ANYAGCSEREBETEGSÉGEK MIKROVASZKULÁRIS HATÁSA: AZ OXIDATÍV STRESSZ ÉS A NITROGÉN OXID KÖLCSÖNHATÁSÁNAK SZEREPE (EFFECTS OF METABOLIC DISEASES ON MICROVASCULAR FUNCTION: THE ROLE OF OXIDATIVE STRESS AND NITRIC OXIDE INTERACTION) DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI DR. BAGI ZSOLT Semmelweis Egyetem Kórélettani Intézet TÉMAVEZETO: DR. KOLLER ÁKOS SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA Budapest, 2003
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ÉS CÉLKITUZÉSEK A kardiovaszkuláris megbetegedések világszerte komoly népegészségügyi problémát jelentenek, mivel a legtöbb fejlett országban, így hazánkban is ez a betegségcsoport okozza a halálozás legnagyobb hányadát. A korábban már felismert klasszikus vaszkuláris rizikófaktorokon kívül újabb megfigyelések szerint megno a vaszkuláris betegségek kialakulásának kockázata bizonyos szénhidrát és aminosav anyagcserezavarokban. Ezért kutatásainkban az 1. típusú diabetes mellitusban és hyperhomocysteinémiában kifejlodo vaszkuláris elváltozásokat és az azok hátterében álló pathomechanizmusokat vizsgáltuk. A különbözo érrendszeri betegségekben a nagy ereket érinto elváltozások mellett a mikrocirkuláció (arteriola, venula, nyirokér) megváltozott muködése is kialakul, melynek fontos szerepe van a szöveti keringés szabályozásában. Diabetes mellitusban a kisereket érinto microangiopathia miatt kialakuló nephropathia, neuropathia, retinopathia, cerebrális-, kardiálisés alsó végtagi keringési zavarok képezik az ezen betegségben szenvedo betegek fo morbiditási és mortalitási okait. Epidemiológiai vizsgálatok továbbá azt is kimutatták, hogy egyes aminosav anyagcserét érinto elváltozások, mint például a populációs szinten gyakran eloforduló, mérsékelten emelkedett plazma homocystein fokozza a vaszkuláris betegségek kilakulását. Újabb kutatások szerint mindkét anyagcsere betegségben a vaszkuláris endothel funkcionális károsodása figyelheto meg, melynek hátterében álló kórélettani mechanizmusok nem pontosan ismertek. Jelen dolgozatban a diabetes mellitusban és hyperhomocysteinemiában kialakuló kóros érmuködés feltételezett kórélettani mechanizmusait foglalom össze irodalmi adatok alapján, hangsúlyt helyezve a vaszkuláris endothel funkcionális károsodására. Mivel a keringés lokális szabályozásában kiemelkedoen fontos szerepe van a mirovaszkuláris endothelnek, saját kísérletes vizsgálataimban arra kerestem a választ, hogy: 1. Hogyan változik az izolált arteriolák endothel-függo, áramlás-indukálta dilatációja kísérletes diabetes mellitusban és hyperhomocysteinemiában? 2. Milyen kórélettani mechanizmusok állnak a megváltozott endothel muködés hátterében? 3. Van-e szerepe a reaktív oxigén szabad gyököknek az elváltozás létrejöttében? 3
A diabetes mellitusban és hyperhomocysteinemiában kialakuló mikrovaszkuláris endothel funkcionális károsodás pontosabb megismerésével lehetoség nyílik ezen betegségekben a károsodott mikroér muködés megelozésére és specifikus terápiás gyógyítására. 