PLATELIA CMV IgG 1 lemez 96 72810 CITOMEGALOVÍRUS ELLENI IgG ANTITESTEK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM-IMMUNOASSAY TECHNIKÁVAL 881140 2013/11 1. FELHASZNÁLÁS A Platelia CMV IgG egy indirekt ELISA immunoassay Kit a citomegalovírus elleni IgG antitestek mennyiségi meghatározására humán szérumból vagy plazmából. 2. KLINIKAI JELENTŐSÉG A humán citomegalovírusok (CMV) igen elterjedtek az emberi népességben. A CMV a herpeszvírus-család tagja, és közvetlen kontaktussal terjed (vizelet, nyál, anyatej, vér, könnyek, sperma és hüvelyváladék). A fertőződést követően a CMV több évig is lappanghat a fertőzött beteg szervezetében, majd reaktiválódva újra és újra megjelenő fertőzéseket okoz, melyek során fennáll a lehetősége a másokra való továbbterjedésnek is. A gazdaszervezet többféle módon és különböző életszakaszokban fertőződhet meg (congenitalis, post-natalis fertőzések). Egy bizonyos lappangási fázist követően másodlagos fertőzés alakulhat ki exogén vírus okozta reinfekció, vagy a lappangó vírus reaktiválódása útján is. A lakosság 50-85%-a a felnőttkor előtt fertőződik meg, de a fertőzések többsége tünetmentes marad; mindössze a betegek 2%-ánál jelentkeznek atípusos tünetek, például láz, gyengeség, izom- vagy ízületi fájdalom. A CMV-fertőzés azonban súlyos kimenetelű is lehet, ha terhes nőket, újszülötteket vagy legyengült immunrendszerű egyéneket érint. Terhesség alatt a nők 1-3%-a fertőződik CMV-vel, és a betegek 40-50%-ánál figyelhető meg magzati fertőződés a placentán keresztül. A magzati fertőzések 95%-a tünetmentes, de 5% esetén a szövődmények rendkívül súlyosak: hepatosplenomegalia, microcephalia, hydrocephalia, koraszülés, pszichomotoros retardáció és magzatelhalás. A tünetmentes fertőzések 10%-ában az újszülötteknél késleltetve jelennek meg a szövődmények, mint például a részleges vagy teljes süketség vagy vakság. Immunszuppresszált egyéneknél (AIDS-es betegekben, transzplantáción átesett egyéneknél, limphoproliferatív vagy rákos betegségben szenvedőknél) a súlyos szövődmények a disszeminált és/vagy viscerális fertőzéssel vannak összefüggésben: splenomegalia, chorioretinitis, hepatitis, pneumonia, myocarditis, encephalitis. Ilyen betegeknél a fertőzés akár fatális kimenetelű is lehet. A CMV-fertőzés után néhány héttel az immunválasz következtében megjelennek a specifikus IgM antitestek, majd néhány nappal később a specifikus IgG antitestek. A CMV szerológiai diagnózisa szerokonverzióval vagy az IgG titer jelentős növekedésével igazolható. A specifikus anti-cmv IgG antitestek kimutatása alkalmas a primer fertőzés diagnosztizálására, valamint a betegek immunológiai státuszának meghatározására. 3. ALAPELV A Platelia CMV IgG a citomegalovírus elleni IgG antitestek humán szérumból vagy plazmából történő kimutatására és titerének meghatározására alkalmas, indirekt ELISA enzim immunoassay Kit. A mikrolemez inaktivált CMV-antigénnel van bevonva. Konjugátumként a humán -láncra (anti-igg) specifikus, peroxidázzal jelzett poliklonális antitest szolgál. A teszt menete: 1. lépés A betegmintákat és a kalibrátor oldatokat 1:21 arányban kell hígítani, majd bemérni a mikrolemez mélyedéseibe. Az egy órán keresztül tartó, 37 C-os inkubálás alatt a mintában jelen lévő CMV elleni IgG antitestek kötődnek a mikrolemez mélyedéseiben megkötött CMV-antigénhez. Inkubálás után a nem kötött, aspecifikus antitesteket és egyéb szérumfehérjéket mosással el kell távolítani. 2. lépés Ezután a konjugátumot (humán -láncra specifikus, peroxidázzal jelzett poliklonális antitest) kell hozzá adagolni a mintákhoz. Az újboli egyórás, 37 C-os inkubálás alatt a jelzett antitest kötődik a CMV-antigén által rögzített szérum IgGhez. A feleslegben maradó konjugátumot az inkubálás végén mosással kell eltávolítani. 1
