61.3 67.6 615.4 621.4 29631H 2x296Na 2x31H 643.3 65 15 1 5 545.6 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 1 2 3 4 5 6 26
sa III 157 158 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 31H 311.2 1.e6 296Na 319.3 Product (63):.54 min (13 scans) from Bat22/I/fo/629=> 4.5e5 4.e5 296Na 319.2 629=> 5.52e5 cps 296H 297.1 333.1 3.3 325.3 341.2 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 3.5e6? 637.6 3.5e5 3.e5 2.5e5 3.e6 2.e6 1.e6 61.3 29631H 2x296Na 67.6 615.4 2x31H 621.4 29631Na 629.5 643.3 65 2.e5 1.5e5 1.e5 5.e4 47.6 115.2 178.4 276.8 431.2 561.2 629.2 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 1 2 3 4 5 6 159 16 sa III Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 31H 311.2 1.e6 296Na 319.3 Product (638):.48 min (4 scans) from Bat22/I/fo/637=> 6.5e5 6.e5 5.5e5 296Na 319.2 638=> 7.3e5 cps 297.1 333.1 3.3 325.3 341.2 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4)? 3.5e6 637.6? 3.e6 296H 29631Na 629.5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e5 2.e6 1.e6 61.3 67.6 615.4 621.4 29631H 2x296Na 2x31H 643.3 65 1.5e5 1.e5 5.e4 217.6 276.8 414.8 637.2 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 1 2 3 4 5 6 161 162 sa III sa III Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 31H 311.2 1.e6 296Na 319.3 Q1:.73 min (2 scans) from Bat22/I/fo/LiI, subtracted (scans 6 to 1) 2.e6 1.9e6 1.8e6 Li ionok hozzáadása! 311.2 Li Li 31 1.7e6 319.3 1.6e6 317.2 318 2.72e6 cps 3.3 296H 297.1 325.3 333.1 341.2 1.4e6 1.3e6 1.2e6 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4)?? 3.5e6 637.6? 3.e6 2.e6 1.e6 61.3 621.4 29631H 2x296Na 2x31H 29631Na 629.5 67.6 615.4 643.3 65 1.1e6 1.e6 9.e5 8.e5 7.e5 6.e5 4.e5 3.e5 2.e5 1.e5 294.4 296 Li 297.1 3.1 33.1 37.9 325.3!! 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 295 3 35 31 315 32 325 33 27
sa III 163 164 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 296Na 319.3 318H Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 296Na 319.3 318H 2.e6 1.e6 31H 311.2 2.e6 1.e6 31H 311.2 3.3 296H 297.1 325.3 333.1 341.2 3.3 296H 297.1 325.3 333.1 341.2 29 3 31 32 33 34 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 3.5e6 637.6 3.5e6 637.6 3.e6 29631Na 629.5 3.e6 29631Na 629.5 2.e6 621.4 1.e6 29631H 2x296Na 67.6 615.4 61.3 2x31H 643.3 65 2.e6 1.e6 2x31H 621.4 318296H 29631H 2x296Na 67.6 615.4 61.3 643.3 65 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 sa III 165 sa III 166 Product (615):.28 min (3 scans) from Bat22/I/fo/615=> 35 3 318H 296Na 319.2 615=> 3.64e4 cps Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 31H 311.2 1.e6 296Na 319.3 318H 25 2 15 296H 297.1 333.1 3.3 325.3 341.2 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 3.5e6 637.6 1 5 286.4 399.2 491.6 3.e6 2.e6 1.e6 2x31H 621.4 318296H 29631H 2x296Na 67.6 615.4 61.3 29631Na 629.5 643.3 65 1 2 3 4 5 6 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 167 168 sa III sa III Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 