2. MÓDSZEREK 1 típusú diabetes mellitus kísérletes állatmodellje Diabetes mellitus-t a hasnyálmirigy-? -sejt toxin streptozotocin (STZ) egyszeri intravénás adásával idéztük elo hím Wistar patkányokban és kísérleteinket 12 héttel a STZ injekció beadása után végeztük. Hyperhomocysteinemia kísérletes állatmodellje Kísérletes mérsékelt hyperhomociszteinémiát (HHcy) 6 hetes egészséges hím Wistar patkányokon 4 héten keresztüli DL-metionin (1g/tskg/nap) itatással HHcy-t indukáltunk. Izolált mikroértechnika Izolált mikroér kísérleteinket gracilis vázizom arteriolákon (~150? m) végeztük. A belso érátméro változását egy videómikroszkóp-rendszerben mértük. Az áramlás-indukálta dilatáció vizsgálata Kísérletekben kontroll, DM és HHcy állatokból izolált vázizom arteriolák áramlás/nyíróeroindukálta átmérováltozásait vizsgáltuk. Az intraluminális áramlást lépcsozetes emeltük melynek során az egyes áramlás értéket 5-10 percig tartottunk fenn. Arterioláris funkció vizsgálata vazoaktív szerekkel Kísérleteink az izolált vázizom arteriolák válaszait ismert hatásmechanzmusú receptor-mediálta vagy receptor-független vazoaktív farmakonokkal (acetilcholin, calcium ionofor A23187, natrium-nitroprusszid) teszteltük. Enzim gátlók, receptor antagonisták A kísérleti protokollokban a kontroll arterioláris válaszok után az izolált ereket különbözo gátlószerekkel inkubáltuk majd ismételten megfigyeltük az arterioák áramlás és a vazoaktív szerekre kialakuló átmérováltozásait. Szuperoxid anion és hydrogén peroxid eliminálása Kísérleteink egy részében az arteriolákat, a feltételezetten jelenlevo szabadgyökök eliminálása 4
céljából, szuperoxid-dizmutázzal és katalázzal inkubáltuk. Tetrahidrobiopterin (BH 4 ) eloanyag A NOS kofaktor BH 4 szintjének emelése céljából az arteriolákat sepiapterinnel inkubáltuk. 3. EREDMÉNYEK Diabetes mellitus hatása az arteriolák vazoaktív funkcióira A streptozotocin DM patkányoknak a kontrollhoz (6? 1 mm) képest emelkedett volt a szérum glukóz koncentrációja (26? 1 mm) és szignifikánsan kisebb volt a testsúlya. Az DM és kontroll állatok artériás vérnyomása nem különbözött a két csoportban. DM-ban csökken az áramlás-indukálta arteioláris dilatáció 80 Hgmm intraluminális nyomáson a DM arteriolák átméroje szignifikánsan kisebb volt a kontrollhoz viszonyítva. Az arteriolák passzív átméroje nem különbözött a két csoportban. Az intraluminális áramlás lépcsozetes emelése a kontroll arteriolákban dilatációt váltott ki, ami szignifikánsan kisebb volt DM arteriolákban. Az endothel eltávolítása mindkét csoportban teljesen megszüntette az áramlás-indukálta válaszokat. A csökkent áramlás-indukálta dilatáció hátterében az NO hiány áll Kontroll arteriolákban a NO szintézis gátlása L-NAME-vel szignifikánsan csökkentette az áramlás-indukálta dilatációt. Az L-NAME és a prostaglandin szintézis gátló indomethacin együttes inkubációja után az áramlás-indukálta dilatáció teljesen megszunt. DM arteriolákban L-NAME nem befolyásolta az áramlás-indukálta dilatációt, viszont az indomethacin jelenlétében teljesen megszunt. A reaktív oxigén gyökök szerepe az áramlás-indukálta dilatációban A szuperoxid-dizmutázzal (SOD) és kataláz inkubáció nem hatott az áramlás-indukálta dilatációra sem kontroll, sem DM arteriolában. A tetrahydrobiopterin (BH 4 ) szerepe az áramlás-indukálta dilatiációban DM állatok izolált arterioláit sepiapterinnel (BH 4 eloanyaga, ami a salvage útvonalon keresztül emeli a szöveti BH 4 szintet) inkubáltuk, ami szignifikánsan javította az áramlás függo dilatációkat, amit az L-NAME szignifikánsan csökkentett. 5