3. lépés Az immunkomplexek (CMV-antigén, CMV elleni IgG antitestek és anti-igg konjugátum) jelenlétét enzimes előhívó oldat adagolásával mutatjuk ki. 4. lépés Szobahőmérsékleten (+18-30 C) történő inkubálás után az enzimreakciót 1 N kénsavoldat hozzáadásával állítjuk le. A spektrofotométerrel, 450/620 nm hullámhosszon mért optikai denzitás arányos a mintában jelen lévő CMV elleni IgG antitestek mennyiségével. 4. TERMÉKINFORMÁCIÓK A készletben található reagensek mennyisége 96 teszt elvégzéséhez elegendő. A reagensek kizárólag in vitro diagnosztikai célokra használhatóak. Címke A reagens leírása Kiszerelés R1 Mikrolemez Mikrolemez (használatra kész) 12 sor, amelyek 8-8 leválasztható mélyedésből állnak, inaktivált CMV-antigénnel bevonva R2 Koncentrált mosóoldat (20x) Koncentrált mosóoldat (20x) TRIS-NaCl puffer (ph 7,4), 2% Tween 20 Tartósítószer: 0,04% ProClin 300 R3 Kalibrátor 0 Kalibrátor 0 A CMV elleni IgG antitestekre, valamint HBs-antigénre, anti- HIV1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4a Kalibrátor 0,4 Kalibrátor 0,4 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4b Kalibrátor 1 Kalibrátor 1 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4c Kalibrátor 4 Kalibrátor 4 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4d Kalibrátor 10 Kalibrátor 10 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R6 Konjugátum (51x) Konjugátum (51x) Torma-peroxidázzal jelölt, humán -lánccal szemben termelődött kecske poliklonális antitest Tartósítószer: 0,16% ProClin 300 R7 Hígítószer Minta- és konjugátumhígító (használatra kész) Tris-NaCl (ph 7,7), bovin albumin, glicerin, 0,1% Tween 20, fenolvörös R9 Kromogén TMB Kromogén (használatra kész) 3,3,5,5 -tetrametil-benzidin (< 0,1%), H 2 O 2 (< 1%) R10 Leállító oldat Leállító oldat (használatra kész) 1N kénsavoldat 1 mikrolemez 70 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,7 ml 80 ml 28 ml 28 ml A tárolási feltételeket és a lejárati időt lásd a dobozon. 2
5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Az eredmények megbízhatósága az alábbi helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) irányelveinek megfelelő betartásától függ: Lejárt reagensek használata tilos! A különböző tételekből származó reagenseket nem szabad összekeverni, illetve egymással kombinálni. MEGJEGYZÉS: A mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű), a kromogén (R9, megjelölés: TMB, türkiz) és a leállító oldat (R10, megjelölés: 1N, piros színű) esetében lehetséges más készletekben lévő reagensek felhasználása is, feltéve, hogy ezek a reagensek szigorúan egyenértékűek, és az adott tesztben használt reagensekkel azonos gyártási tételből származnak. MEGJEGYZÉS: Emellett a mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű) megfelelő feloldás után összekeverhető a különböző Bio-Rad reagens készletekben található 2 másik mosóoldattal (R2, megjelölés: 10x, kék színű vagy 10x, narancsszínű), feltéve, hogy egy adott teszt során csak egyféle keveréket használnak fel. A felhasználás előtt várjon 30 percet, hogy a reagensek szobahőmérsékletre (+18-30 C) melegedjenek. Gondosan oldja fel vagy hígítsa a reagenseket, elkerülve a szennyeződést. Ne végezze a tesztet reaktív gőzök (sav-, lúg-, aldehidgőzök) vagy por jelenlétében, mivel ezek módosíthatják a konjugátum enzimaktivitását. Használjon alaposan elmosott és ioncserélt vízzel kiöblített üvegeszközöket. Az egyszerhasználatos eszközök használata javasolt! A mikrolemez átmosása az eljárás kritikus lépése: végezze el a javasolt számú mosási ciklust, és ügyeljen arra, hogy a mélyedések teljesen fel legyenek töltve, majd teljesen ki legyenek ürítve. A