31H 311.2 1.e6 296Na 319.3 318H Product (63):.54 min (13 scans) from Bat22/I/fo/629=> 4.5e5 4.e5 318H 296Na 319.2 629=> 5.52e5 cps 283.3 296H 297.1 325.3 333.1 341.2 3.5e5 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 3.5e6 3.e6 31831H 29631Na 629.5 637.6 3.e5 2.5e5 2.e5 2.e6 1.e6 2x31H 621.4 318296H 29631H 2x296Na 67.6 615.4 61.3 643.3 651.4 1.5e5 1.e5 5.e4 47.6 115.2 178.4 276.8 431.2 561.2 629.2 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 1 2 3 4 5 6 28
169 17 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2.e6 31H 311.2 1.e6 296Na 319.3 318H Product (638):.48 min (4 scans) from Bat22/I/fo/637=> 6.5e5 6.e5 5.5e5 318H 296Na 319.2 638=> 7.3e5 cps 3.3 296H 297.1 325.3 333.1 341.2 4.5e5 29 3 31 32 33 34 Q1:.53 min (7 scans) from Bat22/I/fo, subtracted (scans 2 to 4) 2x318H 3.5e6 637.6 31831H 3.e6 29631Na 629.5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e6 1.e6 2x31H 621.4 318296H 29631H 2x296Na 67.6 615.4 61.3 643.3 65 65 61 615 62 625 63 635 64 645 65 2.e5 1.5e5 1.e5 5.e4 276.8 217.6 414.8 637.2 4 1 2 3 5 6 rozása IV 171 rozása IV 172 7.3e5 7.e5 6.5e5 4-48.4 A: Tetra 2C 4S 3 5.4e4 5.e4 (A2H2Na) 2-839.5 A: Tetra 2C 4S 3 6.e5 5.5e5 4.5e4 (AH2NaNH 4 ) 2-4.5e5 287.9 496.4 4.e4 3.5e4 (AH3Na) 2-4.e5 3.e4 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e5 1.5e5 1.e5 35.9 414. 435.3 3-379. 552.1 557.6 417.9 2-2.5e4 2.e4 1.5e4 1.e4 (A2HNaNH 4 ) 2- (A3HNa) 2-85.5 848. 828.6 851.5 (A3NaNH 4 ) 2-858.5 861.6 83. (A4Na) 2-5.e4 355.2 598.4 839.5 518.1 391.1 545.1 337. 829.1 319.6 61.5 861.6 53.7 724.2 697.6 958.2 426.5 448.1 5. 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 1 79 8 81 82 83 84 85 86 87 88 89 9 91 92 Mennyiségi rozások 173 MS pásztázási si módokm 174 Egyszeres kvadrupol Full scan mód Selected Ion Monitoring (SIM) Hármas kvadrupol Reakciócsatornák figyelése (MRM) Nagyfelbontású MS Q1 full scan Minden iont figyel Selected Ion Monitoring (SIM) Csak a kiválasztott ionokat figyeli 29
Q1 Full scan mód 175 Q1 SIM módm 176 1 st scan 2 nd scan 1 st experiment 2 nd experiment Last m/z Last m/z m/z 3 m/z 3 m/z arány m/z értékek Hosszabb tartózkodás az egyes tömegeken Jobb jel/zaj viszony m/z 2 m/z 2 m/z 3 m/z 2 m/z 1 m/z 3 m/z 2 m/z 1 m/z 1 Idő Time Single Quad Full Scan 177 Single Quad SIM 178 1.5e8 1.e8 5.e7 1ng/ml peszticid 11.2.6 12.4 13.3 7.6 8.2 9.2 9.4 9.9 14. 6.5 6.8 1.2 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1ng/ml peszticid. 1.15e5 1.e5 8.e4 6.e4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 Time, min 253 171 12 22 88 1.e5 9.e4 8.e4 7.e4 6.e4 5.e4 4.e4 7.1 11.1 4.e4 2.e4. 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 3.e4 2.e4 1.e4. 9.6.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 Time, min MRM módm 179 Triple Quad MRM 18 Első scan MRM3 Második scan MRM3 65 6 55 1ng/ml peszticid 6.9 5 Q1/Q3 értékek MRM2 MRM2 45 4 35 3 25 2 15 MRM1 MRM1 1 5 Idő 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 Time, min 3
