Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola 2/1 program

Átírás

1 Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola 2/1 program Szabadgyökök szerepe a kísérletes diabetes mellitus késoi szövodményeinek kialakulásában patkányon Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Stadler Krisztián Témavezetok: Dr. Jakus Judit és Dr. Somogyi Anikó MTA Kémiai Kutatóközpont Biomolekuláris Kémiai Intézet Biooxidációs csoport és Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Budapest, 2004

2 BEVEZETÉS A cukorbetegség (diabetes mellitus) egyike azoknak a kórképeknek, amelyek napjainkban fontos egészségügyi problémának számítanak, különös tekintettel a fejlett országokra. A diabetológia fontosságát támasztják alá azok a statisztikák, melyek szerint a cukorbetegek száma világszerte emelkedik. Az ismert cukorbetegek számát Magyarországon ma már legalább félmillióra becsüljük: ez azt jelenti, hogy az utóbbi húsz évben a betegek száma megkétszerezodött. Ma már a betegek életminoségét és életkilátásaikat elsosorban nem maga a cukorbetegség és az orvos által esetlegesen rosszul beállított szénhidrát-anyagcsere miatt fellépo hipo-, vagy hiperglikémia veszélyezteti, hanem a hosszú évek alatt kialakuló késoi szövodmények. Ezek közé tartoznak elsosorban a különbözo szív- és érrendszeri szövodmények, pl. a szívhipertrófia, az érelmeszesedés, a mikrovaszkulatúra muködésének romlása miatt bekövetkezo retinopathia, cataracta, nephropathia, valamint az autonóm neuropathia és a gasztrointesztinális rendszer különbözo fekélyei. Az utóbbi évtizedben számos kísérleti eredmény utal arra, hogy a szénhidrát-anyagcsere zavara során oxidatív stressz alakul ki. Bizonyítottnak tunik a szabadgyökök részvétele a cukorbetegség progressziójában, de a késoi szövodmények kialakulásában szerepük a mai napig vitatott. Nem világos például, hogy a gyökök a komplikációk okozói vagy következményei. Fontos kérdés lehet a különbözo gyökök idobeni megjelenése egyes a szövodmények által érintett szervekben, különösen a betegség korai szakaszában, még a szövodmények kialakulása elott. Doktori munkámmal a diabetes késoi szövodményei és a szabadgyökös reakciók között valószínusített ok-okozati összefüggés 2

3 feltárásához kívántam közelebb jutni és új adatokkal szolgálni. Külön hangsúlyt igyekeztem fektetni a nitrogén monoxidra és annak szerepére, a szövodményekkel kapcsolatos lehetséges hatásaira és hatásmechanizmusára, tekintettel az úgynevezett nitrozatív stressz diabetesben még feltáratlan voltára. CÉLKITUZÉSEK 1. Munkánkban különbözo szabadgyökök szintjének idobeni változását kívántuk követni streptozotocin-indukált diabeteses patkány szerveiben, foként közvetlen mérési módszerekkel, a betegség kialakulása után az ido elorehaladtával különbözo korai idopontokban. Kérdéses volt, hogy mely szervekben változik a szabadgyökös egyensúly és hogyan viszonyul egymáshoz a gyökök megjelenése idoben. Különös figyelmet szenteltünk a nitrogén oxidnak, melynek szerepe diabetesben nem világos, és az oxidatív stressz során belole képzodo reaktív peroxinitrit anionnak. 2. Szövettani vizsgálatokkal szerettük volna eldönteni azt, hogy a makroszkópikus hisztopatológiai elváltozások a szabadgyökös változásokhoz képest idoben mikor jelentkeznek, vagyis hogy lehetnek-e a szabadgyökök akár okozói is a késoi szövodményeknek. 3. Vizsgálni kívántuk azt, hogy specifikus vegyületekkel, pl. a nitrogén monoxidot termelo NOS enzimek (foleg az inos) inhibítorával, aminoguanidinnel való kezelés hogyan hat a diabetes anyagcsere- és oxidatív stressz paramétereire. Kérdés volt, hogy az esetlegesen kialakuló szövodmények visszaszorításában pozitív hatású lehet-e egy ilyen szer és 3

4 ha igen, milyen mechanizmuson keresztül hat. A NOS gátlóval történo kezelést a szokványos inzulinkezelés hatásaival kívántuk összehasonlítani. 4. A kísérleti adatokra támaszkodva elméleti számításokkal, számítógépes szimulációval is szerettük volna ellenorizni azt, hogy diabetesben jelentkezo oxidatív stresszben különös tekintettel a kardiovaszkuláris rendszerre lejátszódhat-e valóban a rendkívül reaktív peroxinitritet képzo reakció és ez milyen mechanizmussal történhet. MÓDSZEREK - Állatmodell: kísérleteinket streptozotocin-indukálta diabeteses patkánymodellen végeztük. Vizsgálatainkhoz hím, albíno, átlagosan g testtömegu Wistar patkányokat használtunk A cukorbetegséget intravénás streptozotocin injekcióval indukáltuk. A kísérletekhez az állatokat random módon osztottuk be az alábbi csoportokba - minden csoportba 6-8 állat került: - kontroll, - diabeteses, illetve egy következo kísérletsorozatban 4