Na-nitroprusszid-indukálta arteriolás válaszok A direkt NO-donor natrum nitropursszid-okozta dilatáció nem különbözött kontroll és DM izolált arteriolákban, amire sem a sepiapterin sem SOD és kataláz nem volt hatással. Hyperhomcysteinemia (HHcy) hatása az arteriolák vazoaktív funkcióira 4 hetes metionin itatás hatására a patkányok plazmájában háromszoros homocisztein szintemelkedést tapasztaltunk (7? 1 vs. 21? 3? M)). A metionin itatás eredményeképpen szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk az állatok testtsúlyában és a szérum glükóz értékekben. Hhcy emeli a diasztolés és közép vérnyomást A kontrollhoz viszonyítva a HHcy állatoknál nem volt különbség a szisztolés vérnyomás értékekben, de a diasztolés és arteriás középnyomás értékek szignifikánsan nagyobbnak bizonyultak. HHcy-ban az áramlás emelése arterioláris konstrikciót okoz Az izolált vázizom arteriolák 80 Hgmm intraluminális nyomás hatására kialakult passzív (kálcium mentes oldatban mért) és aktív átmérokben nem volt különbség kontrol és HHcy állatokban. Az áramlás emelése dilatációt okozott kontroll arteriolákban, ezzel szemben a HHcy arteriolákban szignifikáns konstrikciót tapasztaltunk. Az endothel eltávolítása megszüntette az áramlás indukálta dilatációt kontroll és az áramlás indukálta konstrikciót HHcy erekben. A HHcy állatok izolált arterioláiban az ugyanakkora áramlás hatására kialakuló maximális nyíróero szignifikánsan nagyobb volt a kontroll értékekhez viszonyítva. HHcy arteriolákban az áramlás-indukálta konstrikciót az NO hiány és fokozott tromboxána 2 közvetíti HHcy arteriolákban a NO szintézis gátlása L-NAME-rel nem volt hatással az áramlás indukálta konstrikcióra, az indomethacin azonban teljesen megszüntette azt. A HHcy arteriolákban az áramlás indukálta konstrikció a TxA 2 /PGH 2 receptor antagonista SQ 29,548 vagy a TxA 2 szintáz inhibitor, a CGS 13,030 jelenlétében teljesen megszunt. A reaktív oxigén szabadgyökök szerepe az áramlás indukálta konstikcióban A SOD és kataláz jelenlétében az áramlás növelése dilatációt eredményezett. A SOD/CAT alkalmazása után adott indomethacin és SQ 29,548 nem befolyásolta az áramlás indukálta dilatációt, amit az L-NAME szignifikánsan csökkentett. 6
HHcy arteriolákban a xantin-oxidáz felelos a fokozott szuperoxid anion termelésért A NADPH-oxidáz gátló diphenilen-idonium nem hatott a HHcy erek áramlás indukálta konstrikciójára. Amennyiben az HHcy ereket oxypurinollal inkubáltuk, az áramlásnövekedés dilatációt okozott, ami megszunt az L-NAME-vel történo együttes inkubáció után. HHcy arteriolákban a peroxinitrit (PON) felelos a fokozott TxA 2 szintézisért és az áramlás indkukálta konstrikcióért A PON dózisfüggoen (10-10 -10-5 mol/l) konstrikciót okozott kontroll arteriolákban ami teljesen megszunt a TxA 2 receptor antagonista SQ 29,548 vagy urátsav jelenlétében. Az urátsav megszüntette az áramlás-indukálta konstrikciót HHcy arteriolákban. 4. MEGBESZÉLÉS Kísérleteink elso részében 1 típusú DM-ban vizsgáltuk a vázizom izolált arteriolák áramláskiváltotta endtothel-függo válaszait. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy az endothel-függo, áramlásnövekedés-kiváltotta arteriolás dilatáció a DM állatok izolált arterioláiban szignifikánsan csökkent mértéku volt. A csökkent mértéku áramlás-indukálta dilatáció DM izolált arteriolákban nem változott a NO szintézis gátlása után, míg teljesen megszünt a prostagladin szintézis gátló indometacin jelenlétében. Ebbol arra következtettünk, hogy a csökkent áramlás-kiváltotta dilatáció hátterében az egyrészt NO-kiváltotta mechanizmus sérülése áll, míg a dilatátor prosztaglandinok áramlás-indukálta felszabadulása megtartott. Az NO-mediálta vaszkuláris dilatáció csökkenése kialakulhat az NO csökkent szintézise, a felszabaduló NO fokozott szuperoxid anion általi lebomlása és az arteriolás simaizom csökkent NO érzékenysége miatt. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a direkt simaizomra ható NO donor, natrium nitroprusszid hatására a két csoportban azonos mértéku dilatáció jött létre, tehát a DM erekben megfigyelheto csökkent NO hatás feltehetoen nem az arteriolás simaizom csökkent NO érzékenysége miatt alakul ki. Kísérletünkben továbbá azt találtuk, hogy az intraluminális SOD és katalázzal történo inkubáció után nem változott a DM arteriolák áramlás-kiváltotta dilatációja. Ebbol arra következtettünk, hogy a csökkent mértéku áramlásindukála dilatációért nem az NO szabadgyökök általi inaktivációja elsosorban a felelos. Irodalmi megfigyelések alapján feltételeztük, hogy DM állatok arterioláiban az NO szintáz 7
csökkent NO termelése jön létre. Ezért feltételeztük, hogy a BH 4 szint farmakológiai emelésével növelni lehet az áramlás-indukálta arteriolás válaszokat DM patkányokban. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a BH 4 prekurzor sepiapterin inkubáció DM arteriolákban szignifikánsan javította az áramlás-indukálta dilatációt. Ezt a hatást a NO szintézis gátlása teljesen megszüntette jelezve, hogy a BH 4 szintjének növelése helyreállítja a NO szintézist. Kísérleteink második részében azt találtuk, hogy a HHcy patkányokból izolált vázizom arteriolákban az intraluminális áramlás emelése a fiziológiás kontroll körülmények között tapasztalt dilatációval ellentétben konstrikciót eredményezett. Az áramlás-kiváltotta konstrikció eredményeként ugyanakkora áramlási értékeknél szignifikánsan nagyobb nyíróero értékeket figyeltünk meg. A rezisztencia erek területén megfigyelt ilyen jellegu, saját kísérleteinkben is tapasztalt érelváltozás szerepet játszhat a HHcy-ban kialakuló emelkedett szisztémás vérnyomás, a magasvérnyomás kialakulásában. Valóban HHcy állatokban szignifikánsan megemelkedett artériás közép és diasztolés vérnyomás. Kísérleteink további részében az áramlás-indukálta konstrikció hátterében álló mechanizmusokat vizsgáltuk. A HHcy patkányokból izolált arteriolákban az NO szintézis gátlása nem hatott az áramlás indukálta konstrikcióra, amit azonban a prosztaglanin szintézis gátló indomethacin, a prosztaglandin H 2 /thromboxana 2 (TxA 2 ) receptor antagonista SQ 29,548 valamint a thromboxana 2 szintáz gátló CGS 13,030 teljesen megszüntetett. Ezen eredményekbol arra következtettünk, hogy a HHcy izolált arteriolákban az ármalás indukálta konstrikció hátterében az NO-mediálta válasz hiánya és a fokozott konstriktor TxA 2 felszabadulás áll. Továbbá, kísérleteink során azt találtuk, hogy HHcy patkányok izolált arterioláiban a szabadgyököket elimináló SOD és kataláz az áramlás indukálta TxA 2 mediált konstrikciót megszüntette, és NO mediált dilatációt hozott létre. Ez arra utal, hogy HHcy állatok izolált mikroereiben az NO szintézis megtartott, azonban a fokozottan termelodo szuperoxid anino reakcióba lép az NO-val csökkentve ezáltal annak biológiai aktivitását. Továbbiákban a vaszkuláris szuperoxid termelés enzimatikus eredetét vizsgáltuk. Kísérleteinkben feltételeztük, hogy HHcy-ban a fokozott szuperoxid termelodést egyes vaszkuláris enzimek megváltozott muködése okozza. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy HHcy arteriolákban a NAD(P)H oxidáz gátló difenil-iodonium nem volt hatással az áramlás indukálta 8