Szelektivitás: Atrazin 1μg/L 181 Érzékenység: : Chlortoluron 1μg/L 182 MRM MRM SIM SIM Nagyfelbontás 183 184 Nagyfelbont Screening módszerek XIC ± 1mDa S/N = 5.3 XIC ± 4.8mDa S/N = 41. XIC ± 9.6mDa S/N = 15.5 XIC ± 1.9mDa S/N = 44.1 Célmolekulák keresése (M.T.S): 3 MRM (2MRM/komponens): 15 vegyület 3 MRM-en alapuló IDA mérés, mint Survey Scan amit 3 információfüggő EPI scan követ (3 különböző ütközési energián): 3 vegyület És ha több komponens van? Ismeretlen komponensek keresése (G.U.S.) EMS pásztázáson alapuló IDA mérés, mint Survey Scan, amit információfüggő EPI scan követ (AutoFragment módban dinamikus háttérkivonással DBS) Egy csúcs jellemzése 185 Egy csúcs jellemzése 186 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-2 45 4 35 3 25 2 15 1 5 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-2 45 4 35 3 25 2 15 1 5.2.25.3.35.4.45.5.55.6.2.25.3.35.4.45.5.55.6 31
Egy csúcs jellemzése 187 MRM határai 188 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-2 45 4 35 3 25 2 15 1 5 Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során~ 21 sec Minimálisan szükséges adatpontok száma~1 Minimális dwell time / ion ~ 5msec Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec MRM átmenetek maximális száma: = 21 sec/csúcs 1pont/csúcs 7 msec/pont = 3.2.25.3.35.4.45.5.55.6 Ajánl nlás s mennyiségi rozásokhoz 189 Célmolekulák k MRM átmenetei 19 Ajánlás 22/657/EG SIM és MRM (4 azonosítási pont) MS anyaion 1. MS 2 2 MRMs = 4 fragmens 1.5 (megfelelő ionarány) Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) NagyfelbontásúMS (>1 ) XIC of -MRM (3 pairs): 321./152. amu from Sample 3 (Std..5ng/ml) of Data Quantitation Chl... 38 36 34 32 3 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 Quantifier tömeg Qualifier tömeg(ek) 4.99 Max. 385.8 cps..5 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 Time, min Metolachlor Pozit itív találat lat 191 lat 192 Metobromuron Negatív találat ldószer ldószer.1µg/l Standard.1µg/L Standard Számolt Quantifier/Qualifier arány =.9 Felszíni víz.1µg/l Felszíni víz.8µg/l Számolt Quantifier/Qualifier arány =.39 32
QTrap kínálta screening lehetőség Survey scan: 3 MRM IDA kritérium (küszöb ) 3 EPI spektrum Dinamikus kizárás 6 sec MRM Survey Scan IDA Criteria Acquire MSMS Acquire SpectraMSMS Acquire SpectraMSMS Spectra Dynamic Exclusion 193 3 komponens egyidejű mérése 1.e6 9.5e5 9.e5 8.5e5 8.e5 7.5e5 7.e5 6.5e5 6.e5 5.5e5 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 2.5e5 2.e5 1.5e5 1.e5 5.e4 XIC of MRM (297 pairs): 226.2/17. amu from Sample 1 (MRMs 1) of Data MRM pesticides_2.wiff (Turbo Spray) 3 Peszticid 1ng/mL 11.79 Max. 1.1e6 cps. 194. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 Time, min Multi-target target screening screening 195 screening 196 Multi-target target screening Spektrumkönyvt 197 198 nyvtár A QTRAP nyújtotta lehetőségek Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben mért koncentráció.29 mg/kg maximálisan megengedett érték =.5 mg/kg átlag MRM arány a standard esetében =.85 (RSD=8%, n=7) MRM arány a mintában =.99 a standard Rt értéktartománya 5.84-5.87 perc (SD=.1 perc, n=7) minta Rt = 5.78 perc P 1.5e5 1.5e5 1.4e5 1.4e5 1.2e5 1.2e5 1.e5 1.e5 8.e4 8.e4 6.e4 6.e4 4.e4 4.e4 2.e4 2.e4.. Standard 5.84 Gyömbér minta 5.78 5.78 2 4 6 2 4 6 Time, min Time, min További vizsgálatokat igényelt, mivel gyömbérben még nem fordult elő! 6 33
A QTRAP nyújtotta lehetőségek További lehetőségek gek 199 2 Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben Enhanced ProductIon spektrumok az m/z=334 (MH ) ionokon (API 4 Qtrap) Qualifier Quantifier Tebufenpyrad standard oldata Gyömbér minta Tovább növelni az egy injektálásból vizsgálható célmolekulák számát (1-körüli értékig): Scheduled-MRM Konklúzió: a kapott EPI spektrumok alapján a Tebufenpyrad jelenléte a gyömbérben egyértelműen kizárható! Tipikus Screening kromatogram 21 Egy tipikus screening mérés 22 1.e6 9.5e5 9.e5 8.5e5 8.e5 7.5e5 7.e5 11.79 3 MRM Ciklusidő 2.1 sec Dwell Time: 5msec Pause time 2msec MRM csatornák alakulása az LC mérés során: Csúcsszélesség 1sec, egyszerre vizsgált MRM cstaornák átlaga : 7 Pesticide Mix (253 MRM) - From 6.68-Min to Last MRM (out of 32) Average MRM/Sec = 7 (for Peak Width of 16sec) 25 Numb. MRM Gradient 9 8 6.5e5 6.e5 2 7 5.5e5 5.e5 4.5e5 4.e5 3.5e5 3.e5 Number MRM at Time 15 1 6 5 4 3 % A (aqueous) 2.5e5 2.e5 5 2 1.5e5 1 1.e5 5.e4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 Time, min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 LC Time (sec) Scheduled-MRM 23 Scheduled-MRM MRM: : a koncepció 24 Csak akkor figyel egy MRM csatornát, amikor ott ion várható Minden MRM csatorna esetén meg kell adni Egy várt Rt. Rt. ablak Minimum dwell time A program automatikusan felépíti a metódot Az idők alapján megtervezi az MRM átmeneteket A minimális ciklusidőt VAGY dwell time-ot veszi alapul MRM átmenetek Nagy számú vizsgált MRM átmenet Kis számú vizsgált MRM átmenet 34
High throughput vizsgá vizsgálat smrm módszerrel Nontargeted screening: screening: SWATH SWATH 25 Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical mass spectra lehetővé teszi MS/MS felvételek készítését általános és átfogó módon 1.5e 5 1.e 5 1 perces LC futás 1 MRM módszer 35 vegyület spike-olt vizelet 9.5e 4 9.e 4 8.5e 4 8.e 4 7.5e 4 7.e 4 6.5e 4 26 A Q1 kvadrupólt szélesre nyitjuk és léptetjük a teljes tömegtartományban Data Independent Acquisition (DIA), információtól független mérés MS/MSALL 6.e 4 5.5e 4 5.e 4 4.5e 4 4.e 4 3.5e 4 3.e 4 2.5e 4 Regular MS/MS 2.e 4 SWATH MS/MS 1.5e 4 1.e 4 5.. 