Fehérje meghatározás Western blottal Dr. Sziksz Erna
Western blot / Protein immunblot Western blot: széleskörűen használt szemi-kvantitatív analitikai technika fehérjék meghatározására molekuláris biológia, biokémia, immungenetika Southern blot: DNS meghatározás Northern blot: RNS meghatározás Eastern blot: módosított fehérjék meghatározása Minta: szöveti homogenizátum vagy sejtextraktum Natív vagy denaturált fehérjék elválasztása: gélelektroforézis Transzfer: nitrocellulóz vagy PVDF membránra Detektáció: célfehérjére specifikus antitesttel
Minta előkészítés Minták: teljes szövet vagy sejtkultúra Szöveti homogenizálás: homogenizátorral, szonikátorral, vagy nagy nyomáson történő centrifugálással Lízis: lízis pufferrel, mely tartalmaz: különböző detergensek, sók és pufferek a sejtek lizálásához és a fehérjék szolubilizálásához proteáz és foszfatáz inhibitorok a minta degradálódásának elkerüléséhez Dounce homogenizátor Szöveti homogenizátor Szonikátor
A lízispuffer összetétele Tris-HCl: puffer Triton-X 100 vagy Nonidet P-40: detergensek NaF és Na 3 VO 4 : foszfatáz inhibitorok EDTA vagy EGTA: pufferek phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF): szerin-proteáz inhibitor proteáz inhibitorok: aprotinin, leupeptin, pepstatin
Sejt frakcionálás Centrifugálás nagy sebességgel (12-15.000 g, 10-15 min, 4 C) A felülúszókat (teljes sejt lizátum) -80 C-on tartjuk A különböző sejtalkotók, sejtorganellumok is elválaszthatóak (citoszól, mitokondriális, nukleáris vagy membránfrakció) Fehérjekoncentráció meghatározása: Bradford módszer BSA standard sor spektrofotométer (595 nm)
Gélelektroforézis Fehérjék elválasztása: izoelektromos pont (pi) szerint molekulasúly szerint elektromos töltés szerint A szeparáció fajtája függ: a minták előkészítésétől a gél típusától SDS-PAGE: Fehérjék elválasztása elektroforetikus mobilitásuk alapján a minták az SDS kötődésével a tömegükkel arányos töltést kapnak elválasztás kizárólag méret alapján
A lizált fehérjeminták előkészítése A Laemmli reagens általános összetétele: Sodium(Na) dodecil szulfát (SDS): anionos detergens, amely a fehérjéket a tömegükkel arányosan negatív töltéssel látja el Ditiotreitol (DTT) vagy 2-merkaptoetanol: redukálószer, amely a diszulfid hidak felbontásával denaturálja a fehérjéket Glicerol: tartósító- és ülepítőszer Brómfenolkék (BPB): jelzőfesték az elektroforézis nyomonkövetéséhez
SDS-PAGE Redukáló SDS-PAGE az SDS és a redukálószerek denaturált állapotban tartják a polipeptideket a fehérjék elektroforetikus mobilitását elsősorban molekulatömegük határozza meg a fehérjéket az SDS negatív töltéssel látja el, és a pozitív töltésű elektród felé vándorolnak Nem-redukáló vagy natív PAGE nincs forralás és redukálószerek az elektroforézis SDS nélkül zajlik az eredeti struktúra fontos a további vizsgálatokhoz a fehérjék elektroforetikus mobilitása nem csak a méretüktől, hanem a töltésüktől is függ
Akrilamid gélek készítése A gél összetevői: akrilamid és biszakrilamid: ezek a monomerek szabadgyökök jelenlétében keresztreagálnak egymással; az aktivált monomerek hosszú polimer láncokat alkotnak Tris-Cl: megfelelő ph-jú puffer SDS: minden fehérjének a tömegével arányos negatív töltést ad ammónium perszulfát (AMPER): szabadgyökök képzésével elindítja a polimerizációt tetrametil-etiléndiamin (TEMED): az akrilamid polimerizáció katalizátora Az akrilamid és biszakrilamid monomerek polimerizációja Egy poliakrilamid gél transzmissziós elektronmikroszkópos képe
Gél koncentrációk Szeparáló gél: alsó, magasabb (8-12%) poliakrilamid tartalommal Koncentráló gél: felső, alacsony (4-6%) poliakrilamid tartalommal Precast gélek: a gyártó által előre csomagolt gélek Az akrilamid koncentrációja határozza meg a gél felbontását: alacsony koncentrációjú gélek nagy molekulatömegű fehérjék szétválasztására magas koncentrációjú gélek kisebb fehérjék szétválasztására