5 - kontroll, kezeletlen, - kontroll aminoguanidin kezeléssel (1 g/l koncentrációban az ivóvízben 3 héten keresztül), - diabeteses, nem kezelt, - diabeteses, napi egyszeri ultratard inzulinnal kezelt - diabeteses, aminoguanidinnel kezelt. - Reaktív speciesek mérése: az oxidatív stressz meglétének közvetlen bizonyítására ESR spektroszkópiát alkalmaztunk spincsapda ill. spinpróba technikával a patkányszervek cseppfolyós nitrogénben történo fagyasztásával kombinálva, a diabetes különbözo idopontjaiban. A nitrogén monoxid meghatározására vas-dietil-ditiokarbamát spincsapdát, az oxigén-centrumú gyökökre 3-karbamoil-proxil spinpróba-vegyületet használtunk. A reaktív peroxinitrit mérésére egy luminol-függo kemilumineszcenciás technikát használtunk. - Az oxidatív stressz markereinek meghatározása: a fehérjekárosodást igazoló protein karboniláció mértékét fotometriás módszerrel határoztuk meg. A szénhidrát-anyagcsere jellemzo paramétereit HbA1c, fruktózamin laboratóriumi kittel illetve fotometriásan mértük. - Egyéb mérések: Fénymikroszkópos szövettani vizsgálatokat végeztünk különbözo festési eljárásokkal. A szívhipertrófia mértékére a szívsúlyok összehasonlításából következtettünk. A peroxinitrit keletkezésének igazolására számítógépes szimulációt végeztünk a KINAL program segítségével. 5

6 - Az eredmények statisztikai értékelése a STATISTICA programcsomaggal történt, az adatok eloszlásától függoen paraméteres Student-féle kétmintás t-próbával, vagy nem paraméteres Mann-Whitney U-teszttel. EREDMÉNYEK, LEGFONTOSABB TÉZISEINK 1. Felgyorsult oxidatív folyamatokra jellemzo markerek (protein karboniláció, korai glikációs termékek) változását és a szabadgyökös egyensúly megbomlását mutattuk ki patkányokban a streptozotocinindukálta diabetes korai fázisában, két-három héttel a betegség indukciója után. A legmarkánsabb változásokat három héttel a betegség kezdete után figyeltük meg a diabeteses májban, vesében és érfalban, ahol különösen a nitrogén monoxid termelodés fokozódását igazoltuk. 2. Megállapítottuk, hogy az együttesen indukálódott magas nitrogén monoxid szint és a fokozott oxidatív stressz miatt nagy mennyiségu peroxinitrit anion képzodik a diabeteses aortában. 3. Munkánkban elsoként mutattuk ki direkt mérési módszerekkel a nitrogén monoxid és a reaktív peroxinitrit idobeni változását experimentális patkány diabetesben a hasonló korú kontrollokhoz viszonyítva. Igazoltuk, hogy az egészséges állatok aortájában idosebb korban szitén megnövekszik az nitrogén monoxid és a peroxinitrit termelés. Ez arra utal, hogy kóros szénhidrát-anyagcserében felgyorsul az öregedési folyamat patkányokban. 4. Megállapítottuk, hogy a fokozott szabadgyök-termelodés és az oxidatív stresszre jellemzo biokémiai reakciók megelozték a fénymikroszkópos 6

7 módszerrel igazolható, késoi szövodményekre jellemzo szövettani elváltozásokat. Bár ez nem bizonyítja, de továbbra sem zárható ki, hogy a szabadgyökös folyamatok szerepet játszanak a késoi szövodmények kialakulásában. 5. Kimutattuk, hogy három hét diabetes után azokban a szervekben, ahol magas nitrogén monoxid illetve peroxinitrit szint volt igazolható, mind az ultratard inzulinnal, mind az aminoguanidinnel történo kezelés sikeresen csökkenti a reaktív nitrogén termékek szintjét, de feltehetoleg más-más mechanizmuson keresztül. (Kivételt képez a szív, ahol nem volt változás a nitrogén monoxid szintjében, tehát a szívhipertrófia valószínuleg nem hozható össze a nitrogén monoxid koncentráció változásával). 6. Megállapítottuk, hogy az aminoguanidin kezelés kivédi a diabetesben jelentkezo szívhipertrófiát, míg az inzulinkezelés nem. A protektív hatás mechanizmusa valószínuleg a protein karboniláció és a glikáció gátlásán keresztül történik, mert míg az aminoguanidin csökkentette a szívben a fehérjekarbonilációt, addig az inzulin nem. 7. Megállapítottuk, hogy míg az inzulin a diabeteses patkányok szénhidrátanyagcsere paraméterein javít, addig az aminoguanidin (és feltehetoleg a kevésbé toxikus származékai is) a glikációs termékek kialakulását gátolják, így kombinált használatuk akár új terápiás lehetoségét is jelentheti a diabetes egyes késoi szövodményeinek. 7