konstrikcióra, azonban a xantin-oxidáz gátló oxypurinol jelenlétében az TxA 2 mediálta áramlás-inukálta konstrikció megszunt, és NO-mediálta diltatációt kaptunk. Kísérleteink eredményeibol ezért arra következtettünk, hogy HHcy arteriolákban a fokozott arteriolás szuperoxid termelodésért a xantin oxidáz fokozott aktivitása a felelos. További kísérleteinkben azt találtuk, hogy kontroll arteriolákban a peroxinitrit (PON) TxA 2 közvetíttette konstrikciót okozott, míg HHcy arteriolákban a PON szintjének urátsavval történo csökkentése megszüntette az áramlás-kiváltotta TxA 2 -mediálta konstrikció, alátámasztva a PON szerepét az áramlás-indukálta konstrikció kialakulásában. Összefoglalva kísérleteink során a vázizom mikroerek endothel-függo, áramlás-kiváltotta vazodilatációjának károsodását figyeltük meg két eltéro etiológiájú anyagcserebetegség állatkísérletes modelljében. Irodalmi adatok alapján mindkét kórállapotban a vaszkuláris endothel funkcionális károsodását feltételezik, melynek kialakulásában fontos szerepet tulajdonítanak az ezen betegségekben jelenlévo oxidatív stressznek. Kísérleteink során azt találtuk, hogy mind DM-ban, mind HHcy-ban károsodik a mikroerek endothel-függo áramláskiváltotta, NO-medálta dilatációja. A károsodott NO-mediálta dilatáció hátterében úgy tunik, hogy az oxidatív stressznek központi szerepe van, melynek mechanizmusai eltérnek a két vizsgált kórállapotban. Míg HHcy-ban a NO szintézis megtartott, de a felszabadult NO inaktiválódik a fokozott vaszkuláris szuperoxid termelés miatt, ami a peroxinitrit termelodés révén arterioláris TxA 2 közvetítette konstrikciót okoz, addig DM-ban a NOS kofaktorának, a BH 4 -nek -feltételezhetoen- in vivo oxidatív károsodása miatt csökken az NO termelés. Kísérleteink eredményei alapján feltételezzük, hogy a vázizom rezisztencia ereinek csökkent mértéku áramlás-indukálta dilatációja a lokális keringésszabályozó folyamatok károsodása révén szerepet játszhat a DM-ban, HHcy kialakuló perifériás keringési zavarok kialakulásában. Másrészrol, kísérleteink felvetik azt a hipotézist, hogy a DM-ban és HHcyban kialakuló mikrocirkulációs károsodások megelozésében szerepe lehet az olyan specifikus terápiának, amely az oxidatív stressz csökkentése révén- és/vagy a celluláris BH 4 szintet helyreállításával javítja a NO-közvetítette lokális keringésszabályozó mechanizmusokat, csökkentve ezáltal az ezen betegségekben kialakuló perifériás keringési zavarok miatt kialakuló morbiditást és mortalitást. 9
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények 1. Bagi Z., Koller A. Lack of NO-mediation of flow-dependent arteriolar dilation in diabetes mellitus is restored by sepiapterin. J. of Vasc Research 40: 47-57, 2003. (IF: 1,914) 2. Bagi Z, Ungvari Z, Szollar L, Koller A. Flow-induced constriction in arterioles of hyperhomocysteinemic rats is due to impaired nitric oxide and enhanced thromboxane A(2) mediation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21(2):233-7. 2001. (IF: 5,816) 3. Bagi Z, Ungvari Z, Koller A. Xanthine oxidase-derived reactive oxygen species convert flow-induced arteriolar dilation to constriction in hyperhomocysteinemia: possible role of peroxynitrite. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22(1):28-33. 