nem megfelelő mosás pontatlan eredményekhez vezethet. Ne hagyja, hogy a mikrolemez kiszáradjon az egyes mosási ciklusok vége és a reagens bemérése között. Soha ne használja ugyanazt az eszközt a konjugátum és az előhívó oldat beméréséhez. A enzimreakció nagyon érzékeny a fémekre vagy fémionokra. Éppen ezért ne engedje, hogy bármilyen fémes elem érintkezzen a konjugátumot vagy a kromogént tartalmazó különböző oldatokkal. A kromogén oldatnak (R9) színtelennek kell lennie. A kék elszíneződés azt jelzi, hogy a reagens a továbbiakban már nem használható! Minden mintához külön pipettahegyet kell használni. Ellenőrizze a pipetták és egyéb eszközök pontosságát és megfelelő működését! Egészségügyi és biztonsági utasítások A reagensek elkészítéséhez használt humán eredetű anyagokat hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag), hepatitis C vírus elleni (anti-hcv) és HIV elleni antitestekre (anti-hiv1 és anti-hiv2) vizsgálták, és negatívnak találták. Mivel nem létezik olyan módszer, amellyel teljes biztonsággal kizárható a fertőző ágensek jelenléte, a humán eredetű reagenseket és betegmintákat potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. Bármely anyagot, beleértve a mosóoldatot is, amely közvetlen érintkezésbe kerül a mintákkal és a humán eredetű anyagokat tartalmazó reagensekkel, potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. A mintákkal és reagensekkel való munka során viseljen egyszerhasználatos védőkesztyűt. Szájjal pipettázni tilos! Ügyeljen arra, hogy a minták, illetve a mintákat tartalmazó oldatok ne follyanak ki. A kiömlött anyagokat 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni. Ha sav ömlik ki, akkor azt először nátrium-bikarbonáttal semlegesíteni kell, majd 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni, és a területet száraz papírtörlővel feltörölni. A tisztításhoz használt anyagokat a szennyezett maradékok tárolására szolgáló edénybe kell beledobni. A betegmintákat, humán eredetű anyagokat tartalmazó reagenseket, valamint a szennyezett anyagokat és termékeket kizárólag fertőtlenítés után lehet hulladékba helyezni: - áztatás 5%-os végkoncentrációjú nátrium-hipoklorit oldatban 30 percig, - vagy autoklávozás 121 C-on minimum 2 órán át. VIGYÁZAT! Ne tegyen nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatokat az autoklávba! Ügyeljen arra, hogy a reagensek még a veszélytelennek tekinthető reagensek se kerüljenek a bőrre vagy nyálkahártyára. A kémiai és biológiai maradványokat a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően kell kezelni és megsemmisíteni. A készletben lévő valamennyi reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra használható. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: www.bio-rad.com. 3
6. MINTÁK 1. Javasolt mintatípusok: szérum és plazma (EDTA, heparin vagy citrát). 2. A vérminták kezelése, feldolgozása és tárolása során tartsa be az alábbi ajánlásokat: Mindig a vénaszúrással kapcsolatos rutin óvintézkedések betartásával vegye le a vérmintákat. Szérum esetén centrifugálás előtt hagyja, hogy a minták teljesen megalvadjanak. A csöveket mindig tartsa lezárva. Centrifugálás után öntse le a szérumot vagy plazmát az alvadékról vagy a vörösvérsejtekről egy tárolócsőbe, amelyet azután szorosan lezár. A minták +2-8 C-on tárolhatók, ha a vizsgálat 7 napon belül megtörténik. Amennyiben a vizsgálatot nem végzik el 7 napon belül, illetve amennyiben a mintákat szállításra kerülnek, fagyassza le azokat 20 C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre. Ne használjon olyan mintákat, amelyeket több mint öt alkalommal felolvasztottak. A lefagyasztott, majd felolvasztott mintákat a vizsgálat előtt alaposan össze kell keverni (Vortex). 