Gyors-kinetikai módszerek Biofizika 2009. november 26. Dudás Réka Gyorskinetika - mozgástan Reakciókinetika: reakciók időbeli leírása reakciómechanizmusok reakciódinamika (molekuláris szintű történés) Egy reakció előrehaladottságának mértéke: reakcióextenzitás: ξ (extent of reaction; magyarul néha reakciókoordináta ) sztöchiometriai együttható reakciósebesség: mólszám térfogat Sebességi törvény Reakciósebesség koncentráció-függése Reakciósebesség függ: résztvevő anyagok minősége koncentrációk hőmérséklet katalizátor / inhibitor reakciórendek (Nem sztöchiometriai együtthatók!) a+b: bruttó reakciórend Folyamatok rendűsége és a molekularitás kapcsolata Molekularitás 0. 1. sebességi állandó kiindulási anyag koncentrációja termék(ek) koncentrációja Unimolekulás reakció: egyetlen molekula átalakulása. Bimolekulás reakció: két molekula átalakulása azok ütközése útján. Trimolekulás reakció: ritka, mert több molekulának kell ütköznie. ELEMI REAKCI ELEMI REAKCIÓK nem bonthatók egyszerűbb lépésekre. Elemi reakciók rendűségét a reakció molekularitása határozza meg. 2. 1
http://hu.wikipedia.org/wiki/reakci%c3%b3sebess%c3%a9g http://hu.wikipedia.org/wiki/reakci%c3%b3sebess%c3%a9g Nulladrendű reakció pl. enzimkatalízis (ha az enzim koncentrációja kicsi) - NEM elemi reakció!!! A B vagy A B + C Elsőrendű reakció 1. t 1/2 2. t 1/2 3. t 1/2 A komponensek koncentrációja lineárisan változik az idő függvényében. A komponensek koncentrációja exponenciálisan változik az idő függvényében. http://hu.wikipedia.org/wiki/reakci%c3%b3sebess%c3%a9g Másodrendű reakció 2A B (vagy A + B C) Összetett reakciók = reakciómechanizmusok Sorozatos kémiai reakciók: sebességmeghatározó lépés: B C sebességmeghatározó lépés: A B Párhuzamos kémiai reakciók: Egyensúlyi állandó: A komponensek koncentrációja hiperbola függvény szerint változik idő függvényében. Egyensúlyi kémiai reakciók: Az eredményes ütközéshez a molekuláknak aktív állapotba kell jutni, többletenergiával kell rendelkezni. Energetika Gyorskinetikai módszerek jelentősége biológiai mechanizmusok megértése biológiai folyamatok időskálája millisecundum skálán történő mérések gyorskinetikai módszerek időfelbontása: A küszöbenergia és az átlagos energia közötti különbség az aktiválási energia. 10 0 10-3 10-6 10-9 10-12 s ms μs ns ps lombik reakció stopped flow villanófény fotolízis egyfoton-számlálás Keszei Ernő előadása alapján 2
Gyorskinetikai módszerek Stopped-flow (megállított áramlású reaktor) Surface Plasmon Resonance Flash Photolysis (villanófény fotolízis) Photon Counting (foton-számlálás) Stopped-flow Megállított áramlású reaktor 0. Betöltés 1. Keverés cella keverő stop A B 1. Keverés 1. Keverés 3
1. Keverés 2. Az áramlás megállítása t = o STOP! 3. kinetikai mérés Holtidő fluoreszcencia v. szórás abszorpció A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdete között eltelt idő. 0,5 1 ms. Forrás: Applied Photophysics Holtidő Holtidő 4
Stopped-flow alkalmazása Mért jel kötődési- és disszociációs kinetika vizsgálata fehérje-fehérje, illetve fehérje-ligandum kölcsönhatás esetén. K D : disszociációs állandó spektroszkópiai jel változzon a reakció során! fluoreszcencia intenzitás (v. anizotrópia) fényszórás abszorpció K D = [ A][ B] [ AB] párhuzamos detektálás! detektor: PMT merőleges detektálás! Villanófény-fotolízis Rövid élettartamú részecskék reakcióinak nyomon követésére. http://www.photophysics.com/images/rx2000/rx2k_da.jpg Caged molekula: ketrecbe zárva, kémiai kötéssel inaktiválva. Nagy fényintenzitás hatására kiszabadul (az inaktiváló kémiai kötés felbomlik) ekkor indul a folyamat. Előnye: A és B molekula már egymás mellett van (keverés nem vesz el időt). Csak akkor indul a folyamat, amikor meglőjük fénnyel. Detektálva a fényt, megmondható a spektroszkópiás mérés nulla időpontja. http://itszotar.hu/?q=1663 Felületi plazmon rezonancia (SPR) Felületi plazmonok Fémek felületén egy speciális fénysugárral hullámszerű mozgásra kényszerített elektronok. Hullámhossza rövidebb a gerjesztő fényénél. Távoli tér: megvilágított tárgyról visszaverődő fény segítségével megfigyelhetjük a tárgyat, mikroszkópon vagy távcsövön keresztül. A fényhullámok elektromos és mágneses tere azonos nagyságú és kölcsönösen függ egymástól. Közeli tér: A fény azon komponense, ami a felülethez ragad A mágneses komponens gyenge az elektromoshoz képest (nem lép fel diffrakció, sem interferencia). 5
