ELTE Biológia Doktori Iskola Klasszikus és molekuláris genetika program Programvezető: Dr. Orosz László, MTA levelező tagja BAROMFIPESTIS VÍRUS (NDV) GENOTÍPUSOK FILOGENETIKÁJA ÉS EVOLÚCIÓJA Doktori értekezés tézisei Czeglédi Alíz Témavezető: Dr. Lomniczi Béla, állatorvostudomány doktora MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete Budapest 2007
2 Tudományos előzmények A baromfipestis (hivatalos nevén Newcastle disease, ND vagy nálunk Newcastlebetegség) a tyúkfélék, akár 100%-os mortalitással járó, járványos formában fellépő betegsége. Óriási kártétele miatt a XX. században a baromfi legfontosabb betegsége volt, de hála az 1950-es évektől elterjedt hatékony tömegvakcinázásoknak, az okozott veszteségek fokozatosan csökkentek, a baromfihús-termelés pedig rentábilissá vált. Ennek köszönhetően a háború előtti 1 milliárdról 20 milliárdra futott fel a baromfilétszám. Azonban az un. fejlődő országokban az iparszerű és háztáji tartás integrálódásának körülményei között a vakcinázás önmagában nem volt elég a fertőzés eliminálásához, ennek következtében napjainkra a világ 140 országából 80-ban állandósult a járványtörzsek jelenléte. Pl., a világtermelés felét produkáló 19 kelet-ázsiai országban (Japán kivételével) endémiás (www.oie.int), és egy részük húst exportál. Ezzel szemben a fejlett országok nagy része tartja magát a régi koncepcióhoz: nemcsak a betegséget, de a kórokozót sem tűrik meg, és intenzív védekezéssel (olcsó vakcinázás + drága eradikáció) ezt el is érik. Csakhogy nem tartósan. A fertőzés veszélyének globális jellegét jelzi, hogy az elmúlt évtizedben 30, NDV-mentesnek számító országba egy vagy többször is behurcoltak számukra egzotikus törzseket. A megelőző évtizedben témacsoportunk tárta fel, hogy az elmúlt 80 évben, a világ különböző területein előfordult NDV-járványok törzsei 9 genotípusba (és további altípusokba) sorolhatók (Lomniczi és Czeglédi, 2005). Annak ellenére, hogy az NDV rendkívül kontagiózus, a csoportok előfordulása feltűnően területspecifikus volt, és ami még érdekesebb, jellegzetes időbeli megoszlást mutattak. A régiek [II.-IV. genotípus és a Herts 33(W)], amelyek már a háború előtt okoztak járványokat, a 60-as évektől fokozatosan átadták helyüket az újabbaknak (V.-VIII.-nak). Egy jó évtizede pedig a Kínából kiinduló VII. genotípus változatai hódítanak világszerte, és most már Európában is évek óta fel-felbukkan valamelyik altípusa. Ellentmondásnak látszik, hogy az újabb vírusok elterjedése a vakcinázási korszakra esik, azonban kísérleti fertőzések során kiderült, hogy ezek olyan fokú immunitást áttörő képességgel rendelkeznek, ami megmagyarázza evolúciós sikerüket. Gyakorlatilag az történt, hogy klinikailag védett (ezért rejtetten fertőzött) csirkék tartják fenn a vírus fertőzési láncát, vagyis az immunizált baromfipopulációk a virulens törzsek rezervoárjává váltak. Ha tisztán ökológiai szempontból vizsgáljuk az NDV-törzsek előfordulását, azt látjuk, hogy létezik a vírus-gazda viszonynak egy ősi állapota is, amelynél a primitív (és ártalmatlan) vírusok szabadon élő vízimadarakban élnek. Ám a primordiális rezervoárban eddig mindössze
3 két olyan genetikai vonal létezésére derült fény, amelyekben primitív vírusok vannak: az egyik a class I-jelű főcsoport, a másik az I. genotípus (a class II-jelű főcsoportban, amelyhez egyébként valamennyi, fent említett genotípus is tartozik). Vannak még avirulens törzsek a II. genotípusban is, bár ezek csak a másodlagos gazdákban, azaz csirkében éltek, mégpedig velük genetikailag közeli rokon virulens törzsekkel együtt. Minthogy közvetlen bizonyítékok vannak arra, hogy az NDV virulens törzsei avirulens törzsekből keletkeztek, azt követően, hogy azok kolonizálták a csirkét (1998-ban, Ausztráliában ez a szemünk előtt játszódott le), valószínűsíthető, hogy a régi, virulens genotípusok ilyen kétfázisú, de egymástól független evolúciós utat jártak be. Azonban olyan nagy az aszimmetria a virulens genotípusok javára, hogy fel kell tételezni, virulens genetikai vonalak nemcsak ezen a tradicionális, de hosszadalmas módon keletkezhettek, hanem van ennek egy sokkal hatásosabb módja is, ha a körülmények úgy hozzák.