1 2 3 4 5 Time, m in 6 7 8 9 Q1 filter [.7] 1 SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete TF analyzer CID TF analyzer SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete m/z 12 m/z 27 28 11 Aebersold and coworkers, ETH Zurich 11 1 9 8 7 6 5 4 1 9 Aebersold and coworkers, ETH Zurich 12 Q1 filter [25Da] CID m/z tömegtartomány = [4-12] Ÿ 25Da swath ablak ó 32 swath-ra van szükség Ÿ 1ms egy ablak ó 3.2s ciklusidő 8 swath = A kromatográfiás futás során egy adott tömegablakkal kiválasztott anyaionok fragmenseinek összessége 7 6 Ciklusidő: azonos tömegablakhoz való visszatéréshez szükséges idő 5 4 min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 min 11 SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: adatgyűjtés és értékelés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: Adatgyűjtés és értékelés MS2/swath map [swath 6-625 m/z] TIC 29 21 TIC MS1 map 29 MS1 map 855.5395 742.4556 671.418 6.3368 Ae Ae ber ber so so ld ld aa nd nd co co wor wor ker ker s, s, E E TH TH Zurich Zurich Ae ber so ld a nd co wor ker s, E TH Zurich Keresett peptid 327.1295 Kiválasztott ionkromatogramok: 855.5395 742.4556 671.418 6.3368 327.1295 21 35
SWATH előnyei 211 Mennyiségi rozások 212 általános és nem célzott nincs módszerfejlesztés! Az adatok utólagosan visszanyerhetők (mind MS, MS/MS és XIC) A mérési idő nem növekszik a mérendő komponensek számával Aszelektivitásahasonló MRMHR -hez (a háttér általában magasabb) Q SIM QqQMRM QTrap MS 3 QTrap MRM/EPI QTrap smrm TF MS TF MSMS TF MSMS SWATH Komp/inj <1 15 <1 3 1 Korlátlan <1 Korlátlan Érzékenység - Szelektivitás - Retrospektív Nem Nem Nem Nem Nem Igen Nem Igen Terápi piában használt gyógyszerek gyszerek Analeptikumok Antiarrhythmikumok Antibiotikumok Antidepresszánsok Antiepileptikumok Antikoagulánsok Antimycotikunok 213 Antiretrovirális szerek Analgetikumok Bronchustágítók Immunszuppresszánsok Narkotikumok Cytosztatikumok Immunszuppresszánsok nsok Ciklosporin A Rapamycin (Sirolimus) Tacrolimus Everolimus 214 Immunoszuppressz resszánsok 215 Ciklosporin toxicitás 216 H 3 C CH 3 16 14 15 ng/ml < C < 3 ng/ml CH 3 N CH(CH 3) 2 H N CH 3 (H 3C) 2CHCH 2 CH2CH(CH3)2 CH3 H 3C H 3C (CH3)2CHCH2 N N N H CH3 H N N CH3 H N R H N N CH 3 N CH3 CH 2CH(CH 3) 2 Cyclosporin vérszint (ng/ml) 12 1 8 6 4 2 Nefrotoxicitás, hypertensio Hepatotoxicitás: Bi, máj enzimek Cyclosporin A Mol. Wt. 122.624 Exact Wt. 121.841 CH(CH 3) 2 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 Idõ (óra) 36
CSA vérszint rozás 217 FPIA vs.. LCMS 218 Immunoassay -FPIA: fluorescencepolarization immunoassay -EMIT: enzymemultiplied immunoassay technique HPLC-MS/MS CYA koncentráció FPIA módszerrel (ng/ml) 18 16 14 12 1 8 6 4 y=1.56151*x63.442 r=.9742 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CYA koncentráció LC-MS módszerrel (ng/ml) EMIT vs.. LCMS 219 Ciklosporin metabolizmusa: CYP3A4 22 H CYA koncentráció EMIT módszerrel (ng/ml) 12 1 8 6 4 2 y=1.2975*x27.8861 r=.92766 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H H N 11 N 1 N 1 9 N 8 7 N N 6 N N 2 N 3 N 5 4 N CYA koncentráció LC-MS módszerrel (ng/ml) CSA metabolitjai MRM 221 2D LCMS 222 XIC of MRM (7 pairs): 122.8/224.4 amu from Sample 1 (29) of 6126MRM.wiff (Turbo Spray), Smoothed Max. 2593.7 cps. Poros R1/2 (2.1x3mm) 2594 25 24 23 5.49CSA Luna Phenyl-Hexyl(2x5mm) 32 QTrap 22 21 2 6ºC 19 18 17 16 15 14 13 12 H-CSA Autosampler 11 1 9 8 Pumpa A 7 6 5 4 3 2 1 dih-csa ISTD 4.55.5 1. 1.5 2. 2.5 3. 3.5 4. 4.5 5. 5.5 6. 6.5 7. 7.5 Time, min Pumpa B Metanol 5% Metanol 97%,.1% AcH, 1mM NH 4 FA 37