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/78/spr-schema.png Plazmon létrehozása Kretchmann konfiguráció Diszperziós összefüggés: a plazmonok energiája és hullámhossza (impulzusa) közötti kapcsolatot írja le. Hatékony gerjesztés: ha a két hullámhossz vagy annak reciproka, az impulzus egyezik (impulzusmegmaradási törvény). Az üvegekben a fény hullámhossza rövidebb, mint a levegőben. Az impulzus nagyobb. Megfelelően választott szög alatt beeső fény impulzusának a felületen lévő vetülete megegyezhet a fotonéval azonos energiájú felületi plazmon impulzusával. Ennek a feltételnek úgy tehetünk eleget, hogy üvegprizmára párolunk fémréteget, és azt a prizma oldaláról világítjuk meg. Teljes visszaverődés a prizma-levegő határfelületen, de a felület levegő felőli oldalához hozzátapadva és attól távolodva exponenciálisan csökkenő térerősséggel megjelenik a közeli tér. fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg fényforrás Az alapelv polarizált fény visszavert fény detektor B partner A partner A rezonancia feltétele Az alapelv A gerjesztő fény impulzusának felülettel párhuzamos komponense meg kell egyezzen az azonos energiájú felületi plazmon impulzusával. A gerjesztés a fény egy adott beesési szögénél történik meg és ilyenkor a fém felületről visszavert fény intenzitásában egy minimum észlelhető (abszorpció!). fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg E polarizált fény visszavert fény elhajlás (csökkenés) az intenzitásban! A detektálás A szenzogram a jel eredete A rezonanciának megfelelő beesési szög értéke érzékenyen függ a másik közeg (prizma) törésmutatójától. A bekötődés megváltoztatja a felülettel érintkező réteg törésmutatóját rezonancia szög eltolódás érzékeny detektálás. Analitikai és kinetikai információ: rezonancia szög időbeli változása. Tranzisztor optikai analógja a fény gyorsabb az elektronok mozgásánál nagyobb sebesség! fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg polarizált fény visszavert fény I. II. A kötés megváltoztatja a visszaverődés szögét. 6
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3d/spr-curve.png Alkalmazási területek Ellenanyag antigén DNS hibridizáció Protein protein Receptor biomolekula kölcsönhatások Kinetikai állandók és molekuláris kölcsönhatások specificitásának meghatározása Nyomanalitikai meghatározások Spektroszkópos mérések felületi érzékenységének növelése: fluoreszcencia, Raman-szórás. Affinitás meghatározása Kötési állandó meghatározása A termék egyensúlyi állandója: asszociációs állandó / disszociációs állandó. csali ligand rákötése a felszínre préda ligand injektálása préda köt a csalihoz SPR jel növekszik. Asszociáció után: Prédamentes oldat injektálása disszociáció SPR jel csökken. Asszociációs és disszociációs ráta kötési állandó Időkorrelált egyfotonszámlálás TCSPC Time Correlated Single Photon Counting Time Correlated Single Photon Counting Jelmagyarázat PMT: photomultiplier tube MCP PMT: micro channel plate PMT TAC: time to amplitude converter CFD: constant fraction discriminator Fast discriminator (FD) Fényforrás (Lézer) foto elektron sokszorozó (cső) idő amplitúdó átalakító konstans arányú diszkriminátor gyors diszkriminátor PMT Minta (emisszió) MCP PMT CFD vagy FD START TAC STOP MCA Forrás: NIST Single Photon Detector Workshop Time Correlated Single Photon Counting Gyors, nagy érzékenységű MCP PMT detektor MCP: multichannel plate a PMT előtt felgyorsítja az elektronokat érzékenyíti a detektort: akár egyetlen fotont is érzékel! PMT: photomultiplier tube fotoelektron-sokszorozó Faceplate Fotokatód Dual MCP Anód fotonton Elektron által kilökött elektronok fény elektromos jel fotoelektron ΔV ~ 300V ΔV ~ 3000V ΔV ~ 300V erősítés ~ 10 6 Time Correlated Single Photon Counting A fluoreszcencia intenzitásának folyamatos mérése helyett a gerjesztő és a detektált impulzus közötti időt mérjük. indító impulzus START PMT-ből származó impulzus STOP adatfeldolgozás időamplitúdó átalakító TAC U TAC sokcsatornás impulzusanalizátor MCA Idő(különbség) elektromos jel (amplitúdó) 7
gyakoriság Idő-amplitúdó átalakító (time to amplitude converter; TAC) U TAC csatornaszám (idő) start stop Ha nem jön STOP jel, akkor maxi-mális amplitúdójú TAC jelet kapunk! t A fluoreszcencia élettartama általában összemérhető a lézerimpulzus hosszával Dekonvolúció-t igényel! E(t): a lézerimpulzus és a készülék együttes profilja (rendszerfüggvény) F(t): a fluoreszcencia (valós) lecsengése L(t): a mért görbe (az előző kettő konvolúciója) t L( t) = E( t ) F( t t ) dt 0 MEM maximum enthropy method I(t) rendszerfüggvény E(t) Fluoreszcencia válaszfüggvény Fourier transzformáció L(t) t 8