3. A 90 g/l albumint vagy 100 mg/l konjugálatlan bilirubint, illetve 36 g/l triolein (triglicerid) ekvivalens lipémiás, vagy max. 10 g/l hemoglobintartalmú hemolizált minták az eredményeket nem befolyásolják. 4. A mintákat nem szabad melegíteni. 7. A VIZSGÁLAT MENETE 7.1 A méréshez szükséges, de a készletben nem szereplő anyagok Vortex keverő. 450 nm-es és 620 nm-es szűrőkkel felszerelt mikrolemez-leolvasó (*). Stabilan 37±1 C-ra beállított mikrolemez-inkubátor (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemezmosó (*). Steril desztillált vagy ioncserélt víz. Egyszerhasználatos védőkesztyű. Védőszemüveg. Papírtörlő. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták vagy többcsatornás pipetták a 10-1000 µl, 1 ml, 2 ml és 10 ml kiméréséhez. 25 ml-es, 50 ml-es, 100 ml-es és 1000 ml-es mérőhengerek. Nátrium-hipoklorit (fertőtlenítő) és nátrium-bikarbonát. Biológiai hulladéktároló. Eldobható kémcsövek. (*) A javasolt felszerelésekkel kapcsolatos részletese információkért forduljon technikai osztályunkhoz. 7.2 A reagensek feloldása R1: A csomagolás felbontása előtt hagyja állni 30 percig szobahőmérsékleten (+18-30 C). Vegye ki a tartótálcát, a nem szükséges sorokat rögtön tegye vissza a csomagolásba, és ellenőrizze, hogy benne van-e a nedvességmegkötő anyag. Gondosan zárja vissza a csomagolást, és tegye +2-8 C-os helyre. R2: Az R2 mosóoldatot hígítsa desztillált vízzel 1:20 arányban. Például: 50 ml R2 oldat és 950 ml desztillált víz a használatra kész mosóoldat elkészítéséhez. Manuális mosáshoz készítsen 350 ml hígított mosóoldatot egy 12 sorból álló lemezhez. R3, R4a, R4b, R4c, R4d: Hígítsa 1:21 arányban hígítószerrel (R7) (például: 300 µl R7 + 15 µl kalibrátor oldat). R6 + R7: A konjugátum (R6) 51-szeres töménységű, és használat előtt homogenizálni kell. Hígítsa 1:51 arányban hígítószerrel (R7). Egy lemezhez hígítson 0,5 ml konjugátumot (R6) 25 ml hígítószerrel (R7). Az egy sorhoz szükséges mennyiség kiszámításához ossza el a fenti térfogatokat tízzel. 7.3 A felbontott és/vagy feloldott reagensek tárolása és eltarthatósága A készletet +2-8 C-on kell tárolni. Ha a készletet +2-8 C-on tartják felbontás előtt, akkor minden alkotórész a készlet külső címkéjén feltüntetett lejárati ideig használható. R1: Felbontás után a sor max. 8 hétig használható, ha +2-8 C-on tárolják az eredeti, gondosan visszazárt csomagolásban (ellenőrizze a nedvességmegkötő anyag meglétét). R2: Hígítás után a mosóoldat +2-30 C-on 2 hétig tárolható. Felbontást követően a tömény mosoóldat +2-30 C-on, a szennyeződés kizárásával tárolt körülmények között a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg a minőségét. R3, R4a, R4b, R4c, R4d, R6, R7: A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzik meg minőségüket. R6 + R7: Hígítás után a konjugátum-munkaoldat szobahőmérsékleten (+18-30 C) 8 órán át, 2-8 C-on pedig 24 órán át stabil. R9: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzi meg minőségét. R10: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg minőségét. 4
7.4 Eljárás Szigorúan kövesse a mérési eljárást és a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásait. A felhasználás előtt hagyja, hogy a reagensek szobahőmérsékletre (+18-30 C) melegedjenek. A letörhető mélyedések használata különleges odafigyelést igényel. Használjon kalibrátor oldatokat minden egyes méréshez, a mérési eredmények validálásához. 1. Gondosan tervezze meg a kalibrátor oldatok és a betegminták elhelyezését és beazonosítását a lemezen. 2. Készítse el a hígított mosóoldatot (R2) (lásd a 7.2. részt). 3. Vegye ki a tartótálcát és a sorokat (R1) a védőcsomagolásból (lásd a 7.2. részt). 