4 Célkitűzések 1) NDV-törzsek filogenetikai analízise baromfipestis-járványok lefolyásának és változásainak jellemzésére: 1a) járványvonulatokat fenntartó leszármazási vonalak (genotípusok és altípusok) időbeli megjelenésének és váltási dinamikájának vizsgálata a négy évtizedet átfogó bulgáriai törzsgyűjtemény felhasználásával; 1b) vírustörzsek változási tempójának meghatározása genetikailag körülhatárolt járványvonulatokban, és az adatok alkalmazása a baromfipestis (Newcastlebetegség) európai megjelenésének meghatározásához; 1c) régi vakcina-törzsek előállításáról szóló leírások genetikai módszerrel történő ellenőrzése. 2) NDV-törzsek és csoportok között feltárt rokonsági viszonyok alátámasztása a többi öt gén filogenetikai analízisével: 2a) reprezentatív törzsek különböző génszekvenciáiból álló adatbázis létrehozása; 2b) az egyes génfák összehasonlítása annak megállapítására, hogy a fúziós fehérje (F) génjével korábban feltárt genetikai csoportokat (genotípusok és altípusok) a többi génfa reprodukálja-e; 2c) az egyes gének egymáshoz viszonyított divergenciájának vizsgálata annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a belső fehérjéket kódoló gének konzervatívabbak, mint a szelekciónak (jobban) kitett felszíni fehérjéket kódoló gének; 2d) a hat gén filogenetikai analízise lehetőséget ad annak megvizsgálására is, hogy előfordulhat-e rekombináció a negatív polaritású, folyamatos szálú RNS-genomot tartalmazó NDV-nél. 3) Az NDV genotípusok feletti genealógiai viszonyok vizsgálata: szekvencia analízisek, filogenetikai jegyek és ökológiai kapcsolatok összehasonlító értékelése virulens genotípusok keletkezésének és túlreprezentáltságának magyarázatára.
5 Anyag és módszer Vírustörzsek, szaporításuk és fenntartásuk A vírustörzsek az MTA Állatorvos-tudományi Kutatóintézetében Lomniczi Béla által fenntartott gyűjteményből származnak, szaporításuk és fenntartásuk a Czeglédi és mtsai (2002) cikkben leírtak szerint történt. Vírus RNS kivonás, reverz transzkripció (RT) Az alkalmazott módszer részletes leírását a Czeglédi és mtsai (2002) publikáció tartalmazza. Primerek tervezése, polimeráz láncreakció (PCR) A vizsgálatainkhoz kiválasztott vírustörzsek esetén mind a hat gén (3 -NP-P-M-F-HN- L-5 ) kódoló régiójának, valamint az NP gén 5 végén található nem kódoló régiójának kb. 400 nt hosszú szakaszát erősítettük fel. A PCR kivitelezéséhez szükséges primereket az EMBL/GenBank adatbázisban található szekvenciák alapján terveztük az OLIGO 5.0 program segítségével. A PHY-LMV42/66 vakcina törzs teljes genomjának amplifikálása RT-PCR révén A tisztított genom RNS-ről specifikus primerekkel három részlegesen átfedő cdns-t, majd specifikus primer párok felhasználásával három részlegesen átfedő PCR terméket készítettünk. A cdns-ek és a PCR termékek a 3 és az 5 vég kivételével a teljes genomot magukban foglalták. A genom végeit 3 ill. 5 RACE módszerekkel amplifikáltuk. Az RT- PCR, valamint a 3 - és 5 RACE reakciók leírása megtalálható a Czeglédi és mtsai (2006) cikkben. A felerősített termékek tisztítása és klónozása Az NP gén nem kódoló régióját, valamint a PHY-LMV42/66 vakcina törzs teljes genomját magában foglaló PCR termékeket tisztítottuk és szekvenáló plazmidba klónoztuk. Az alkalmazott módszer leírását a Czeglédi és mtsai (2006) publikáció tartalmazza. Szekvenálás A bérszekvenálás a német Genotype GmbH (Hirschhorn, Németország) cégnél történt ABI 370 HT sequencer (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany) típusú automata DNS szekvenálón. A PHY-LMV42/66 vakcina törzs teljes genomjának meghatározása a szekvenáló plazmidokban megtalálható univerzális primerhelyekről (M13f, M13r) indult, majd a primer-walking technikával folytatódott, a művelet pontossága 99,9% volt. Szekvencia- és filogenetikai analízis A szekvenciák szerkesztése a BioEdit v.7.0.0 és az EditSeq, illesztése pedig a ClustalW algoritmust alkalmazó MegAlign programmal történt. A távolság alapú filogenetikai fák
6 elkészítéséhez a távolság-mátrixon alapuló neighbor-joining módszert alkalmaztuk, Kimuraféle két-paraméteres korrekciós számítással kiegészítve (TREECON for Windows v.1.3b, MEGA v.2.1). A vizsgált génrégiókra jellemző átlag távolságértéket a MEGA v.2.1 programmal határoztuk meg, illesztett nukleotid és származtatott aminosav szekvenciák esetén is. A karakter alapú filogenetikai fák elkészítéséhez a megfelelő nukleotid szubsztitúciós modellt a Modeltest v.3.06 programmal választottuk ki, a leszármazási viszonyokat pedig a PAUP* v.4.0b10 programmal rekonstruáltuk. A kapott filogenetikai fákat a TreeView v.1.5 programmal szerkesztettük. Mind a távolság, mind pedig a karakter alapú eljárásokkal létrehozott filogenetikai fák megbízhatóságát az un. bootstrap analízissel ellenőriztük.
