Bakteriális identifikáció 16S rrns gén szekvencia alapján MOHR ANITA SIPOS RITA, SZÁNTÓ-EGÉSZ RÉKA, MICSINAI ADRIENN 2100 Gödöllő, Szent-Györgyi Albert út 4. info@biomi.hu, www.biomi.hu
TÖRZS AZONOSÍTÁS Morfológia+Biokémia Biokémiai tesztek Gram festés Még mindig a fajleírás alapvető kritériuma Időigényes Labor intenzív Gyors identifikálás, automatizálás API VITEK Atípusos törzsek esetében nehézségek A biokémiai tulajdonságok nem mindig tükrözik a genetikai leszármazást (pl.: laterális géntranszfer)
TÖRZS AZONOSÍTÁS MALDI Biotyper Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight Tömegspektrometria 1991: első MALDI TOF tömeg spektrométer 2008: első MALDI Biotyper Rendszer Gyors Azonosítás faj ill. genus szinten Fehérje-spektrum (16S riboszómák) Laborok közötti kompatibilitás hiánya Adatbázis (2000-3000 db) Nem validált rendszer
TÖRZS AZONOSÍTÁS DNS-DNS hibridizáció Molekuláris Biológia Teljes genom összehasonlítása GOLD STANDARD Fajleíráshoz szükséges Definitív ( 70%; 5 C Tm) Költséges Megbízható Reprodukálható Labor-intenzív Nehezen elérhető (egyre kevesebb laborban végzik)
TÖRZS AZONOSÍTÁS Molekuláris Biológia 16s riboszómális RNS gén meghatározás Minden baktériumban van (sőt!) Optimális méret (1500bp): Még vizsgálható Elegendő információt hordoz Gyors (1-2 nap) Laborok közötti kompatibilitás Kiterjedt adatbázis Reprodukálható Nehezen definiálható Validált rendszere: MicroSeq Identification Systems (Lifetech)
A MOLEKULÁRIS ÓRÁK A molekuláris óra elmélete Molecules as documents of evolutionary History J. Theoret. Biol. (1965) 8 357-366 E. Zuckerkandl, L. Pauling A fehérjék változása az evolúció során időben egyenletes Ha ismerjük két faj ugyanazon fehérjemolekulái közötti különbséget meghatározható az elválás időpontja Riboszómális struktúrák az élővilágban
A MOLEKULÁRIS ÓRÁK Az élet fája A Molecular View of Microbial Diversity and the Biosphere Norman R. Pace Science (1997) Vol. 276 pp. 734-740
A 16S rrns gén 0 bp 510 bp 1010 bp 1500 bp V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 A variabilitás >50% Konzervatív és variábilis régiók (9 db) Polimorfizmusok Kópiaszám Hossz-heterogenitás
A MÓDSZER ELVE Baktérium szuszpenzió Sejtek összegyűjtése Nukleinsav (DNS) kivonás Azonosítás Adatbázisokban Szekvenálás Sanger, 1977 16S rdns Amplifikálás Mullis, 1983
A 16S rrns gén Azonosítás: >90%-ban genus szinten 65-83%-ban faj szinten 1-14%-ban nem azonosítható Ajánlott Definíció: Minimum >99% hasonlóság (ideális: >99,5%) Ellenőrzött típustörzs vagy referencia törzs szekvenciához Teljes hossz vizsgálata Genus Valid fajok száma Microseq adatbázisban található fajok % % Fajok közötti távolság <3% % Fajok közötti távolság <1% Átlagos fajok közötti távolság % Bacillus 76 77 3 1 8 Pseudomonas 71 70 21 2 3 Listeria 6 100 67 60 2 Acinetobacter 7 100 62 0 3 Edwardsiella 4 75 100 100 0,5 Shigella 4 100 100 50 0,9 Impact of 16S rrna gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Jill E. Clarridge, Clin Microbiol Rev. 2004 October; 17(4): 840 862.
ADATBÁZISOK Ingyenes, mindenki számára elérhető Egyre növekvő számú adat Ellenőrzött?? Hibás szekvenciák (szekvenálási hibák, kimérák) >90 000 Leírt fajok és 16S rdns szekvenciák számának változása SILVA adatbázisban > 2 000 000 > 39 000 The All-Species Living Tree project: a 16S rrna-based phylogenetic tree of all sequenced type strains. Yarza P, Richter M, Peplies J, Euzeby J, Amann R, Schleifer KH, Ludwig W, Glöckner FO, Rosselló-Móra R. Syst Appl Microbiol. 2008 Sep;31(4):241-50. > 3 000 000
ELŐNYÖK - HÁTRÁNYOK Előnyök: Gyors Megbízható Reprodukálható Könnyen vizsgálható Kiterjedt adatbázis (legnagyobb) Laborok közötti kompatibilitás (nyersadat) Módszer- és adatbázis validált változata: Microseq (B:1400 +F:900) Hátrányok: Felbontás ( Kritikus csoportok ) Faj: 65-83% Genus: 90% Adatbázis hibák ( hibás típustörzsek) Definíció hiánya (adatelemzés különbözhet laborok között) Heterogenitás (kópiaszám, polimorfizmus)
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!