4. Hígítsa 1:21 arányban az R3, R4a, R4b, R4c és R4d kalibrátor oldatokat és az S1, S2 stb. betegmintákat a hígítószerrel (R7) a megfelelő azonosítóval ellátott csövekben: 300 µl hígítószer (R7) és 15 µl minta (lásd a 7.2. részt). Homogenizálja a mintákat Vortex keverővel. 5. Szigorúan betartva az alábbi sorrendet, mérjen be 200-200 µl-t a kalibrátor oldatokból és a betegmintákból az egyes mélyedésekbe: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával, erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását 37 C 1 C-os termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át ( 5 perc). 7. Az első inkubálás vége előtt készítse el a konjugátum-munkaoldatot (R6 + R7) (lásd a 7.2. részt). 8. Az első inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 9. Rögtön mérjen bele minden mélyedésbe 200-200 µl konjugátum-munkaoldatot (R6 + R7). Az oldatot használat előtt össze kell rázni. 10. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását 37 C 1 C-os, termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át ( 5 perc). 11. A második inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 12. Gyorsan mérjen bele minden mélyedésbe 200-200 µl kromogén oldatot (R9) fénytől védett körülmények között. Hagyja végbemenni a reakciót sötétben, szobahőmérsékleten (+18-30 C) 30 ± 5 percig. Ezen inkubálás alatt ne fedje le a lemezt a tapadófóliával. 13. Mérjen be 100-100 µl leállító oldatot (R10) minden mélyedésbe, leállítva az enzimreakciót. Ezt ugyanolyan sorrendben és sebességgel végezze, mint az előhívó oldat esetében tette. 14. Gondosan törölje le a lemez alját. A reakció leállításától számított 30 percen belül egy lemezleolvasó segítségével mérje meg az optikai denzitást 450/620 nm-en. A sorokat leolvasás előtt folyamatosan fénytől védve kell tárolni. 15. Az eredmények továbbítása előtt ellenőrizze a mért értékeket, a lemez kiosztási tervét és a mintákat. 8 AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 8.1 A standard görbe felvétele Az anti-cmv IgG antitestek méréséhez nem létezik nemzetközi standard készítmény. A Platelia CMV IgG próba a WHO által ajánlott nemzetközi standard készítmény (1995) felhasználásával lett standardizálva. A CMV elleni IgG antitestek jelenlétét és koncentrációját a mintában úgy határozzuk meg, hogy összevetjük a minta optikai denzitását (OD) a standard görbe kalibrátor oldatainak arbitrális egység/milliliterben (AE/ml) kifejezett koncentrációjával. A standard görbét (OD = függvény [AE/ml]) úgy kapjuk meg, hogy a függőleges tengelyen (Y) az R3, R4a, R4b, R4c és R4d kalibrátor oldatok optikai denzitását, a vízszintes tengelyen (X) pedig az egyes kalibrátor oldatok AE/ml-ben kifejezett koncentrációját ábrázoljuk. Minden vizsgált mintánál úgy határozhatjuk meg az anti-cmv IgG antitest titert, hogy a standard görbéről leolvassuk a minta mért optikai denzitásának megfelelő koncentrációt. 5
8.2 Minőségellenőrzés Minden egyes mérésnél, mikrolemezenként, használja az összes kalibrátor oldatot, és elemezze a kapott eredményeket. A mérés akkor megfelelő, ha kielégíti az alábbi kritériumokat: Optikai denzitás-értékek: OD R4a 0,150 OD R4b 0,300 OD R4d > OD R4c Optikai denzitás-arányok: OD R4a / OD R3 3,50 OD R4b / OD R4a 1,50 OD R4c / OD R4b 1,50 Amennyiben a mérés nem felel meg a felsorolt minőségellenőrzési feltételeknek, meg kell ismételni. 