2D LC/MS/ /MS/MS 223 Metabolizmus következménye 224 XIC of MRM (1 pairs): 821.4 /576. amu from Sample 1 (22) of 711.w iff (Turb o Spray), Smoothed, Sm oothed Max. 14.7 cp s. 622 6 55 CSA Immunszuppresszívhatás csökken 5 In te nsity, cps 45 4 35 3 H-CSA Metabolitok toxicitása hozzájárulhat az anyavegyület toxicitásához 25 2 15 dih-csa 1 5.2.4.6.8 1. 1.2 1.4 1.6 1.8 2. 2.2 2.4 2.6 2.8 Time, min dih-ciklosporin vs GGT /se Bi 225 Dihidroxi-cik iklosporin vérszint I. 226 8 6 2 15 Recipiens: KI 27.1.3 45 éves férfi HCV ggt (U/l) 4 2 r=,82787 5 1 15 2 25 3 35 4 45 dih-csa (ng/ml) Bilirubin (µmol/l) n=11 1 5 r=,88723 1 2 3 4 5 6 dih-csa (ng/ml) Dihidroxi-cyclosporin koncentráció (ng/ml) 7 6 5 4 3 2 1 4! dih-cya! GGT 3 2 1 1 2 3 15 2 25 3 idõ (nap) GGT koncentrációja (U/l) Dihidroxi-cyclosporin koncentráció (ng/ml) 7! dih-cya 12 Bilirubin 6 1 5 8 4 6 3 4 2 2 1 1 2 3 15 2 25 3 idõ (nap) Bilirubin koncentráció (µmol/l) Dihidroxi-cik iklosporin vérszint II. 227 228 Recipiens: FNGy 27.9.5 52 éves férfi HBV Dihidroxi-CYA koncentráció (ng/ml) 4 3 2 1 dih-cya! GGT Cyclosporin 2 4 6 8 1 12 14 16 idõ (nap) Tacrolimus 7 6 5 4 3 2 1 G GT (U/l) Dihidroxi-CYA koncentrációja (ng/ml) 4 3 2 1 Donor: 52 éves nő CYP3A4 aktivitás magas!! Cyclosporin Tacrolimus dih-cya! Bilirubin 2 4 6 8 1 12 14 16 idõ (nap) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Bilirubin koncentráció (µmol/l) Egyéni terápia megvalósítása sa Genotipizálás Fenotipizálás 38
Valproát metabolizmusa metabolizmusa 229 23 Genetikai etikai polimorfizmusa CH CYP allél Mutáció Enzim aktivitás CYP2C9 Valproát CYP2C9 CYP2C9*2 43C>T csökkent H CH CH 4-hidroxi -valproát CYP2C9 4-én-valproát CYP2C9*3 175A>C csökkent CH CH H 5-hidroxi-valproát H 3-hidroxi-valproát Esetismertetés 1,5 hónapos koraszülött csecsemő (S.H.) epilepsia focalis valproátkezelés toxikus tünetek: leállították a valproátkezelést CYP status: CYP2C9*3/*3 valproátkezelés tilos!! még 5 nappal a valproátkezelés beszüntetése után is magas valproátvérszint karbamazepinreváltottak: a beteg állapota normalizálódott 231 Valproát vérszintek alakulása a CYP2C9-st státus tus függvf ggvényében Valproát vérszint / dózis (ug/ml)/mg,5,4,3,2,1, PN BBMP IM CYP2C9 fenotípus *1/*3 MaA BMFZs TSz JM KMSB Betegek RA BJZD PM MéA GNZsB SB MBLD *1/*2 ÁN 232 Valproát kezelés s a CYP2C9- státus tus ismeretében CYP2C9 genotípus és fenotípus együttes figyelembe vétele: CYP2C9 homozigóta mutáns: *2/*2 vagy *3/*3 nem javasolt a valproát alkalmazása CYP2C9 heterozigóta: *1/*2 vagy *1/*3 alacsony dózis javasolt még CYP2C9 IM esetén is CYP2C9 homozigóta vad: *1/*1 a CYP2C9 fenotípus irányadó: CYP2C9 PM: alacsony dózis javasolt CYP2C9 IM: normál dózis alkalmazható 233 39