Gélelektroforézis gél polimerizáció szeparáló (alsó) gél öntése vékony rétegben izopropanolt rétegzünk a szeparáló gél tetejére koncentráló (felső) gél öntése zsebek készítése fésűvel a minták és a marker betöltése a zsebekbe a futtatókád áramforráshoz kapcsolása, a kívánt futtatási körülmények beállítása (1-2 óra, 120V, 20 ma)
Gélelektroforézis A negatív töltésű fehérjék a pozitív (+) elektród (anód) felé vándorolnak A különböző méretű fehérjék másképp vándorolnak a gélmátrixban A fehérjék méretük/molekulatömegük szerint válnak szét A fehérjék különböző elektroforetikus mobilitásuknak megfelelően oszloponként vízszintes csíkokban szeparálódnak Electrophoretic apparatus
A poliakrilamid gélek festése Coomassie Brilliant Blue (CBB): a legelterjedtebb fehérje festék nem specifikusan köti a fehérjéket a fehérjéket ecetsavval fixáljuk Ezüst festés: széleskörűen használt technika a CBB festésnél érzékenyebb Coomassie Brilliant Blue festés Ezüst festés
Más gyakran használt elektroforetikus eljárások Két dimenziós (2D) gélelektroforézis: a fehérjék elválasztása az 1. dimenzióban izoelektromos pont, a 2. dimenzióban molekulatömeg szerint történik Kapilláris elektroforézis (CE): ionos állapotú fehérjék elválasztása méretük szerinti töltés alapján egy elektrolittal töltött vékony kapillárisban Hőmérséklet Gradiens Gél Elektroforézis (TGGE) és Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE): olyan elektroforetikus eljárások, melyek vagy hőmérsékleti, vagy a kémiai gradiens létrehozásával denaturálják a mintát, miközben az egy akrilamid gélben fut
Western blot: fehérje transzfer Elektroblotting: A fehérjék átblottolása az akrilamid gélből PVDF vagy nitrocellulóz membránra elektromos áram segítségével (2 óra, 70V, 220 ma hűtött rendszerben) A fehérjék a gélből a membránra kerülnek, miközben megtartják szerkezetüket A fehérjék a membrán egy vékony felszíni rétegén detektálhatóak A fehérjék hidrofób és ionos kötésekkel kapcsolódnak a membránhoz
A fehérje transzfer sikerességének ellenőrzése A membrán festése Coomassie Brilliant Blue vagy Ponceau S festékkel Ponceau S: gyakrabban használt, nagyobb érzékenység és vízoldékonyság Western blot készülék Ponceau S festés
A blotok blokkolása A blokkolás a célfehérje kimutatásához használt antitest aspecifikus kötődését gátolja a membránhoz A membránt általában TBS-TWEEN pufferben oldott 1-5% Bovine serum albumin (BSA) vagy zsírszegény tejpor oldatában inkubáljuk TBS-TWEEN: Tris-Buffered Saline (TBS) kismennyiségű detergenssel (Tween 20 vagy Triton X-100) A BSA vagy tejpor leköti az aspecifikus kötőhelyeket a membránon
A célfehérjék detektálása Elsődleges antitest Specifikus a célfehérjét tartalmazó fajra Inkubálás: az 1. antitest oldatában Oldat: TBS-TWEEN pufferben oldott tejpor vagy BSA Inkubációs körülmények: enyhe rázatás Inkubációs idő: 30 perc - overnight Inkubációs hőmérséklet: eltérő (4 C - 25 C) Másodlagos antitest Specifikus az elsődleges antitestre Biotinnal vagy riporter enzimmel (pl. HRP) kapcsolt Inkubálás: a 2. antitest oldatában Oldat: TBS-TWEEN pufferben oldott tejpor vagy BSA Inkubációs körülmények: enyhe rázatás Inkubációs idő: 30 perc - 2 óra
A célfehérjék detektálása Kemilumineszcens előhívás: A 2. antitestre kapcsolt tormaperoxidáz hasítja a kemilumineszcens szubsztrátot A reakcióból származó termék a célfehérje mennyiségével arányos kemilumineszcens jelet ad Fotografikus filmet helyezünk a membránra A blothoz kötődött antitestek kemilumineszcens fényjele képet hoz létre a filmen Újabban CCD kamerákkal készítenek digitális felvételt a blotokról
A célfehérjék detektálása Egyéb alkalmazások Kolorimetrikus detektáció: a 2. antitesthez kapcsolt enzim egy szubsztrát molekulát hasít, amely színes reakcióterméket képez Fluoreszcens detektáció: a 2. antitesthez a közeli infravörös tartományban jelet adó fluorofórt kapcsolnak Autoradiográfia: a 2. antitesthez radioaktív izotópot kapcsolnak Fluoreszcens detektáció Detektációs kazetta autoradfiográfiához/ kemilumineszcens detektációhoz