8.3 Az eredmények értelmezése Anti-CMV antitest titer (arbitrális egység/ml) Eredmény Értelmezés Titer < 0,25 AE/ml Negatív 0,25 AE/ml titer < 0,5 AE/ml Kétes Titer 0,5 AE/ml Pozitív A negatív vagy kétes eredmény a szerzett immunitás hiányát jelzi, de nem zárja ki a nemrégiben kialakult fertőzést. Ha feltételezhető, hogy a betegnél nemrégiben alakult ki fertőzés, akkor két héttel később új mintával ismét el kell végezni a vizsgálatot. A pozitív eredmény rendszerint régebbi fertőzést jelez. Azonban nem zárható ki a közelmúltban kialakult fertőzés, különösen ha anti-cmv IgM antitestek vannak jelen. Nemrégiben kialakult fertőzés gyanúja esetén egyéb szerológiai vizsgálatok, például az IgG antitest aviditásának mérése segítségével megerősíthető a diagnózis. Nagyobb titer ingadozás figyelhető meg 4 AE/ml koncentráció felett. Azokat a mintákat, amelyek koncentrációja nagyobb a legtöményebb kalibrátor oldat koncentrációjánál, hígítani lehet az R7 hígítószerrel annak érdekében, hogy a standard görbén a kapott eredmény belekerüljön a vizsgálat lineáris tartományába. Ilyen esetben a végleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy a mért értéket megszorozzuk a hígítási aránnyal. 8.4 Hibaelhárítási útmutató Az érvénytelen vagy nem reprodukálható reakciókat gyakran az alábbi tényezők okozzák: A mikrolemez nem megfelelő mosása. A negatív minták szennyeződése magas antitest titerű szérummal vagy plazmával. Az előhívó oldat szennyeződése kémiai oxidálószerekkel (pl. fertőtlenítővel, fémionokkal stb.). A leállító oldat szennyeződése. 9 TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK A Platelia CMV IgG Enzim Immunoassay KIT teljesítményjellemzőit 2 egymástól független helyszínen határoztuk meg, összesen 1096 terhes nőtől és véradótól levett minta alapján. 9.1 Prevalencia Az anti-cmv IgG antitestek Platelia CMV IgG teszttel mért prevalenciáját 300, Párizsban és környékén (Franciaország) élő terhes nőtől levett mintán határoztuk meg. 145 minta volt pozitív az anti-cmv IgG antitestre. A Platelia CMV IgG próbával mért prevalencia 48,3%-os volt (145/300). 9.2 Specificitás A relatív specificitást 490 db mintából elvégzett mérés alapján állapítottuk meg, melyeket két egymástól független helyszínről gyűjtöttünk össze. A minták az alábbiak szerint oszlottak meg: 61, véradóktól származó szérum 429, terhes nőktől származó szérum 6
Az eredményeket a referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA próbával kapott eredményekkel vetettük össze. Vizsgált populáció /vizsgálóhely 1. vizsgálóhely 2. vizsgálóhely Szérumok száma Negatív Kétes Pozitív Specificitás Terhes nők 81 81 0 0 Véradók 61 61 0 0 Terhes nők 348 348 0 0 Összesen 490 490 0 0 [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. 100,0% (81/81) [96,3 100,0%] 100,0% (61/61) [95,2 100,0%] 100,0% (348/348) [99,1 100,0%] 100,0% (490/490) [99,4 100,0%] 9.3 Érzékenység A relatív érzékenységet 606 db db mintából elvégzett mérés alapján állapítottuk meg, melyeket két egymástól független helyszínről gyűjtöttünk össze. A minták az alábbiak szerint oszlottak meg: 136 véradóktól származó szérum 470 terhes nőktől származó szérum Az eredményeket a referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA próbával kapott eredményekkel vetettük össze. Vizsgált populáció /vizsgálóhely 1. vizsgálóhely 2. vizsgálóhely Szérumok száma Negatív Kétes* Pozitív Érzékenység Terhes nők 123 0 2 121 Véradók 136 3 1 132 Terhes nők 347 0 4 343 Összesen 606 3 7 596 * Az érzékenység számításánál a kétes eredményeket negatívnak tekintettük. [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. 98,4% (121/123) [94,2 99,8%] 97,1% (132/136) [92,6 99,2%] 98,8% (343/347) [97,1 99,7%] 98,4% (596/606) [97,0 99,2%] 9.4 Keresztreakciók 103 mintából (77 olyan mintából, amely pozitív volt toxoplazmózisra, rubeolára, EBV-re, HSV-re, VZV-re, mumpszra, bárányhimlőre és HIV-re, valamint 26 olyan mintából, amely pozitív volt reumatoid faktorra, auto-antitestre és heterofil antitestre) álló panellel végeztünk anti-cmv IgG antitestszűrést Platelia CMV IgG próbával és kereskedelmi forgalomban kapható EIA próbával. A minták közül 37 volt negatív, és az eredmény megfelelt az összehasonlításra használt EIA-készlet eredményeinek, amely igazolja a lehetséges keresztreakciók hiányát. 