2002. (IF: 5,816) 4. Ungvari Z, Sarkadi-Nagy E, Bagi Z, Szollar L, Koller A. Simultaneously increased TxA(2) activity in isolated arterioles and platelets of rats with hyperhomocysteinemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20(5):1203-8. 2000. (IF: 5,111) 5. Szollár L., Koller A., Bagi Zs. Kórélettani mechanizmusokon alapuló egészségmegorzés lehetoségei az atherosclerosishoz vezeto hyperhomocysteinemiában. Az egészség fenntarthatósága /szív-érrendszeri betegségekben/ kiadó: Minerva plusz, Debrecen pp. 30-47. 2003. [ISBN: 963 204 859 8] Egyéb közlemények 6. Pacher P, Bagi Z, Lako-Futo Z, Ungvari Z, Nanasi PP, Kecskemeti V. Cardiac electrophysiological effects of citalopram in guinea pig papillary muscle comparison with clomipramine. Gen Pharmacol. Jan;34(1):17-23. 2000. (IF: 1,140) 7. Ungvari Z, Csiszar A, Bagi Z, Koller A. Impaired nitric oxide-mediated flow-induced coronary dilation in hyperhomocysteinemia: morphological and functional evidence for increased peroxynitrite formation. Am J Pathol. 161(1):145-53. 2000. (IF: 7,103) 8. Kecskemeti V, Bagi Z, Pacher P, Posa I, Kocsis E, Koltai MZ. New trends in the development of oral antidiabetic drugs. Curr Med Chem. 9(1):53-71. 2002. (IF: 5,760) 9. Magyar J, Banyasz T, Bagi Z, Pacher P, Szentandrassy N, Fulop L, Kecskemeti V, Nanasi PP. Electrophysiological effects of risperidone in mammalian cardiac cells. Naunyn 10
Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366(4):350-6. 2002. (IF: 2,472) 10. Koller A, Bagi Z. On the role of mechanosensitive mechanisms eliciting reactive hyperemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283(6):H2250-9. 2002. (IF: 3,369) 11. Bagi Z, Hamar P, Antus B, Rosivall L, Koller A. Chronic Renal Failure Leads to Reduced Flow-Dependent Dilation in Isolated Rat Skeletal Muscle Arterioles due to Lack of NO-mediation. Kidney and Blood Pressure Research. 26(1):19-26. 2003. (IF: 1,885) 12. Bagi Z, Koller A, Kaley G. Superoxide-NO Interaction Decreases Flow- and Agonist- Induced Dilation of Isolated Coronary Arterioles of Mice with Type 2 Diabetes Mellitus. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285(4):H1404-10. 2003. (IF: 3,369) 13. Bagi Z, Cseko C, Toth E, Koller A. Oxidative Stress-Induced Dysregulation of Arteriolar Wall Shear Stress in Hyperhomocysteinemia is Prevented by Vitamin-C treatment. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003 July 17 [Epub ahead of print] (IF: 3,369) 14. Bagi Z, Koller A, Kaley G. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-{gamma} Activation Increases NO Bioavailability in Coronary Arterioles in Type 2 Diabetes by Reducing Oxidative Stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003 Oct. 9 [Epub ahead of print] (IF: 3,369) Referált tudományos folyóiratban megjelent és közlésre elfogadott közlemények összesített impact faktora: 50,493 KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Köszönöm a Semmelweis Egyetem Kórélettani Intézet munkatársainak, kiemelten Szollár Lajos Professzor Intézet Igazgató Úrnak, hogy a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola keretében végzett munkámat mindenkor támogatták. Külön köszönetet mondok témavezetomnek Koller Ákos Professzor Úrnak a munkámhoz nyújtott pótolhatatlan segítségéért. Köszönettel tartozom még Kecskeméti Valéria Professzor Asszonynak és Papp Zoltán Docens Úrnak, akik tudományos pályafutásom elinditásában kiemelkedoen fontos szerepet játszottak. 11