Qdot technológia: kimutatás a 2. ea biotinjához kapcsolódó sztreptavidin Qdot-biokonjugátummal A célfehérjék detektálása Quantum dot (Qdot) nanokristály technológia Qdot nanokristály: a fluoreszcenciához hasonló, de más fizikai hátterű fénykibocsátásra alkalmas félvezető anyag a Qdot mérete szabja meg a kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete Előnyök: a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében használható nincsenek átfedő spektrumok egyetlen gerjesztő fényforrás elegendő hosszú életidejű jel és stabilitás: hosszú távú vizsgálatok időbeli nyomonkövetésére alkalmas
A Western blotok kiértékelése A jelölt csíkok összevetése a markerrel Az eljárás kontrollja egy strukturális fehérje, mint az aktin vagy a tubulin A képeket denzitometriával értékeljük ki A legújabb szoftverek az adatok további értékelésére adnak lehetőséget (pl. molekulasúly analízis)
Másodlagos próba A nitrocellulóz és a PVDF membránok strippelhetőek A membrán újra felhasználhatóvá válik további antitest próbák számára A stripping puffer eltávolítja az 1. és 2. antitesteket a blotokról A fehérjeveszteség csökkentése érdekében erősen ajánlott a PVDF membránok használata nitrocellulóz helyett Egy Western blot membrán újrafelhasználása
Western blot problémák megoldása Pöttyök a filmen (hiányzó csíkok): a légbuborékok miatt a transzfer nem volt kellően hatékony a film szennyezett volt az előhíváskor Túl sok csík a bloton: gyakran aspecifikus kötődést jelent rossz vagy régi volt az 1. antitest nem tartott elég ideig a blokkolás a célfehérje proteolitikus hasításon ment át Nagy háttér; alacsony jel-zaj arány a bloton: fekete vagy eleve sötét film; túl hosszú exponálás a blokkolás nem volt megfelelő; az 1. antitest aspecifikusan kötődött, és a 2. antitest nem volt megfelelően lemosva nem megfelelő mosási lépések a film világít a sötétben az 1. vagy 2. antitest hígítása nem megfelelő
Western blot problémák megoldása Nincs vagy gyenge a jel: nem volt elég fehérje loadolva a gélre rossz vagy régi volt az 1. antitest a foszfoproteinek gyakran overnight inkubálást igényelnek az 1. antitesttel kevés volt a 2. antitest túlblokkolás az előhívó reagensek rosszak / hiba történt az összeállításukkor Elkenődött vagy életlen csíkok a csíkok elmaszatolódtak a felmelegedett gélben: a feszültség vagy az áramerősség csökkentése, futtatás hidegszobában, új futtatópuffer készítése a csíkok súlyzó alakúak a túl magas feszültség miatt: a blotmembrán előzetes beáztatása transzfer pufferbe A következő weboldalon további WB hibák és megoldásuk találhatóak: http://openwetware.org/wiki/griffin:western_blot_optimization
A Western blot technika használhatósága Előnyök: alkalmas szövetből, sejtkultúrából egy adott fehérje szemi-kvantitativ meghatározására kvantitativvá denzitometriás értékelés során tehető az egyes minták között összehasonlitható a vizsgált fehérje mennyisége akár vizuális úton is a fehérjék a membránon koncentrálódnak, ami kimutatási lehetőségüket növeli a membránra kitett fehérjék gyorsan és reverzibilisen festhetőek Hátrányok: a fehérjék méretüktől és bázikusságuktól függően eltérő hatékonysággal vihetők fel a membránra az antitestet a fehérje natív alakja ellen termeltették, viszont a denaturált és redukált körülmények között az antitest nem mindig képes megfelelően kötődni a vizsgálandó fehérjéhez a szövet, sejtkultúra valamennyi sejtje benne lesz a lizátumban, nem kapunk információt arról, hogy pontosan melyik szöveti sejt expresszálta a vizsgált fehérjét, és arról sem, hogy az egyes sejtekben milyen intenziv a fehérje expressziója több napos, sok hibalehetőséget rejtő, komplex eljárás, nagy anyagigénnyel/költséggel