8 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK 1. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, G von Bölcsházy, J Jakus. Increased nitric oxide levels as an early sign of premature aging in diabetes. Free Radic. Biol. Med. 35: , (IF: 5,533) 2. Stadler K, Jenei V, von Bölcsházy G, Somogyi A, Jakus J. Szabadgyökök és reaktív nitrogén speciesek szerepe a diabetesz késoi szövodményeinek kialakulásában patkányban. Orv. Hetil. 141(21): , (IF: 0) 3. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Beneficial effects of aminoguanidine on the cardiovascular system of diabetic rats. Diabetes Metab. Res. Rev (közlésre elfogadva) (IF: 2,472). 4. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Aminoguanidin kezelés pozitív hatása a peroxinitrit termelodésre és szívhipertrófiára streptozotocinindukálta diabeteses patkányokban. Orv.Hetil (közlésre elfogadva, IF: 0) 5. A Németh, K Stadler, J Jakus. Computational and experimental studies on ex vivo peroxynitrite formation in diabetic rat aorta. Chem. Res. Toxicol (közlésre benyújtva) AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT IDÉZHETO ELOADÁSKIVONATOK 1. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Possible role of nitric oxide and peroxynitrite in early diabetic tissue damage: a time-course study. Free Radic. Biol. Med. 31 (S1): S73,

9 2. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Aminoguanidine prevents cardiac hypertrophy and peroxynitrite production in diabetic rats. Free Radic. Biol. Med. 36 (S1): S111, EGYÉB TUDOMÁNYOS KÖZL EMÉNYEK 1. A Szarka, K Stadler, V Jenei, É Margittai, M Csala, J Jakus, J Mandl, G Bánhegyi. Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation on rat liver endoplasmic reticulum. J. Bioenerg. Biomembr. 34(4): , (IF: 2,920) 2. K Balogh, K Stadler, M Mézes, M Erdélyi, M Weber. Effect of selenium overdose on free radical level and glutathione redox system in chicken. In: Cser MA, Sziklai LI, Étienne JC, Maymard Y, Centeno J, Khassanova L, Collery P. (eds.): Metal Ions in Biology and Medicine 8: John Libbey Eurotext, Paris, AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN TARTOTT FONTOSABB ELOADÁSOK, POSZTEREK 1. K Stadler, V Jenei, G Simon, J Jakus. Use of DETC complexes in measurements of nitrosyl radical and copper(ii) in diabetic tissues. 6 th International Symposium on Spin Trapping, augusztus 27-31, Marseille, Franciaország. 2. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Diabetes szövodményeinek korai szabadgyökös markerei. Magyar Szabadgyök Kutató Társaság I. Kongresszusa, április 5-7, Pécs. 9

10 3. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Nitrogén-oxid feltételezett szerepe korai szövetkárosodásban diabetes mellitusban. Magyar Szabadgyök Kutató Társaság munkaértekezlete, október 24, MSD Centrum, Budapest. 4. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Possible role of nitric oxide in early diabetic tissue damage: a time course study. 8 th Annual Meeting of the Oxygen Society, november 15-19, Research Triangle Park, North Carolina, USA. 5. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Nitrogén oxid és peroxinitrit szerepe korai szövetkárosodásban diabetes mellitusban. Magyar Diabetes Társaság XVI. Kongresszusa, május 30 június 2, Debrecen. 6. K Stadler, V Jenei, A Rockenbauer, J Jakus. Use of dit hiocarbamate-no complexes in animal tissues. 7th International Symposium on Spin Trapping, július 7-11, Chapel Hill, North Carolina, USA. 7. K Stadler, V Jenei, J Jakus. inos inhibitor counteracts cardiac hypertrophy and peroxynitrate overproduction in diabetic rats. Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health szeptember 21-26, Szmolenszk, Oroszország. 8. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Az aminoguanidin kezelés kivédheti a szívhipertrófiát és a vaszkuláris peroxinitrit túltermelodést diabeteses patkányokban. Magyar Diabetes Társaság XVII. Kongresszusa, április 22-25, Tihany. 9. K Stadler, V Jenei, A Somogyi, J Jakus. Aminoguanidine prevents cardiac hypertrophy and peroxynitrite production in diabetic rats. SFRR XII. International Meeting, május 5-9., Buenos Aires, Argentína. 10. Stadler K, Jenei V, Somogyi A, Jakus J. Aminoguanidin kezelés hatása a peroxinitrit termelodésre és szívhipertrófiára streptozotocin-indukálta 10

11 diabeteses patkányokban. Magyar Szabadgyök Kutató Társaság munkaértekezlete, május 21., MSD Centrum, Budapest. 11