9.5 Pontosság Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség): A mérésen belüli ismételhetőség meghatározásához egy negatív és három pozitív mintát teszteltünk 30 alkalommal egyazon mérésen belül. Minden egyes pozitív mintához meghatároztuk a koncentrációt (AE/ml). A negatív minta eredményeit arányszámmal fejeztük ki. A négy mintához tartozó átlagos koncentrációkat és arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: 7
Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség) N = 30 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Erősen pozitív minta Arány (OD minta / OD R4a) Koncentráció (AE/ml) Átlag 0,11 1,87 3,53 4,78 SD 0,01 0,10 0,18 0,30 %CV 6,6% 5,1% 5,1% 6,3% Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság): A mérések közötti reprodukálhatóság meghatározásához négy mintát (egy negatív és három pozitív) teszteltünk két-két párhuzamos vizsgálattal, naponta 2-2 mérést elvégezve 20 napon át. Minden egyes pozitív mintához meghatároztuk a koncentrációt (AE/ml). A negatív minta eredményeit arányszámmal fejeztük ki. A négy mintához tartozó átlagos koncentrációkat és arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság) N=80 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Erősen pozitív minta Arány (OD minta / OD R4a) Koncentráció (AE/ml) Átlag 0,10 1,44 3,10 4,22 SD 0,02 0,19 0,40 0,76 %CV 16,0% 13,4% 13,0% 18,0% 9.6 Linearitás A Platelia CMV IgG próba lineáris tartománya 0 és 4 AE/ml közé esik 5 pozitív mintával elvégzett hígítási vizsgálat alapján. 10 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A CMV-fertőzés kizárólag a klinikai és a biológiai adatok együttes mérlegelése alapján diagnosztizálható. Egyetlen anti- CMV IgG antitest titer-mérés eredménye nem támasztja alá a citomegalovírus-fertőzés diagnózisát. 11 GYÁRTÓI MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az előállított reagensek minőségügyi rendszerünk előírásainak megfelelően készültek a nyersanyagok beszerzésétől kezdve a késztermék forgalomba kerüléséig. Minden egyes tétel minőségellenőrző vizsgálatokon esett át, és kizárólag a meghatározott jóváhagyási feltételeknek való megfelelés után kerül piacra. Az egyes tételek előállítása és ellenőrzése során készült jegyzőkönyveket a Bio-Rad őrzi. 12 IRODALOM 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J. 1990. Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S753. 2. Demmler G.J. 1991. Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: 315-329. 3. Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A. 1990. The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: 663-667. 4. Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A. 2003. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: 248-253. 5. Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al. 1997. Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: 944-946. 6. Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P. 1998. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: 3540-3544. 8
7. Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L. 2004. A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: 861-863. 8. Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D. 2005. Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: 4713-4718. 9. Revello M.L., Gerna G. 2002. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: 680-715. 10 Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al. 1982. Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306: 945-949. 9
10
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881140 www.bio-rad.com 11