7 Eredmények összefoglalása A baromfipestis vírus (NDV) molekuláris genetikai vizsgálatával az alábbi új eredményeket értük el. 1) Számos NDV törzs fúziós fehérje (F) génjének részleges szekvencia analízisét végeztük el epidemiológiai kapcsolatok és jelenségek megismerése céljából. Legintenzívebben a Bulgáriából származó, közel négy évtizedet felölelő törzsgyűjtemény analízisében vettem részt. a) A bulgáriai komplex (többszörös etiológiájú) járványok NDV-törzsei időbeli előfordulásának elemzésével megerősítettem, hogy az F gén variábilis régiójának evolúciós változásának üteme 1%/évtized. b) A régi európai (EU) törzsekből álló, IV. genotípus genetikai struktúrájának elemzésével megállapítottam, hogy a háború után legalább 5 országspecifikus genetikai vonal létezett, és tartott fenn endémiákat. Csak Bulgárián belül legalább két ilyen, több évtizedet megélő vonal is létrejött, ezen kívül azonban magyar, olasz és orosz eredetű behurcolások is voltak. c) Az endémiás vonalak distance-analízise alapján arra a következtetésre jutottam, hogy az ezek őséül szolgáló alapító vírus betelepedése Európába a XIX. századig vezethető vissza. d) Kimutattam, hogy a VI. genotípusnak már a 70-es években két nagy ága létezett: az ázsiai és az afrikai, amelyeknek törzsei Bulgáriában már akkor előfordultak. 2) Régi vírustörzsek genetikai azonosításával egy korai csalásra, egy referenciatörzs elcserélésére és egy újabb, természetes csökkent virulenciájú törzs létezésére derült fény. a) Megállapítottam, hogy az 1933-ban, Angliában izolált Herts 33(W)-jelű vírus az eddig ismert legeldivergáltabb és új genotípus egyetlen ránk maradt relikviája. Egy téves génbanki adat nyomán azonban eddig egy ismeretlen eredetű, IV. genotípusú törzs szekvenciája szerepelt ezen a néven. b) Valódi identitásának tisztázása lehetővé tette annak bizonyítását, hogy az 1940-es évek elején, Angliából útjára bocsátott (és rendkívül sikeres) H-vakcina nem lehetett a Herts 33(W) laboratóriumban attenuált változata, ahogy ezt leírták. Sőt a H-törzs a csak Ázsiában előfordult III. csoportba tartozik, annak egyetlen gyenge virulenciájú és természetes képviselője. Ennek fényében viszont (részben) meglepő, hogy a tőle független fejlesztésűnek tartott, indiai Mukteswar-jelű vakcinatörzs, megegyezik a H-val. 3) 60 reprezentatív NDV törzs mind a 6 génjének részleges szekvencia-analízisével a következő megállapításokra jutottunk.
