Aerobic catabolism of sugars Az alkoholos erjedés mikrobiológiája Dr. Magyar Ildikó glucose glycolysis NAD NADH2 Text pyruvic acid CO2 Tricarboxylic acid cycle TCA CO2 4 x NAD 10 x NADH2 Terminal oxidation chain Borászati Szervezeti Tanszék egység Dr.Magyar Ildikó 6 x O 2 6 x H 2 O 34 x Alcoholic fermentation ethanol acetaldehyde glucose NAD NADH2 CO2 Az alkoholos erjedést befolyásoló tényezők szőlőmustban glycolysis Text pyruvic acid x TCA O 2 NAD NADH2 Terminal oxidation chain Alcoholic fermentation Supplies low amount of energy (2 ) also under anaerobic conditions Élesztők endogén élesztő biota szelektált fajélesztők (starterkultúrák) Környezeti tényezők hőmérséklet tápanyagok gátlóanyagok 1
Typical patterns of alcoholic fermentation Fajélesztők (élesztő starterkultúrák) a borászatban lg N / v/v % Spontaneous fermentation non-sacch. Sacch. Ethanol 13 11 9 7 5 3 1 0 5 10 15 Time (days) lg N / v/v % Inoculated fermentation non-sacch. Sacch. Ethanol 13 11 9 7 5 3 1 0 5 10 15 Time (days) Borászati törzsszelekció A 19 század végétől kezdve minden jelentősebb bortermelő ország létrehozta saját helyi törzsgyüjteményét (Saccharomyces cerevisiae különböző fiziológiai változatainak izolálása, jellemzése és szelektálása) Kereskedelmi forgalmazás folyékony kultúrák 1960-as évektől : aktív szárított élesztő készítmények (ADY) Törzsfejlesztési kutatások természetes nemesítési módszerek előnyben! Borászati fajélesztőkkel szemben támasztott általános követelmények jó alkoholtűrés megfelelő erjedési sebesség 20 o C alatt kis H 2 S képzés kis ecetsav képzés kis acetaldehid termelés kevés habképzés jó ülepedés jó kén-dioxid tűrés alacsony karbamid képzés (arginin bontás) Egyes starterkultúrák speciális tulajdonságai kiemelkedő cukortűrés túlérett szőlő, aszú mustjának erjesztése jó almasavbontó képesség (malo-alkoholos aktivitás) savas mustok savharmóniájánaj javítása, MLF elősegítése -glikozidáz aktivitás terpén-alkoholok felszabadítása (elsődleges aromaanyagok) különleges aromaanyagok képzése észterek, egyes kéntartalmú aromaanyagok (pl. Sauvignon) killer aktivitás jobb versenyzés az eredeti S. cerevisiae törzsekkel szemben flokkuláció jó ülepedés-csomósodás (pezsgőerjesztés) hártyaképző képesség biológiai borérleléshez 2
hőmérséklet tápanyagok gátló anyagok Környezeti tényezők Hőmérséklet Erjedéskinetikára gyakorolt hatás Felső határ mustban : 35-37 o C Alsó határ: 6-8 o C S. cerevisiae 2 o C S. bayanus (kriotoleráns élesztő) Maximális erjedési sebesség: 30-35 o C de az etanol és C8-C12 zsírsavak toxicitása nő!- gyors pusztulás A borösszetételre gyakorolt hatás magas hőmérsékleten intenzív gázképződés, aromaveszteség (terpenolok, észterek etc.) több glicerin, acetoin és magasabbrendű alkohol képződik Az erjedési hőmérséklet borászati optimuma illatos, fehér szőlőfajták: 10-16 o C nem illatos fehér fajták, rozéborok : 18-22 o C vörösborok: 25-28 o C Hőmérséklet Cukor (glükóz és fruktóz) Tápanyagok kizárólagos szénforrás az erjedés során mindig nagy feleslegben van jelen a szőlőmustban» 150 g/l - 300 g/l nagy cukorkoncentráció hatása: szaporodásgátlás gyors sejtpusztulás (alkohol toxicitása nő) ecetsavtermelés fokozódik glicerintermelés fokozódik elakadó erjedés, alacsony alkohol, maradék cukor a borban 3
Nitrogén szaporodáshoz szükséges minimum:150 mg/l kénhidrogén képződés kockázata: <250 mg/l optimális szint: 400-500 mg/l Asszimilálható N-frakciók a mustban ammóniumsók szabad aminosavak és amidjaik- kivétel a prolin! Polipeptidek, fehérjék nem asszimilálhatók! Tápanyagok A szőlőmust nitrogén frakciói Nitrogénforrás mg/l N Megjegyzés Összes N 300-2500 Ammónium-N 20-200 Jól hasznosítható Szabad amino-n 200-500 Prolin kivételével általában hasznosítható Peptid-N 50-1500 Elenyésző hányada hasznosítható (di-és tripeptidek) Fehérje-N 5-50 Nem hasznosítható Asszimilálható nitrogéntartalom különböző szőlőfajták mustjában, azonos termőhelyen (NY) (Henick-Kling, 1996) Grape variety Free NH 3 (mg/l) Free amino N (mg/l) except proline n from - to mean from - to mean Chardonnay 13 29-87 46 116-231 151 Riesling 9 39-61 52 62-128 102 Seyval Blanc 6 9-42 19 47-136 82 Pinot Noir 7 38-60 52 94-185 135 Cabernet Sauvignon 5 46-51 49 73-74 74 A nitrogénhiány következményei Fehérjeszintézis megszűnik szaporodás leáll enzimfehérjék elhasználódnak (pl. glükóz transzport átvivői) - erjedés lelassul, majd megáll az erjedés elakad H 2 S képzés fokozódik kéntartalmú aminosavak szintézise megszűnik, de a szulfát redukció tovább folytatódik 4