8 a) Az egyes gének távolság- és karakter-alapú filogenetikai analízise kongruens génfákat eredményezett, azaz lényegében ugyanazokat a rokonsági viszonyokat tükrözték, mint amit az F gén részleges szekvencia analízisével korábban a témacsoport megállapított, amiből az a következtetés vonható le, hogy az NDV bármely génjének szinte bármely szakasza alkalmas ugyanazon rokonsági viszonyok reprodukálására. Az általam létrehozott adatbázis pedig ezt jelentősen megkönnyíti. b) Valamennyi gén vizsgálata alátámasztotta a Herts 33(W)-jelű genotípus valamikori előfordulását, és a class II-beli eddig hiányzó, primitív törzsekből álló (CA-12/63 által reprezentált) észak-amerikai ág létezését. c) Vizsgálataink csak részben támasztották alá azt a korábbi nézetet, miszerint az ND virion burkának nyúlványait alkotó két külső fehérje (F és HN) génje gyorsabban evolválódik mint a belső, immunszelekciónak ki nem tett fehérjéké, mivel az RNS-polimeráz-komplexben résztvevő foszfoprotein génje még az F génnél is nagyobb variabilitást mutatott. d) Ezek az eredmények egyúttal arra is utalnak, hogy a vizsgált génszakaszokat érintő rekombináció nem fordult elő. 4) A filogenetikai analízis és a rezervoárokban való előfordulás alapján a primer gazdák NDV-törzseinél egy mély divízió figyelhető meg, amely alapján a primitív (avirulens) vírusok két nagy csoportja jött létre: a class I és II. A class II-ben eddig 9 genotípus szintű elkülönülés létezik, amelyeknek mindegyikében találhatók csirkéből izolált, virulens járványtörzsek. Az 1960-as évektől talált újabb csoportokban (V.-VIII. genotípus), azonban már csak ilyenek, míg a régi csoportok közül 2-ben (I. és II. genotípusok) primitív (avirulens) vírusok is megtalálhatók. a) A vegyes előfordulás arra utal, hogy egymástól független kolonizáció révén kerültek csirkébe, majd itt váltak virulenssé. A H-törzs eredetének igazolása arra utal, hogy a III. csoport járványtörzsei is kolonizáció + virulenssé válás kétfázisú evolúciója révén jöttek létre. b) Azonban két indel-típusú filogenetikai jegy genotípusokban való megoszlása arra utal, hogy a virulens vonalak keletkezésének létezik egy másik, egyfázisú útja is: a virulens ősből kiinduló diverzifikáció. Az egyik indel, egy 6 nukleotidból álló inszerció (a nukleoprotein gén 5 nem kódoló szakaszában) kizárólag az újabb (V.-VIII.) csoportokban fordul elő, amelyeknek viszont nincsenek avirulens változatai. Az inszerció, ami szünapomorfiaként kezelhető, a 4 újabb genotípust egy monofiletikus szuper csoportba tereli. Filogenetikai megjelenésük egy populáció-szűkületet követő adaptív radiáció képét jeleníti meg. Megállapítottam, hogy a 6 nukleotid inszerció sem a régi [I.-IV. és
9 Herts 33(W)], sem a class I vírusok genomjában nem fordul elő, ezek tehát a pleziomorf állapotot képviselik, ami összhangban van azzal, hogy avirulensek, illetve ilyen őseik voltak. c) A class I vírusok foszfoprotein génjében azonban van egy 12 nukleotidból álló inszerció, ami miatt ezek genomja 15198 nukleotid számra nő, az ősinek tekinthető alapmérethez (15186) képest. Ezzel az NDV harmadik genom-méret kategóriáját írtuk le, amit teljes szekvencia-meghatározással is megerősítettünk. Mivel a jegy csak ezt a csoportot jellemzi, autapomorfiának minősíthető.
10 A szerző témában megjelent közleményei 1) Czeglédi, A., Herczeg, J., Hadjiev, G., Doumanova, L., Wehmann, E., Lomniczi, B., 2002. The occurrence of five major Newcastle disease virus genotypes (II, IV, V, VI and VIIb) in Bulgaria between 1959 and 1996. Epidemiology and Infection 129, 679-688. 2) Wehmann, E., Czeglédi, A., Werner, O., Kaleta, E.F., Lomniczi, B., 2003. Occurrence of genotypes IV, V, VI and VIIa in Newcastle disease outbreaks in Germany between 1939 and 1995. Avian Pathology 32, 157-163. 3) Czeglédi, A., Wehmann, E., Lomniczi, B., 2003. On the origins and relationships of Newcastle disease virus vaccine strains Hertfordshire and Mukteswar, and virulent strain Herts 33. Avian Pathology 32, 271-276. 4) Lomniczi, B., Czeglédi, A., 2005. A baromfipestis története 1. Az NDV molekuláris epidemiológiája és evolúciója. Magyar Állatorvosok Lapja 127, 707-719. 5) Czeglédi, A., Ujvári, D., Somogyi, E., Wehmann, E., Werner, O., Lomniczi, B., 2006. Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1 (Newcastle disease virus) and evolutionary implications. Virus Research 120, 36-48.