Tápanyag pótlás lehetőségei (magyar BT) ammóniumsók adagolása Nitrogén diammónium-foszfát v. ammónium foszfát v. ammónium tartarát: 30 g/hl-ig ammónium szulfit vagy biszulfit 20 g/hl-ig inaktív élesztő, élesztőkivonat 50 g/hl-ig (Pl. Ferm-aid, Uvavital, stb.) N-hiányos mustokban kerüljük az éles musttisztítást! Effect of diammonium phosphate supplementation (63 mg N/l) on fermentation of a chemically-defined grape juice medium. Arrows indicate timing of supplement (Bely et al. 1990). A, yeast growth B, fermentation rate Vitaminok hiány csak botrítiszes mustokban fordul elő tiamin (TP) ketosavak felszaporodása (piroszőlősav, 2- ketoglutársav) - a bor kénessav megkötő kapacitása nő biotin, piridoxin N-hiányban fokozza a H 2 S képződést Nutrients Oxigén az alkoholos fermentáció nem igényel oxigént! az élesztők telítettlen zsírsavakat és szterineket csak O 2 jelenlétében képesek szintetizálni (ergoszterin, zimoszterin, lanoszterin) növekedési és túlélési faktorok Szterinek - túlélési faktorok fontos sejtmembrán alkotók, a sejt alkohol-toleranciáját biztosítják oxigén hiányában nem képződnek - az utódsejtekben egyre csökken a mennyiségük az alkoholtolerancia leromlik, a sejtek gyorsan pusztulnak, az erjedés elhúzódik vagy elakadhat 5
Túlélési faktorok (telítetlen zsírsavak és szterinek) biztosításának lehetőségei Nagy tartalékokkal rendelkező fajélesztők használata: szárított élesztő készítmények levegőztetett folyékony anyaélesztő kultúra A must erjedés előtti hiperoxidációja A túlzott musttisztítás kerülése (szilárd részecskéken adszorbeált levegő!) Túlélési faktorok bevitele adalék-anyagokkal élesztő héj (sejtfal készítmény) szerves erjedési aktivátorok (élesztőkivonatok) Elhúzódó, elakadó erjedésnél levegőztetés Gátló anyagok peremetezőszer maradvány nem megfelelő növényvédelem derítéssel, adszorbensekkel eltávolítható kén-dioxid antioxidáns és antimikróbás hatású adalékanyag élesztők viszonylag jól tolerálják normal adagolás (50-75 mg/l) az erjedés előtt a borélesztőket nem befolyásolja jelentős hatás csak 200 mg/l felett kiemelkedő kénessav tűrésű fajok: Schizosaccharomyces pombe, Saccharomycodes ludvigii penészgombás eredetű botrítiszes glükánok (Botryticin) élesztős eredetű etanol és egyéb alkoholok közepes szénláncú (C8-C12) telített zsírsavak killer toxinok baktérium eredetű ecetsav antibiotikumok Gátló anyagok Az alkoholos erjedés rendellenességei szőlőmustban Vontatottan beinduló erjedés Az erjedés elhúzódása és elakadása Hibás erjedések 6
1. Vontatottan beinduló erjedés okai alacsony hőmérséklet (15 o C alatt) hidegtűrő fajélesztők alkalmazása starterkultúra adaptálása az erjesztés hőmérsékletéhez erjesztőképes élesztők kis száma (< 10 4 / cm 3 ) fajélesztős beoltás: induló sejtszám kb. 10 6 sejt/ml alacsony ph érték (< 3) kémiai savtompítás peszticid maradvány a mustban bentonitos mustülepítés túlkénezett must 2. Az erjedés elhuzódásának és elakadásának okai tápanyaghiány:n-tartalmu anyagok,vitaminok (tiamin, biotin) éretlen/penészes v. túltisztitott must! nagy cukortartalom (200 g/l felett) -a w, alkohol magas erjedési hőmérséklet (30 o C felett) --- alkohol oxigénhiány --- szterolok, telitetlen zsirsavak hiánya toxikus élesztő-metabolitok: oktán-, dekán-, dodekánsav killer élesztők egyéb mikróbás antagonizmusok: Botrytis, ecetsavbaktériumok, tejsavbaktériumok 3. Hibás erjedések Káros vadélesztők Scizosaccharomyces Saccharomycodes Brettanomyces (Kloeckera) Tejsavbaktériumok 7